CN109503733A - 一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，包括以下步骤：(1)预处理；(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量2‑3％的第一酶，于pH值为5.5‑6.5且温度为40‑60℃的条件下酶解3‑4h；然后调整pH值至6‑6.3，此时加入软骨投料重量1‑2％的第二酶，于50‑60℃的条件下酶解1‑2h；所述第一酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少一种；所述第二酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种；(3)超滤；(4)后处理。本发明的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法可替代现有的固定化酶酶解工艺，其产品收率达25‑30％，纯度达90‑92％。
Description
技术领域
本发明涉及海产品加工工艺，特别涉及一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法。
背景技术
硫酸软骨素是从动物组织中提取的黏多糖类物质，其基本单位是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯。一般硫酸软骨素约含50-70个二糖单位，平均分子量10000-30000。分子中带有大量的负电荷，具有调脂、抗炎及弱的抗凝血、抗血栓生物活性，对维持细胞环境的相对稳定性和正常功能具有重要作用。
硫酸软骨素能促进基质中纤维的增长，增强通透性，改善血液循环，加速新陈代谢，促进渗透液的吸收及炎症的消除；其聚阴离子具有强的保水性，能改善眼角膜组织的水分代谢，对角膜有较强的亲和力，能在角膜表面形成一层透气保水膜，促进角膜创伤的愈合及改善眼部干燥症状。
硫酸软骨素能将水分吸入蛋白多糖分子内，使软骨变厚及有如海绵般，并增加关节内的滑液量。如此一来，它便能提供“垫衬”作用以增强关节的减震能力和缓和行走或跳动时的冲击和摩擦。硫酸软骨素还作为输送管道，为软骨输送重要的氧和营养素，同时把二氧化碳和废物加以排除。硫酸软骨素还可以抑制破坏软骨的酵素(例如胶原酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶)，以免软骨被分解或溶解。
自然界中的硫酸软骨素多存在于动物的软骨、喉骨、鼻骨，鱼类软骨中含量也很丰富，结缔组织含量很少。目前，市场上硫酸软骨素多从猪、牛、羊等动物软骨中提取，该类动物的软骨中硫酸软骨素含量和产品价值都较低。而从鲨鱼软骨中提取的鲨鱼硫酸软骨素属于纯天然海洋生物活性物质，能够降血脂、抗衰老、防止动脉粥样硬化，在防治冠心病和心肌梗塞等心血管疾病中有较好的疗效；还能调节关节机能，用于治疗关节炎和预防结缔组织相关的疾病；并且具有抗病毒、抗肿瘤、提高机体免疫力的作用。鲨鱼硫酸软骨素以其独特的生物活性功能在医药和保健品中有着广泛的应用。
采用传统的稀碱、稀碱-盐、稀碱-酶等提取硫酸软骨素的方法，产品得率低，蛋白质和氮杂质含量较高；中国专利申请(公开号：CN101701043A)涉及一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，该方法采用固定化木瓜蛋白酶、固定化胰蛋白酶、固定化胃蛋白酶、固定化微生物碱性蛋白酶进行酶解，一方面固定化酶可以回收再利用且可以实现连续化生产，另一方面，提高硫酸软骨素含量达50-60％。然而，由于固定化酶固定时酶活力存在损失，同时固定化酶的采用无形中增加了生产的成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，可替代固定化酶进行酶解，进而提高酶解时的酶活力以及降低生产成本。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将鲨鱼软骨依次进行脱脂与粉碎处理，获得粉末原料，于获得的粉末原料中加入氢氧化钠溶液和氯化钠溶液，于温度为40-50℃的条件下提取12-13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6-7.9；
(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量2-3％的第一酶，于pH值为5.5-6.5且温度为40-60℃的条件下酶解3-4h；然后调整pH值至6-6.3，此时加入软骨投料重量1-2％的第二酶，于50-60℃的条件下酶解1-2h；所述第一酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少一种；所述第二酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种；
(3)超滤：将步骤(2)酶解后的滤液于20-35℃条件下采用截留分子量为5000-10000的超滤膜进行超滤脱水，直至浓缩至原体积的2/3-4/5；
(4)后处理：将步骤(3)超滤脱水后的浓缩液的pH值调整为7.6-7.9，加入为软骨投料重量2-2.5％的双氧水，在温度为50-55℃的条件下氧化5-6小时，过滤后将滤液pH值调整为5-6，加入95％乙醇进行结晶，使乙醇浓度达65-75％，结晶后依次进行离心、洗涤和干燥，获得鲨鱼硫酸软骨素。
本发明的有益效果在于：
(1)设计上述第一酶和第二酶连续的酶解处理，可替代现有的采用固定化酶进行酶解的工艺，不会降低酶活力，且工艺本身相较于固定化酶酶解工艺，可以降低成本；
