CN113968900A - 一种纯化C1q蛋白的方法 - Google Patents

一种纯化C1q蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113968900A
CN113968900A CN202010718525.4A CN202010718525A CN113968900A CN 113968900 A CN113968900 A CN 113968900A CN 202010718525 A CN202010718525 A CN 202010718525A CN 113968900 A CN113968900 A CN 113968900A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
solution
scheme
purification
dialysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010718525.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113968900B (zh
Inventor
易维京
裴大毛
朱攀
李赛
赵忠颢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd filed Critical Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202010718525.4A priority Critical patent/CN113968900B/zh
Publication of CN113968900A publication Critical patent/CN113968900A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113968900B publication Critical patent/CN113968900B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于蛋白纯化技术领域，尤其涉及一种纯化C1q蛋白的方法。本发明通过低盐离子溶液透析、强阳离子交换柱层析以及硫酸铵沉淀结合来纯化目的蛋白C1q，适用于存放时间长的不新鲜血清样本，同时将目的蛋白C1q的纯化时间浓缩到了48h内，在极大的缩短生产周期的基础上，目的蛋白的纯化质量(回收率以及蛋白活性)也得到了保证，最大程度的降低了生产成本。

Description

一种纯化C1q蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种C1q的纯化方法。
背景技术
C1q是补体C1的第一个亚成分，分子量390kDa，pI 9.3。由A、B链通过二硫键相互连接，与C链非共价结合形成花束状六聚体结构。补体经典途径中，C1q球状头部通过识别结合IgG或IgM免疫复合物Fc段补体结合部位启动并激活补体级联反应，清除抗原抗体复合物。现研究表明，C1q与多种肾病、动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮等系统性疾病相关。
人血清中，C1q含量约为150μg/ml，而在实际生产过程中，由于供应链不及时以及其他问题导致的样本存放时间过长，以至于产生不新鲜的血清样本，而在不新鲜的血清样本中，由于存放时间过长，蛋白质大量降解，目的蛋白C1q的含量大大降低，进一步加大了蛋白纯化的难度。而市面上现存的血清蛋白纯化方法主要分为三类：(1)亲和层析法；(2)EDTA或EGTA低盐透析沉淀法；(3)优球蛋白沉淀结合离子交换层析。其纯化样品主要选自新鲜血清，且其纯化效率低，耗时长、工艺复杂，成本高，不适用于大规模工业生产。因此现阶段急需一种能够高效快速从存放时间较长、不新鲜的血清样本中提取C1q的纯化方式。
发明内容
因此本发明要解决的技术问题是：针对现有技术从人不新鲜血清中提纯C1q耗时长、回收率低等问题，提供一种C1q蛋白的纯化方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明提供了一种C1q蛋白的纯化方法。
本发明的上述目的是通过下列技术方案实施的：
