CN108191924A - 一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法 - Google Patents

一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，所述方法至少包括如下步骤：(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1.5‑5天，然后干燥，并粉碎制成粉末状对虾壳，备用；(2)浸提：将所述粉末状对虾壳在碱性浸提液中浸提，然后过滤并浓缩，得浓缩液；(3)酶解：将所述浓缩液的pH调节为8‑9，随后向其中加入胰蛋白酶，在50‑60℃下酶解1‑3h后，升温灭活；然后将所述浓缩液的pH调节为6‑7，随后向其中加入木瓜蛋白酶，在35‑45℃下酶解1‑3h后，升温灭活，得含所述硫酸软骨素的酶解液。本发明所述方法从对虾壳提取硫酸软骨素，具有原料资源丰富，提取成本低、效率高、纯度高和质量好等优点。

Description

一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法
技术领域
本发明涉及一种提取硫酸软骨素的方法，具体涉及一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法。
背景技术
硫酸软骨素是一种没有气味、白色或者类白色、微带纤维的粉末状固体。它是以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖为基本单位组成的二塘聚合体，能通过一个非糖连接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。硫酸软骨素多糖主链结构较简单，但糖链的长度不均一，侧链的分布呈现高度差异性，具有多种异构体。硫酸软骨素的这些结构特征决定着其功能的特异性以及其与多种蛋白质分子的互相作用，在生物体内存在着不可替代的作用。硫酸软骨素通常用于关节痛、风湿以及类风湿和高脂血症等治疗。市场需求很大。
其中，硫酸软骨素的结构如下：
硫酸软骨素的来源总体分为两类：一是动物组织，如鲨鱼、牛、羊、家禽的气管、软骨组织，多来源于屠宰车间；另外是通过微生物发酵。但是这两种来源都存在明显的缺陷：第一、上述动物组织产量有限，从而限制硫酸软骨素/硫酸皮肤素的产量；第二、疯牛病的爆发以及动物屠宰后组织器官处理环境的不合格严重影响人类对动物源硫酸软骨素/硫酸皮肤素的使用；第三、通过微生物发酵产生的硫酸软骨素/硫酸皮肤素分子量(长度)难把握，尤其重要的是，容易存在内毒素，直接限制其下一步应用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，用以解决上述问题。
为实现上述目的，本发明所述的从对虾壳提取硫酸软骨素的方法至少包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1.5-5天，然后干燥，并粉碎制成粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：将所述粉末状对虾壳在碱性浸提液中浸提，然后过滤并浓缩得浓缩液；
(3)酶解：将所述浓缩液的pH调节为8-9，随后向其中加入胰蛋白酶，在50-60℃下酶解1-3h后，升温灭活；然后将所述浓缩液的pH调节为6-7，随后向其中加入木瓜蛋白酶溶液，在35-45℃下酶解1-3h后，升温灭活，得含所述硫酸软骨素的酶解液。
本发明所用的对虾壳可来自新鲜、活的对虾，用清水清洗2-3遍后把它们的肉与壳分别分开后，即得对虾壳。
优选地，步骤(1)中，所述浸泡具体为：将对虾壳在2-7℃(优选4℃)下在丙酮溶液中密封浸泡0.5-2天，然后取出并用蒸馏水冲刷干净，然后再将对虾壳在2-7℃(优选4℃)下在丙酮溶液中密封浸泡1-3天。所述丙酮的用量可以为淹没所述对虾壳即可。该浸泡步骤能够脱水便于制成干粉、去掉脂类等杂质、除去苯类等有毒物质、破坏细胞结构利于硫酸软骨素的提取，并且具有清洗作用可彻底去除对虾壳表面的杂质，以利于后续的浸提步骤。
在本发明的一个实施方案中，将浸泡后的对虾壳离心，以去除丙酮，然后将对虾壳自然干燥，或放入鼓风干燥箱中，调节温度为60-80℃，干燥6-8小时。
在本发明的另一个实施方案中，将干燥后的对虾壳用高速粉碎机粉碎成粉末状对虾壳。优选地，所述粉末状对虾壳的粒径为50-200目。在该粒径下，能够使对虾壳中的硫酸软骨素被快速地浸提出来。
优选地，步骤(2)中，所述碱性浸提液为体积比为1:1-3的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；所述氢氧化钠水溶液和所述氯化钠水溶液的浓度分别为1.8％-2.2％和1.8％-2.2％。该碱性浸提液能够打断硫酸软骨素与蛋白质的糖-肽键连接，可显著提高硫酸软骨素的提取率和质量。
所述碱性浸提液的用量可根据本领域普通技术知识确定，例如，在本发明的一个实施方案中，所述碱性浸提液相对于对虾壳的用量可以为15ml/g。
优选地，所述浸提在35-45℃(优选为40℃)下进行2-4次，每次30-40h(优选为36h)。
优选地，步骤(2)中，所述浓缩液的固含量为20％-30％。该浓缩液有利于后续的酶解的快速进行，能够以高效率完全提取硫酸软骨素并能保持硫酸软骨素结构的完整性。
在本发明的一个实施方案中，在进行所述浓缩前，将碱性浸提液用真空泵过滤；然后采用旋转蒸发仪在35-45℃(优选为40℃)下进行浓缩。
优选地，步骤(3)中，所述胰蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.0007-0.0022mg/mL，优选为0.001-0.002mg/mL；更优选地，所述胰蛋白酶以浓度为5-10u/ml(选为7-9u/ml，更优选为8u/ml)的溶液形式加入。采用该浓度和用量下的胰蛋白酶有利于水解蛋白质杂质，具有水解效率高、成本低的优点。
