CN101445565A - 一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，属于盐藻生物技术及其制品、色谱分离技术领域。本发明以提取出β－胡萝卜素后的杜氏盐藻粉为原料，采用在碱性条件下热水浸提，以等电点法去除大部分蛋白，用乙醇沉淀法析出多糖，以Sevag法进一步去除残余蛋白，再采用离子交换色谱－磷酸盐缓冲液离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱－NaAc水溶液梯度洗脱法分离纯化，分部收集，适当浓缩后冷冻干燥，得到包括一种以半乳糖为主、同时含有较高含量阿拉伯糖和木糖的硫酸化杂多糖和一种核酸多糖共五个杜氏盐藻多糖均一组分。本发明方法简单实用，成本低，利于推广、开发与应用。

Description

一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法
技术领域
一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，涉及由杜氏盐藻制备硫酸化杂多糖和核酸多糖的分离纯化方法，属于盐藻生物技术及其制品、色谱分离技术领域。
背景技术
杜氏盐藻(Duanaliella salina)是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物，既是重要的一类海洋微藻，也可养殖于内陆盐湖。杜氏盐藻中存在着丰富的、构成独特并具有多种生理活性的初级和次级代谢产物——除有高含量的天然β-胡萝卜素外，还含有丰富的多糖、蛋白质、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质及人体所需的矿物质。这些生理活性物质在防治心血管疾病、肿瘤和抗辐射及抗病毒、免疫调节等方面具有良好的应用前景。盐藻生物技术及其制品的开发已成为国际海洋生物界关注的重点。然而，目前人们大规模培养杜氏盐藻主要用于生产β-胡萝卜素，而其中高达10％-40％的多糖类物质的研究利用较少，对其多糖的分离纯化缺乏系统深入的研究，己有报道的盐藻多糖产品均为糖蛋白或以葡萄糖为主的杂多糖，有关应用离子交换色谱--磷酸盐缓冲液离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱—NaAc水溶液梯度洗脱分离法从盐藻中制备核酸多糖和以半乳糖为主、同时含有较高含量阿拉伯糖和木糖的硫酸化杂多糖的方法均未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，以利用杜氏盐藻中的多糖成份。
本发明的技术方案：一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，以提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉为原料，根据盐藻多糖的特点，采用在碱性条件下热水浸提，以等电点法结合Sevag法除蛋白，乙醇沉淀析出多糖，再用离子交换色谱---磷酸盐缓冲液离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱—NaAc水溶液梯度洗脱法分离纯化得到包括一种硫酸化杂多糖和一种核酸多糖共五个杜氏盐藻多糖均一组分，步骤为：
(1)浸提：取一定量提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉，用pH8.5～10.0的2mol/L NaOH水溶液于水浴加热提取，液料比mL/g计为10:1～16:1，提取温度70～90℃，提取时间2～4小时，提取2次，合并提取液，得到藻多糖提取液；
(2)等电点法除蛋白：提取液采用等电点法除去大部分蛋白：用2mol/L HCl调pH为3.5～4，4000r/min离心20min，得到上清液；
(3)沉析：上清液用3.8倍体积的95％乙醇沉淀，静置，离心，抽滤，取滤饼真空干燥或冻干得到盐藻多糖粗提物；
(4)Sevag法进一步除游离蛋白：将盐藻多糖粗提物加入一定量的去离子水溶解得样液，用Sevag法进一步去除游离蛋白，将氯仿:丁醇体积比4:1的Sevag试剂加入样液中，所用Sevag试剂体积为样液体积的1/5，充分振荡，离心去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复3～5次；取水相透析MWCO 3500Da，并适当浓缩后即得到初步纯化的盐藻多糖浓缩液，用于下步色谱分离；
(5)离子交换色谱分离：取步骤(4)中得到的盐藻多糖浓缩液上样50mL于DEAE-Sepharose Fast folw柱，3.5cm×30cm，进行离子交换色谱分离，用含NaCl的pH值为6.8～7.8的0.02mol/L磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，NaCl浓度由0.01mol/L到1.0mol/L，流速为6～9mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法，波长490nm，逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测；根据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析、浓缩；得到4个多糖级分PD1、PD2、PD3和PD4；PD1、PD2和PD3进行冻干；PD4用于后续进一步分离纯化；
(6)凝胶过滤色谱分离：多糖级分PD4上Sepharose CL 6B柱，2.6cm×100cm，进行凝胶过滤色谱分离，用0.1mol/L NaAc洗脱，流速为0.3～0.6mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法，波长490nm，逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测；依据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析和浓缩、冻干，得到2个多糖级分，即硫酸化杂多糖PD4a和核酸多糖PD4b。