(2)经试验可知，本发明的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法提取获得硫酸软骨素，产品收率达25-30％，纯度达90-92％；且工艺温度控制在60℃以下，不会对酶产生高温破坏作用，因此，酶可以通过后续步骤进行回收利用。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明的木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶均来源于市购。
其中，木瓜蛋白酶可购自西安昌岳生物科技有限公司。碱性蛋白酶和胰蛋白酶分别购自上海如吉生物科技发展有限公司。胃蛋白酶可购自西安康诺化工有限公司。
本发明最关键的构思在于：利用上述第一酶和第二酶的复合酶作用，可替代现有的固定化酶。
本发明提供一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：将鲨鱼软骨依次进行脱脂与粉碎处理，获得粉末原料，于获得的粉末原料中加入氢氧化钠溶液和氯化钠溶液，于温度为40-50℃的条件下提取12-13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6-7.9；
(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量2-3％的第一酶，于pH值为5.5-6.5且温度为40-60℃的条件下酶解3-4h；然后调整pH值至6-6.3，此时加入软骨投料重量1-2％的第二酶，于50-60℃的条件下酶解1-2h；所述第一酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少一种；所述第二酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种；
(3)超滤：将步骤(2)酶解后的滤液于20-35℃条件下采用截留分子量为5000-10000的超滤膜进行超滤脱水，直至浓缩至原体积的2/3-4/5；
(4)后处理：将步骤(3)超滤脱水后的浓缩液的pH值调整为7.6-7.9，加入为软骨投料重量2-2.5％的双氧水，在温度为50-55℃的条件下氧化5-6小时，过滤后将滤液pH值调整为5-6，加入95％乙醇进行结晶，使乙醇浓度达65-75％，结晶后依次进行离心、洗涤和干燥，获得鲨鱼硫酸软骨素。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：
(1)设计上述第一酶和第二酶连续的酶解处理，可替代现有的采用固定化酶进行酶解的工艺，不会降低酶活力，且工艺本身相较于固定化酶酶解工艺，可以降低成本；
(2)经试验可知，本发明的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法提取获得硫酸软骨素，产品收率达25-30％，纯度达90-92％；且工艺温度控制在60℃以下，不会对酶产生高温破坏作用，因此，酶可以通过后续步骤进行回收利用。
进一步的，步骤(1)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1-1.5％，所述氯化钠溶液的浓度为5-6％，所述氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的2.5-3.5倍。
进一步的，步骤(2)中，所述第一酶为碱性蛋白酶；所述第二酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶。
进一步的，步骤(1)中的鲨鱼软骨为鲨鱼头软骨、鲨鱼尾软骨、鲨鱼脊椎软骨和鲨鱼翅软骨中的至少一种。
进一步的，步骤(3)中，所述超滤脱水采用的超滤膜为中空纤维式超滤膜、卷式超滤膜或平板式超滤膜。
实施例1
本实施例的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：将鲨鱼脊椎软骨洗净依次进行脱脂与粉碎处理，获得粉末原料，于获得的粉末原料中加入浓度为1％氢氧化钠溶液和浓度为5％的氯化钠溶液，氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的2.5倍；于温度为40℃的条件下提取12h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6；
(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量2％的第一酶，于pH值为5.5且温度为40℃的条件下酶解3h；然后调整pH值至6，此时加入软骨投料重量1％的第二酶，于50℃的条件下酶解1h；所述第一酶为木瓜蛋白酶；所述第二酶为胃蛋白酶；
(3)超滤：将步骤(2)酶解后的滤液于20℃条件下采用截留分子量为5000的中空纤维式超滤膜进行超滤脱水，直至浓缩至原体积的2/3；
(4)后处理：将步骤(3)超滤脱水后的浓缩液的pH值调整为7.6，加入为软骨投料重量2％的双氧水，在温度为50℃的条件下氧化5小时，过滤后将滤液pH值调整为5，加入95％乙醇进行结晶，使乙醇浓度达65％，结晶后依次进行离心、洗涤和干燥，获得本实施例的鲨鱼硫酸软骨素。提取获得的鲨鱼硫酸软骨素的产品收率为25％，纯度为90.68％。
实施例2