优选地，步骤(3)中，所述木瓜蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.0015-0.002mg/mL；优选所述木瓜蛋白酶以浓度为70-90u/ml(优选为75-85u/ml，更优选为80u/ml)的溶液形式加入。采用该浓度和用量下的木瓜蛋白酶有利于蛋白质杂质的进一步水解，具有去除蛋白质杂质彻底且成本低的优点。
本发明所述的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶可通过市售购得，优选在使用前，将胰蛋白酶和木瓜蛋白酶配制成溶液形式并在2-5℃下保存，例如可放置于4℃冰箱中备用。
优选地，步骤(3)中，采用冰醋酸和/或氢氧化钠粉末调节所述浓缩液的pH。
优选地，步骤(3)中，在所述胰蛋白酶酶解后以及在所述木瓜蛋白酶酶解后，分别将酶解后的浓缩液升温至75-85℃进行灭活。
优选地，本发明所述从对虾壳提取硫酸软骨素的方法还包括对所述酶解液进行提纯的步骤，所述提纯具体为：将所述酶解液加入到90-97％(优选为95％)乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为65-75％(优选为70％)，静置后(优选静置0.5-2h)，去除上清液，并冲洗脱水(优选使用无水乙醇冲洗脱水)，然后干燥，即得所述硫酸软骨素。
优选地，在提纯步骤中所述干燥可在55-65℃(优选为60℃)的真空干燥箱中进行20-30h(优选为24h)。
本发明所述方法制备得到的硫酸软骨素，通过红外光谱仪分析，其纯度可达90％以上。
作为本发明的一个优选的实施方案，本发明所述从对虾壳提取硫酸软骨素的方法包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡0.5-2天，然后取出并冲刷干净，然后再将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1-3天，然后干燥，并粉碎制成粒径为50-200目的粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：将所述粉末状对虾壳在碱性浸提液中，在35-45℃下浸提2-4次，每次30-40h；然后过滤并浓缩得固含量为20％-30％的浓缩液；其中，所述碱性浸提液为体积比为1:1.5-2.5的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；
(3)酶解：采用冰醋酸和/或氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为8-9，随后向其中加入浓度为7-9u/ml的胰蛋白酶溶液，在52-56℃下酶解1-3h后，升温灭活，其中，所述胰蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.001-0.002mg/mL；然后采用冰醋酸和/或氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为6-7，随后向其中加入浓度为75-85u/ml的木瓜蛋白酶溶液，在38-42℃下酶解1-3h后，升温灭活，其中，所述木瓜蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.0015-0.002mg/mL，得含所述硫酸软骨素的酶解液；
(4)纯化：将所述酶解液过滤，然后将其加入到93-97％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为67-73％，静置后，去除上清液，并冲洗脱水，然后干燥，即得所述硫酸软骨素。
本发明同时提供了通过上述从对虾壳提取硫酸软骨素的方法制备得到的硫酸软骨素。
本发明所述的从对虾壳提取硫酸软骨素的方法具有原料资源丰富，提取成本低、效率高和质量好等优点；并且提取得到的硫酸软骨素的纯度高达90％以上。
附图说明
图1为本发明实施例1所制得的硫酸软骨素的红外吸收光谱图；
图2为标准硫酸软骨素的红外吸收光谱。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例所使用的原料及设备均可通过市售购得或通过常规方法制备得到，例如，丙酮溶液、氢氧化钠、冰醋酸、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和乙醇可购自SIGMA公司。
实施例1
本实施例提供了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1天，然后取出并用蒸馏水冲刷，再将对虾壳在新的丙酮溶液中密封浸泡2天，然后离心去掉丙酮，将对虾壳放入温度为70℃的鼓风干燥箱中，干燥8小时，并将完全干燥的对虾壳用高速粉碎机制成粒径为100目的粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：取400g粉末状对虾壳，将其在3000ml碱性浸提液中，在40℃下浸提3次，每次36h；然后过滤并浓缩得固含量为25％的浓缩液；其中，所述碱性浸提液为体积比为1:2的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；所述氢氧化钠水溶液和所述氯化钠水溶液的浓度分别为2％和2％；
(3)酶解：采用冰醋酸和氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为8.5，随后向其中加入1.5ml浓度为8u/ml的胰蛋白酶溶液，在54℃下酶解2h后，升温灭活；然后用冰醋酸和氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为6.5，随后加入1.5ml浓度为80u/ml的木瓜蛋白酶溶液，在40℃下酶解2h后，升温灭活，然后，向其中加入少量活性炭，并使用真空泵过滤，得含所述硫酸软骨素的酶解液；
(4)纯化：将所述酶解液过滤，然后将其加入到95％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为70％，静置1h后，去除上清液，并无水乙醇冲洗脱水2次，然后置于60℃的真空干燥箱中干燥24h，得浅橘色粉末状硫酸软骨素73.83g。