本发明的有益效果：本发明以提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉为原料，在碱性条件下热水浸提，以等电点法去除大部分蛋白，用乙醇沉淀法析出多糖，以Sevag法进一步去除残余蛋白，再采用离子交换色谱-离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱法分离纯化，分部收集，适当浓缩后冷冻干燥得到包括一种以半乳糖为主、同时含有较高含量阿拉伯糖和木糖的硫酸化杂多糖及一种核酸多糖共五个杜氏盐藻多糖纯一级分。本发明方法简单实用，成本低，利于推广、开发与应用。
附图说明
图1盐藻多糖不同级分的高效体积排阻色谱图谱。
图2PD4a的红外光谱图。
图3PMP-HPLC法分析。(a)、PD4a，(b)、PD1及(c)、PD4b的单糖组成图谱。
图4PD4a和PD4b的琼脂糖凝胶电泳分析。
具体实施方式
实施例1
取200g杜氏盐藻粉，用2000mL的pH8.5稀NaOH碱性水溶液于90℃水浴加热提取3.0小时，提取两次，合并得到提取液；将提取液用2mol/L HCl调pH为4.0，离心(4000r/min)20min，得到上清液经浓缩后用3.8倍95％乙醇醇沉，低温(4℃)静置8小时，离心，抽滤，取滤饼真空干燥得到粗提物；进一步用Sevag法去除游离蛋白，并透析和浓缩，得到初步纯化的粗多糖浓缩液。将粗多糖浓缩液冻干后以苯酚—硫酸法测定多糖的含量为75.5％，得率为9.0％。
将初步纯化的粗多糖浓缩液上样50mL于DEAE-Sepharose Fast folw柱(3.5cm×30cm)进行离子交换色谱分离，用含NaCl的pH值为6.8的0.02mol/L磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱(NaCL浓度由0.01mol/L到1.0mol/L)，流速为6mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法(波长490nm)逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测。根据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析、浓缩和冻干。得到4个多糖级分PD1、PD2、PD3和PD4。离交纯化得率为：PD1，8.7％；PD2，19.1％；PD3，16.3％；PD4，39.1％。
将PD4配成10mg/mL左右的水溶液10mL上Sepharose CL 6B柱(2.6cm×100cm)进行凝胶过滤色谱分离，用0.1mol/L NaAc洗脱，流速为0.4mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法(波长490nm)逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测。依据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析和浓缩、冻干，得到2个多糖纯级分PD4a和PD4b。得率分别为46.7％和43.9％。
实施例2
取500g杜氏盐藻粉，用7500mL的pH9.0碱性水溶液80℃水浴加热提取4小时，提取两次，合并得到提取液；将提取液用2mol/L HCl调pH为3.5，离心(4000r/min)20min，得到上清液经浓缩后用3.8倍体积的95％乙醇沉析多糖，低温(4℃)静置过夜，离心，抽滤，取滤饼真空干燥得到粗提物；进一步用Sevag法去除游离蛋白，并透析和浓缩，得到初步纯化的粗多糖浓缩液。将粗多糖浓缩液冻干后以苯酚—硫酸法测定多糖的含量为78.2％，得率为8.5％。
将初步纯化的粗多糖水溶液(10mg/mL)上样50mL于DEAE-Sepharose Fastfolw柱(3.5cm×30cm)进行离子交换色谱分离，用含NaCl的pH值为7.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱(NaCL浓度由0.01mol/L到1.0mol/L)，流速为8mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法(波长490nm)逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测。根据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析、浓缩和冻干。得到4个多糖级分PD1、PD2、PD3和PD4。离交纯化得率为：PD1，8.0％；PD2，22.3％；PD3，15.4％；PD4，35.8％。
将PD4配成10mg/mL左右的水溶液10mL上Sepharose CL 6B柱(2.6cm×100cm)进行凝胶过滤色谱分离，用0.1mol/L NaAc洗脱，流速为0.6mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法(波长490nm)逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测。依据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析和浓缩、冻干，得到2个多糖纯级分PD4a和PD4b。得率分别为44.2％和46.3％。
表1及表2表明PD1、PD2、PD3、PD4a和PD4b分别为分子量大小及分布不同、化学组成有显著差异的五种纯一多糖级分。
表1 盐藻多糖不同级分的分子量分布
 