一种纯化C1q蛋白的方法，其特征在于，所述方法为采用低盐离子溶液透析、强阳离子交换柱层析以及硫酸铵沉淀进行蛋白纯化，所述强阳离子交换柱的填料选自UniGel-30SP、 UniGel-50SP或UniGel-80SP中的至少一种。。
优选地，所述低盐离子溶液透析包括以下步骤：
(1)预处理：将样本置于2-6℃，8000-12000g离心20-30min，弃沉淀；
(2)透析：将上清透析于低盐离子溶液中；
(3)过滤：收集透析后的上清，过滤膜，收集滤液。
优选地，所述步骤(2)中的低盐离子溶液为pH7-8、20-30mM的EGTA溶液。
优选地，所述步骤(2)中的低盐离子溶液为pH7-8、6-12mM的EDTA溶液。
优选地，所述步骤(3)中的滤膜粒径大小为0.2-2μm。
优选地，所述强阳离子交换柱层析包括以下步骤：
(1)柱平衡：用2M NaCl与水依次洗涤柱子，之后用平衡缓冲液A进行平衡；
(2)上样：将低盐离子溶液透析后样品加载到平衡后的柱子中，流速度控制在140-160cm/h；
(3)平衡：用平衡缓冲液A继续冲洗柱子，使未结合的组分从柱子上分离；
(4)洗脱：用洗脱缓冲液B进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，收集洗脱液并保存。
优选地，所述方法中平衡缓冲液A为pH7.0-8.0 20mM的PBS，所述洗脱缓冲液B为平衡缓冲液A中补加350mM NaCl。
优选地，所述硫酸铵沉淀包括以下步骤：
(1)在强阳离子交换柱层析后样品中加入饱和(NH4)2SO4至终浓度为30％-40％(体积百分数)，2-6℃下静置6-8min，8000-12000g离心6-8min，收集沉淀；
(2)用保存缓冲液C溶解沉淀，并于2-6℃下透析于保存缓冲液C中，透析后溶液即为目的蛋白。
优选地，所述步骤(2)中的保存缓冲液C为0.75M NaCl、0.02M acetate buffer、0.01M EDTA，pH 7.5的溶液。
有益效果：
(1)本发明提供的C1q蛋白纯化方法适用于存放时间长的不新鲜的血清样品，在实际的生产过程中，常常会出现因为供应链不及时或其他问题而产生的不新鲜样本，而在不新鲜的血清样品中，由于存放时间较长，样品中的蛋白质大量降解，从而导致样品中C1q目的蛋白的含量大大降低，从而加大了目的蛋白纯化的难度。本发明通过提供一种低盐离子溶液透析、强阳离子交换柱层析以及硫酸铵沉淀结合的蛋白纯化方法，可以最大程度的纯化不新鲜样本中的C1q蛋白，成本更低，具有极高的经济效益。
(2)本发明提供的C1q蛋白纯化方法，将目的蛋白C1q的纯化时间浓缩到了48h内，而在现有技术中C1q的纯化需要花费96h以上，在极大的缩短生产周期的基础上，目的蛋白的纯化质量(回收率以及蛋白活性)也得到了保证，最大程度的降低了生产成本。
附图说明
图1为不同存放时间血清样本的蛋白纯化效果对比图
具体实施方式
本发明公开了一种纯化人血清C1q蛋白的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明保护范围之内。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明的技术方案。
本发明的目的在于提供一种人血清C1q蛋白的纯化方法，所述纯化步骤较少，纯化所用时间较短，所得蛋白纯度、回收率较高，且进行等比例放大无需额外设备即可得到克级产物。
下面结合附图及具体的实施例对发明进行进一步介绍，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例提供了一种利用EGTA透析盐、亲和层析以及(NH4)2SO4沉淀制备目的蛋白沉淀物的方法，所述样本为在4℃环境中存放了40M(月)的人血清样品。按照下述的纯化步骤进行：
1.样品预处理
(1)将200ml人血清放入低温离心机中，4℃，10000g离心30min，收集上清；
(2)将上清液透析与pH7.5的30EGTA溶液中(透析比例为1:20)，4℃透析12h，重复操作三次。
(3)取出透析后溶液，4℃，10000g离心15min，弃上清，收集沉淀，用200ml26mMEGTA 溶液洗涤，重复操作一次。
(4)取洗涤后的沉淀，用50ml pH7.3 20mM PBS溶解沉淀，4℃，10000g离心15min，收集上清，重复操作两次；
(5)将收集的上清过0.22μm滤膜，收集滤液。
2.离子交换层析纯化蛋白
将步骤1得到的预处理蛋白通过镍亲和层析柱进行纯化，所用柱子为(取20mlUniGel-80SP填充至16mm层析柱中)，具体纯化步骤为：