其中，本实施例方法制得的硫酸软骨素的纯度为90％，提取率为18.45％。本实施例所制得的硫酸软骨素的红外吸收光谱如图1所示，其中，与图2标准硫酸软骨素的红外吸收光谱相比，两者高度相似，证明从对虾壳中提取的确实是硫酸软骨素。
实施例2
本实施例提供了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡0.5天，然后取出并用蒸馏水冲刷，然后再将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡3天，然后离心去掉丙酮，将对虾壳放入温度为70℃的鼓风干燥箱中，干燥8小时，并将完全干燥的对虾壳用高速粉碎机制成粒径为100目的粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：取400g粉末状对虾壳，将其在3000ml碱性浸提液中，在40℃下浸提2次，每次40h；然后过滤并浓缩得固含量为30％的浓缩液；其中，所述碱性浸提液为体积比为1:1.5的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；所述氢氧化钠水溶液和所述氯化钠水溶液的浓度分别为2％和2％；
(3)酶解：采用冰醋酸和氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为9，随后向其中加入1.5ml浓度为9u/ml的胰蛋白酶溶液，在52℃下酶解3h后，升温灭活；然后用冰醋酸和氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为7，随后向其中加入1.5ml浓度为85u/ml的木瓜蛋白酶溶液，在42℃下酶解1h后，升温灭活，然后，向其中加入少量活性炭，并使用真空泵过滤，得含所述硫酸软骨素的酶解液；
(4)纯化：将所述酶解液过滤，然后将其加入到93％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为67％，静置1h后，去除上清液，并无水乙醇冲洗脱水2次，然后置于60℃的真空干燥箱中干燥24h，得浅橘色粉末状硫酸软骨素66.85g。
其中，本实施例方法制得的硫酸软骨素的纯度为80％，提取率为16.71％。
实施例3
本实施例提供了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1天，然后取出并用蒸馏水冲刷，然后再将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1天，然后离心去掉丙酮，将对虾壳放入温度为70℃的鼓风干燥箱中，干燥8小时，并将完全干燥的对虾壳用高速粉碎机制成粒径为100目的粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：取400g粉末状对虾壳，将其在3000ml碱性浸提液中，在40℃下浸提4次，每次30h；然后过滤并浓缩得固含量为20％的浓缩液；其中，所述碱性浸提液为体积比为1:2.5的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；所述氢氧化钠水溶液和所述氯化钠水溶液的浓度分别为2％和2％；
(3)酶解：采用冰醋酸和氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为8，随后向其中加入1.5ml浓度为9u/ml的胰蛋白酶溶液，在56℃下酶解1h后，升温灭活；然后采用冰醋酸和氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为6，随后向其中加入1.5ml浓度为75u/ml的木瓜蛋白酶溶液，在38℃下酶解3h后，升温灭活，然后，向其中加入少量活性炭，并使用真空泵过滤，得含所述硫酸软骨素的酶解液；
(4)纯化：将所述酶解液过滤，然后将其加入到97％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为73％，静置1h后，去除上清液，并无水乙醇冲洗脱水2次，然后置于60℃的真空干燥箱中干燥24h，得浅橘色粉末状硫酸软骨素65.67g。
其中，本实施例方法制得的硫酸软骨素的纯度为85％，提取率为16.42％。
实施例4
本实施例提供了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1天，然后取出并用蒸馏水冲刷，然后再将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡3天，然后离心去掉丙酮，将对虾壳放入温度为70℃的鼓风干燥箱中，干燥8小时，并将完全干燥的对虾壳用高速粉碎机制成粒径为100目的粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：取400g粉末状对虾壳，将其在3000ml碱性浸提液中，在40℃下浸提3次，每次36h；然后过滤并浓缩得固含量为25％的浓缩液；其中，所述碱性浸提液为体积比为1:2的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；所述氢氧化钠水溶液和所述氯化钠水溶液的浓度分别为2％和2％；
(3)酶解：采用冰醋酸将所述浓缩液的pH调节为8.5，随后在浸提液中加入3ml浓度为8u/ml的胰蛋白酶溶液，在56℃下酶解1h后，升温灭活；然后采用冰醋酸将所述浓缩液的pH调节为6，随后在浸提液中加入3ml浓度为80u/ml的木瓜蛋白酶溶液，在38℃下酶解3h后，升温灭活，然后，采用冰醋酸加入少量活性炭，并使用真空泵过滤，得含所述硫酸软骨素的酶解液；
(4)纯化：将所述酶解液过滤，然后将其加入到97％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为73％，静置1h后，去除上清液，并无水乙醇冲洗脱水2次，然后置于60℃的真空干燥箱中干燥24h，得浅橘色粉末状硫酸软骨素70.72g。