级分 数均分子量Mn(Da) 重均分子量Mw(Da) 分布宽度Mw/Mn
PD1 367039 1548310 4.22
PD2 11752 33491 2.85
PD3 21064 66810 3.17
PD4a 116256 424163 3.65
PD4b 5025 10264 2.04
表2 杜氏盐藻多糖各级分的主要成分(％，w/w)
 
级分 总糖 糖醛酸 硫酸基 蛋白质
PD1 91.67 5.28 / 1.92
PD2 94.21 / / /
PD3 85.01 / / 10.34
PD4a 77.94 8.53 8.36 5.17
PD4b 37.09 3.57 / 6.9
表3 盐藻多糖各级分的单糖组成(mol％，n＝4)
 
级分 甘露糖(man) 核糖(rib) 鼠李糖(rha) 葡萄糖醛酸(glcUA) 半乳糖醛酸(galUA)
PD4a 5.04 0.71 3.60 2.41 5.26
PD4b 3.48 67.8 1.34 2.36 2.70
PD1 2.32 0 3.67 1.95 2.00
PD2 0 0 0 0 0
PD3 0 0 0 0 0
级分 葡萄糖(glc) 半乳糖(gal) 木糖(xyl) 阿拉伯糖(ara) 岩藻糖(fuc)
PD4a 5.38 42.04 11.56 19.48 4.52
PD4b 4.69 8.40 4.25 3.61 1.37
PD1 73.10 7.40 4.01 3.35 2.18
PD2 100 0 0 0 0
PD3 100 0 0 0 0
图3显示PD4a在1240cm-1有较强吸收，是硫酸基的S＝O伸缩振动特征吸收；用BaCl2-明胶比浊法测定硫酸基含量为8.36％，由此可判断PD4a为硫酸化多糖。表3是PMP柱前衍生化高效液相色谱法测得的盐藻多糖各级分的单糖组成的结果。由表3和图3可知：PD4a是一种以半乳糖为主、同时含有较高含量阿拉伯糖和木糖及少量糖醛酸的硫酸化杂多糖；PD4b是以核糖为主的杂多糖；PD1是以葡萄糖为主的杂多糖；PD2和PD3均为葡聚糖。此外，除PD2外，其它四个级分均还含少量肽链。
用核酸酶处理前后的PD4b的水溶液紫外光谱图(190-400nm)(图略)显示：酶解后PD4b在260nm左右的最大吸收峰消失，这说明PD4b中确实存在核酸。PD4b经水解后经PMP衍生化作反相HPLC分析(图3)和LC-MS验证(图略)得到的单糖组成的结果(见表3)显示，PD4b含有核糖，不含有脱氧核糖，故其中核酸应是RNA；此外，高效凝胶过滤色谱法分析(图1)和琼脂糖凝胶电泳分析(图4)均显示PD4b为单一谱带；因此，PD4b是核酸与多糖之间以共价键结合在一起的均一多糖复合物。

Claims (1)

1、一种杜氏盐藻多糖的分离纯化方法，其特征是以提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉为原料，采用在碱性条件下热水浸提，以等电点法结合Sevag法除蛋白，乙醇沉淀析出多糖，再用离子交换色谱---磷酸盐缓冲液离子强度梯度洗脱法结合凝胶过滤色谱—NaAc水溶液梯度洗脱法分离纯化得到包括一种硫酸化杂多糖和一种核酸多糖共五个杜氏盐藻多糖均一组分，步骤为：
(1)浸提：取一定量提取出β-胡萝卜素后的杜氏盐藻粉，用pH8.5～10.0的2mol/L NaOH水溶液于水浴加热提取，液料比mL/g计为10:1～16:1，提取温度70～90℃，提取时间2～4小时，提取2次，合并提取液，得到藻多糖提取液；
(2)等电点法除蛋白：提取液采用等电点法除去大部分蛋白：用2mol/L HCl调pH为3.5～4，4000r/min离心20min，得到上清液；
(3)沉析：上清液用3.8倍体积的95％乙醇沉淀，静置，离心，抽滤，取滤饼真空干燥或冻干得到盐藻多糖粗提物；
(4)Sevag法进一步除游离蛋白：将盐藻多糖粗提物加入一定量的去离子水溶解得样液，用Sevag法进一步去除游离蛋白，将氯仿：丁醇体积比4:1的Sevag试剂加入样液中，所用Sevag试剂体积为样液体积的1/5，充分振荡，离心去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，重复3～5次；取水相透析MWCO 3500Da，并适当浓缩后即得到初步纯化的盐藻多糖浓缩液，用于下步色谱分离；
(5)离子交换色谱分离：取步骤(4)中得到的盐藻多糖浓缩液上样50mL于DEAE-Sepharose Fast folw柱，3.5cm×30cm，进行离子交换色谱分离，用含NaCl的pH值为6.8～7.8的0.02mol/L磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，NaCl浓度由0.01mol/L到1.0mol/L，流速为6～9mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法，波长490nm，逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测；根据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析、浓缩；得到4个多糖级分PD1、PD2、PD3和PD4；PD1、PD2和PD3进行冻干；PD4用于后续进一步分离纯化；
(6)凝胶过滤色谱分离：多糖级分PD4上Sepharose CL6B柱，2.6cm×100cm，进行凝胶过滤色谱分离，用0.1mol/L NaAc洗脱，流速为0.3～0.6mL/min，分部收集，采用苯酚—硫酸法，波长490nm，逐管检测多糖含量，同时在线紫外280nm检测；依据洗脱曲线，合并同一色谱峰的各管收集液，分别透析和浓缩、冻干，得到2个多糖级分，即硫酸化杂多糖PD4a和核酸多糖PD4b。
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C10 Entry into substantive examination
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090603