2.1缓冲液配置
(1)平衡缓冲液A：pH 7.3 20mM PBS；
(2)平衡缓冲液B：pH 7.3 20mM PBS补加350mM NaCl；
(3)保存缓冲液C：0.75M NaCl、0.02M acetate buffer、0.01M EDTA，pH 7.5；
(4)清洁：20％乙醇用于镍柱的清洁及保存，但在必要情况下，需要对镍柱进行脱镍再生处理。
2.2 C1q蛋白镍柱纯化步骤
(1)柱平衡：
取20ml UniGel-80SP填充至16mm层析柱中，用3CV的2M Nacl与水依次洗涤，反复漂洗2-3次。之后用5CV的平衡缓冲液A进行平衡，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。
(2)上样：
将预处理蛋白样品加在到平衡好的柱子(GE
Figure BDA0002599094770000042
pure)中，线性流速控制为149.3 (cm/h)。
(3)平衡：
用5-10CV的pH 7.3 20mM PBS继续冲洗柱子，使未结合的组分充柱子上分离，冲洗至A280、A254基线平衡，电导及pH值稳定。
(4)洗脱：
用洗脱缓冲液B进行洗脱，线性流速控制为149.3(cm/h)，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当A280、A254基线开始上升时收集洗脱液。
2.3收集目的蛋白步骤
(1)沉淀蛋白：
将饱和(NH4)2SO4加入洗脱液中至终浓度为33％，静止孵育10min，4℃，10000g离心10min，收集沉淀。
(2)蛋白保存：
用保存缓冲液C溶解沉淀，并于4℃透析与保存缓冲液C中，收集透析后溶液，-20℃保存。
(3)蛋白纯度检测：
收集蛋白纯化过程中各组分蛋白并进行检测，检测结果如下表所示：
表1实施例1各步骤检测结果
Figure BDA0002599094770000041
本实施例说明，人血清C1q蛋白通过低盐离子(EGTA)溶液透析、强阳离子交换柱层析(80SP)以及硫酸铵沉淀结合纯化效果最好，纯化倍数达到13.52倍。
实施例2
本实施例提供了一种利用EDTA透析盐、亲和层析以及(NH4)2SO4沉淀制备目的蛋白沉淀物的方法，所述样本为在4℃环境中存放了40M(月)的人血清样品。按照下述的纯化步骤进行：
1.样品预处理
(1)将200ml人血清放入低温离心机中，4℃，10000g离心30min，收集上清；
(2)将上清液透析与pH7.5的10mM EDTA溶液中(透析比例为1:20)，4℃透析12h，重复操作两次。
(3)取出透析后溶液，4℃，10000g离心15min，弃上清，收集沉淀，用200ml 10mMEDTA溶液洗涤，重复操作一次。
(4)取洗涤后的沉淀，用50ml pH7.3 20mM PBS溶解沉淀，4℃，10000g离心15min，收集上清，重复操作两次；
(5)将收集的上清过0.22μm滤膜，收集滤液。
2.亲和层析纯化蛋白
将步骤1得到的预处理蛋白通过镍亲和层析柱进行纯化，所用柱子为(取20mlUniGel-80SP填充至16mm层析柱中)，具体纯化步骤为：
2.1缓冲液配置
(1)平衡缓冲液A：pH 7.3 20mM PBS；
(2)平衡缓冲液B：pH 7.3 20mM PBS补加350mM NaCl；
(3)保存缓冲液C：0.75M NaCl、0.02M acetate buffer、0.01M EDTA，pH 7.5；
(4)清洁：20％乙醇用于镍柱的清洁及保存，但在必要情况下，需要对镍柱进行脱镍再生处理。
2.2 C1q蛋白镍柱纯化步骤
(1)柱平衡：
取20ml UniGel-80SP填充至16mm层析柱中，用3CV的2M Nacl与水依次洗涤，反复漂洗2-3次。之后用5CV的平衡缓冲液A进行平衡，应冲洗到A280、A254基线平衡，电导及pH稳定时，即所有的未被结合的分子都被冲出镍柱。
(2)上样：
将预处理蛋白样品加在到平衡好的柱子(GE
Figure BDA0002599094770000051
pure)中，线性流速控制为149.3 (cm/h)。
(3)平衡：
用5-10CV的pH 7.3 20mM PBS继续冲洗柱子，使未结合的组分充柱子上分离，冲洗至 A280、A254基线平衡，电导及pH值稳定。
(4)洗脱：