其中，本实施例方法制得的硫酸软骨素的纯度为88％，提取率为17.68％。
实施例5
本实施例例提供了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，与实施例1相比，其区别仅在于浸提液中的氢氧化钠比率不同，本实施例采用体积比为1:1.5的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液替换实施例1中的体积比为1:2的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液。
本实施例制得的硫酸软骨素的纯度为80％，提取率为16.71％。
实施例6
本实施例提供了一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，与实施例1相比，其区别仅在于缩短丙酮处理的时间，本实施例采用再将对虾壳在新的丙酮溶液中密封浸泡1天替换实施例1中的再将对虾壳在新的丙酮溶液中密封浸泡2天。
本实施例制得的硫酸软骨素的纯度为85％，提取率为16.42％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种从对虾壳提取硫酸软骨素的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1.5-5天，然后干燥，并粉碎制成粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：将所述粉末状对虾壳在碱性浸提液中浸提，然后过滤并浓缩，得浓缩液；
(3)酶解：将所述浓缩液的pH调节为8-9，随后向其中加入胰蛋白酶，在50-60℃下酶解1-3h后，升温灭活；然后将所述浓缩液的pH调节为6-7，随后向其中加入木瓜蛋白酶，在35-45℃下酶解1-3h后，升温灭活，得含所述硫酸软骨素的酶解液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸泡具体为：将对虾壳在2-7℃下在丙酮溶液中密封浸泡0.5-2天，然后取出并冲刷干净，然后再将对虾壳在2-7℃下在丙酮溶液中密封浸泡1-3天；
和/或，所述粉末状对虾壳的粒径为50-200目。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性浸提液为体积比为1∶1-3的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；所述氢氧化钠水溶液和所述氯化钠水溶液的浓度分别为1.8％-2％和1.8％-2.2％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述浸提在35-45℃下进行2-4次，每次30-40h。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浓缩液的固含量为20％-30％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述胰蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.0007-0.0022mg/mL；优选所述胰蛋白酶以浓度为5-10u/ml的溶液形式加入。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述木瓜蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.0015-0.002mg/mL；优选所述木瓜蛋白酶以浓度为70-90u/ml的溶液形式加入。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，采用冰醋酸和/或氢氧化钠粉末调节所述浓缩液的pH。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述酶解液进行提纯的步骤，所述提纯具体为：将所述酶解液过滤，然后加入到90-97％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为65-75％，静置后，去除上清液，并冲洗脱水，然后干燥，即得所述硫酸软骨素。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对虾壳处理：将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡0.5-2天，然后取出并冲刷干净，然后再将对虾壳在丙酮溶液中密封浸泡1-3天，然后干燥，并粉碎制成粒径为50-200目的粉末状对虾壳，备用；
(2)浸提：将所述粉末状对虾壳在碱性浸提液中，在35-45℃下浸提2-4次，每次30-40h；然后过滤并浓缩得固含量为20％-30％的浓缩液；其中，所述碱性浸提液为体积比为1∶1.5-2.5的氢氧化钠水溶液和氯化钠水溶液的混合溶液；
(3)酶解：采用冰醋酸和/或氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为8-9，随后向其中加入浓度为7-9u/ml的胰蛋白酶溶液，在52-56℃下酶解1-3h后，升温灭活，其中，所述胰蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.001-0.002mg/mL；然后采用冰醋酸和/或氢氧化钠粉末将所述浓缩液的pH调节为6-7，随后向其中加入浓度为75-85u/ml的木瓜蛋白酶溶液，在38-42℃下酶解1-3h后，升温灭活，其中，所述木瓜蛋白酶相对于所述浓缩液的加入量为0.0015-0.002mg/mL，得含所述硫酸软骨素的酶解液；
(4)纯化：将所述酶解液过滤，然后将其加入到93-97％乙醇溶液中，使所得体系中的乙醇浓度为67-73％，静置后，去除上清液，并冲洗脱水，然后干燥，即得所述硫酸软骨素。
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