本实施例的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：将鲨鱼脊椎软骨洗净依次进行脱脂与粉碎处理，获得粉末原料，于获得的粉末原料中加入浓度为1.5％氢氧化钠溶液和浓度为6％的氯化钠溶液，氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的3.5倍；于温度为50℃的条件下提取13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.9；
(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量3％的第一酶，于pH值为6.5且温度为60℃的条件下酶解4h；然后调整pH值至6.3，此时加入软骨投料重量2％的第二酶，于60℃的条件下酶解2h；所述第一酶为碱性蛋白酶；所述第二酶为胃蛋白酶；
(3)超滤：将步骤(2)酶解后的滤液于35℃条件下采用截留分子量为10000的平板式超滤膜进行超滤脱水，直至浓缩至原体积的4/5；
(4)后处理：将步骤(3)超滤脱水后的浓缩液的pH值调整为7.9，加入为软骨投料重量2.5％的双氧水，在温度为55℃的条件下氧化6小时，过滤后将滤液pH值调整为6，加入95％乙醇进行结晶，使乙醇浓度达75％，结晶后依次进行离心、洗涤和干燥，获得本实施例的鲨鱼硫酸软骨素。提取获得的鲨鱼硫酸软骨素的产品收率为27％，纯度为90.89％。
实施例3
本实施例的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：将鲨鱼脊椎软骨洗净依次进行脱脂与粉碎处理，获得粉末原料，于获得的粉末原料中加入浓度为1.2％氢氧化钠溶液和浓度为5.5％的氯化钠溶液，氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的3倍；于温度为45℃的条件下提取12.5h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.8；
(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量2.5％的第一酶，于pH值为6且温度为50℃的条件下酶解3.5h；然后调整pH值至6.2，此时加入软骨投料重量1.5％的第二酶，于55℃的条件下酶解1.5h；所述第一酶为碱性蛋白酶；所述第二酶为胰蛋白酶；
(3)超滤：将步骤(2)酶解后的滤液于30℃条件下采用截留分子量为8000的中空纤维式超滤膜进行超滤脱水，直至浓缩至原体积的3/4；
(4)后处理：将步骤(3)超滤脱水后的浓缩液的pH值调整为7.8，加入为软骨投料重量2.2％的双氧水，在温度为52℃的条件下氧化5.5小时，过滤后将滤液pH值调整为5.5，加入95％乙醇进行结晶，使乙醇浓度达70％，结晶后依次进行离心、洗涤和干燥，获得本实施例的鲨鱼硫酸软骨素。提取获得的鲨鱼硫酸软骨素的产品收率为30％，纯度为92.23％。
综上所述，本发明提供的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法可替代现有的固定化酶酶解工艺，可保证酶活力不降低、成本低且实现酶的可回收利用，其产品收率达25-30％，纯度达90-92％。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理：将鲨鱼软骨依次进行脱脂与粉碎处理，获得粉末原料，于获得的粉末原料中加入氢氧化钠溶液和氯化钠溶液，于温度为40-50℃的条件下提取12-13h，过滤获得滤液，然后调整滤液的pH值为7.6-7.9；
(2)酶解：于步骤(1)获得的滤液中加入软骨投料重量2-3％的第一酶，于pH值为5.5-6.5且温度为40-60℃的条件下酶解3-4h；然后调整pH值至6-6.3，此时加入软骨投料重量1-2％的第二酶，于50-60℃的条件下酶解1-2h；所述第一酶为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶中的至少一种；所述第二酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶中的至少一种；
(3)超滤：将步骤(2)酶解后的滤液于20-35℃条件下采用截留分子量为5000-10000的超滤膜进行超滤脱水，直至浓缩至原体积的2/3-4/5；
(4)后处理：将步骤(3)超滤脱水后的浓缩液的pH值调整为7.6-7.9，加入为软骨投料重量2-2.5％的双氧水，在温度为50-55℃的条件下氧化5-6小时，过滤后将滤液pH值调整为5-6，加入95％乙醇进行结晶，使乙醇浓度达65-75％，结晶后依次进行离心、洗涤和干燥，获得鲨鱼硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1-1.5％，所述氯化钠溶液的浓度为5-6％，所述的氢氧化钠溶液和氯化钠溶液的加入量均为鲨鱼软骨重量的2.5-3.5倍。
3.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述第一酶为碱性蛋白酶；所述第二酶为胰蛋白酶或胃蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中的鲨鱼软骨为鲨鱼头软骨、鲨鱼尾软骨、鲨鱼脊椎软骨和鲨鱼翅软骨中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的鲨鱼硫酸软骨素的提取方法，其特征在于，步骤(3)中，所述超滤脱水采用的超滤膜为中空纤维式超滤膜、卷式超滤膜或平板式超滤膜。
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