用洗脱缓冲液B进行洗脱，线性流速控制为149.3(cm/h)，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，当A280、A254基线开始上升时收集洗脱液。
2.3收集目的蛋白步骤
(1)沉淀蛋白：
将饱和(NH4)2SO4加入洗脱液中至终浓度为33％，静止孵育10min，4℃，10000g离心10min，收集沉淀。
(2)蛋白保存：
用保存缓冲液C溶解沉淀，并于4℃透析与保存缓冲液C中，收集透析后溶液，-20℃保存。
(3)蛋白纯度检测：
收集蛋白纯化过程中各组分蛋白并进行检测，检测结果如下表所示：
表2实施例2各步骤检测结果
Figure BDA0002599094770000061
本实施例说明，人血清C1q蛋白通过低盐离子(EGTA)溶液透析、强阳离子交换柱层析(80SP)以及硫酸铵沉淀结合纯化效果最好，纯化倍数达到10.82倍。
实施例3不同存放时间血清样本的蛋白纯化
本实施例选取不同存放时间的血清作为蛋白纯化样本，采用不同的蛋白纯化方案进行纯化并进行结果比较。具体实施方法如下所述：
选择在4℃环境中存放0M(月)、5M、10M、20M、30M、40M、50M的人血清样本，采用下述技术方案进行蛋白纯化：
方案①：实施例1所述技术方案；
方案②：实施例2所述技术方案；
方案③：Tenner A J,Lesavre P H,Cooper N R.Purification andradiolabeling of human C1q.[J].Journal of Immunology,1981,127(2):648-653，MATERIALS AND METHODS第 648-649页所述技术方案；
方案④；王雄.以高pH沉淀优球蛋白分离Clq[J].国外医学.生物制品分册,1982(02):50. 第96页所述技术方案。
采用上述四种技术方案分别进行蛋白纯化，所述样品选自在4℃环境中存放0M、5M、 10M、20M、30M、40M以及50M的人血清样本，纯化的样本量均为200ml。收集各技术方案纯化后的蛋白样品并进行检测，检测结果如图1所示：
将使用上述四种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现(如图1所示)，当人血清样本存放时间短(0M-5M)时，方案①-④的目的蛋白纯化效果几乎相当，回收率均在85％-93％的范围内，采用方案④纯化后的目的蛋白的总活力略高于其他技术方案；而随着人血清样本存放时间逐渐变长，各方案的蛋白纯化效果均逐渐变差，但方案①以及方案②的纯化效果总体上仍优于方案③以及方案④，在存放时间达到20M以上时，方案①以及方案②的蛋白回收率均高于方案③和方案④，在存放时间达到50M时，方案①以及方案②的目的蛋白回收率为 49％和46％，而方案③以及方案④的蛋白回收率仅为8％和6％。实验结果说明，长时间存放后的不新鲜人血清样本，采用方案①以及方案②进行蛋白纯化能取得较好的纯化效果。
实施例4滤膜过滤对目的蛋白纯化的影响-1
本实施例将目的蛋白纯化过程中未采用滤膜以及采用不同粒径滤膜的过滤方式对目的蛋白纯化的影响进行了比较。具体实施方法如下所述:
表4实施例4检测结果
滤膜粒径
方案① 0.22μm
方案② 0.10μm
方案③ 0.30μm
方案④ 0.80μm
方案⑤ 2.50μm
注：方案①技术方案与实施例1相同；方案②-⑤增加了利用不同粒径滤膜过滤的步骤，具体实验方法为：将实施例1中第1步得到的上清过滤膜，收集滤液继续实施例第1步的实验操作。
收集上述方案①-⑤纯化后的目的蛋白样品，并进行检测，检测结果如下表所述：
表5实施例4检测结果
Figure BDA0002599094770000071
Figure BDA0002599094770000081
将使用上述五种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现，目的蛋白经过粒径大小为 0.22μm、0.30μm以及0.80μm的滤膜过滤后，目的蛋白回收率最高，分别为56.27％、60.62％以及59.12％，据此可知，在蛋白纯化过程中采用0.20-0.80μm滤膜过滤后，蛋白纯化的效果最佳。
实施例5滤膜过滤对目的蛋白纯化的影响-2
本实施例将目的蛋白纯化过程中未采用滤膜以及采用不同粒径滤膜的过滤方式对目的蛋白纯化的影响进行了比较。具体实施方法如下所述:
表6实施例5检测结果
滤膜粒径
方案① 0.22μm
方案② 0.10μm
方案③ 0.30μm
方案④ 0.80μm
方案⑤ 2.50μm
注：方案①技术方案与实施例1相同；方案②-⑤增加了利用不同粒径滤膜过滤的步骤，具体实验方法为：将实施例1中第1步得到的上清过滤膜，收集滤液继续实施例第1步的实验操作。
收集上述方案①-⑤纯化后的目的蛋白样品，并进行检测，检测结果如下表所述：
表7实施例5检测结果
方案① 方案② 方案③ 方案④ 方案⑤
总蛋白(mg) 5.27 3.01 4.99 5.02 5.95
总活力(U) 7520 2524 6528 6985 2852
回收率(％) 64.90 21.78 56.34 60.28 24.61
将使用上述五种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现，目的蛋白经过粒径大小为 0.22μm、0.30μm以及0.80μm的滤膜过滤后，目的蛋白回收率最高，分别为64.90％、56.34％以及60.28％，据此可知，在蛋白纯化过程中采用0.20-0.80μm滤膜过滤后，蛋白纯化的效果最佳。
实施例6pH值对目的蛋白纯化的影响-1
本实施例将目的蛋白纯化过程中采用不同pH值的EGTA进行透析处理对目的蛋白纯化 C1q影响进行了比较。具体实施方法如下所述：
表8实施例6检测结果
透析用EGTA溶液pH值
方案① 5
方案② 6
方案③ 7
方案④ 7.5
方案⑤ 8
方案⑥ 9
注：方案④技术方案与实施例1相同；方案①-③以及⑤-⑥除使用的EGTA透析溶液pH 值与实施例1不相同，其余操作步骤与实施例1完全相同。
收集上述方案①-⑥纯化后的目的蛋白样品，并进行检测，检测结果如下表所述：
表9实施例6检测结果
方案① 方案② 方案③ 方案④ 方案⑤ 方案⑥
总蛋白(mg) 4.96 5.15 5.09 5.43 5.15 4.25
总活力(U) 3952 4152 4525 6982 6582 3250
回收率(％) 34.11 35.83 39.05 60.26 56.81 28.05
将使用上述六种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现，目的蛋白经过不同pH值的EGTA溶液透析后，目的蛋白的回收率在EGTA溶液pH值为5-7时呈逐步上升的趋势，在pH值为7.5时达到峰值，随后随着pH值的增大，蛋白浓度逐渐减小。同时，蛋白活性测定的结果也呈现相同的趋势，在pH值为7.5时峰值最高。推测其原因，可能是在血液中存在大量其他种类的蛋白质，其中大部分为IgG和IgM，而在pH值为7.5时，此pH值偏离了所混有的Ig的等电点，因而大部分的Ig处于溶解状态，且此时的pH值略接近于C1q的等电点，故血液中的C1q能较易被沉淀下来。而在pH值大于8时，由于整个体系处于碱性状态下，容易对血清中的稳定性产生影响，此时得到的沉淀中大部分属于杂质蛋白。
实施例7pH值对目的蛋白纯化的影响-2
本实施例将目的蛋白纯化过程中采用不同pH值的EDTA进行透析处理对目的蛋白C1q 纯化的影响进行了比较。具体实施方法如下所述：
表10实施例7检测结果
透析用EDTA溶液pH值
方案① 6
方案② 7
方案③ 7.5
方案④ 8
方案⑤ 8.5
方案⑥ 9
注：方案④技术方案与实施例2相同；方案①-③以及⑤-⑥除使用的EDTA透析溶液pH 值与实施例2不相同，其余操作步骤与实施例2完全相同。
收集上述方案①-⑥纯化后的目的蛋白样品，并进行检测，检测结果如下表所述：
表11实施例7检测结果
实施例7 方案① 方案② 方案③ 方案④ 方案⑤ 方案⑥
总蛋白(mg) 4.62 4.79 5.26 5.33 4.69 4.63
总活力(U) 4025 4250 5692 7102 6520 2352
回收率(％) 34.74 36.67 49.12 61.29 56.27 20.30
将使用上述六种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现，目的蛋白经过不同pH值的EGTA溶液透析后，蛋白浓度(蛋白纯度)在EGTA溶液pH值为5-8时呈逐步上升的趋势，在pH值为8时达到峰值，随后随着pH值的增大，蛋白浓度逐渐减小。同时，蛋白活性测定的结果也呈现相同的趋势，在pH值为8时峰值最高。推测其原因，可能是在血液中存在大量其他种类的蛋白质，其中大部分为IgG和IgM，而在pH值为8时，此pH值偏离了所混有的Ig的等电点，因而大部分的Ig处于溶解状态，且此时的pH值接近于C1q的等电点，故血液中的C1q能都被沉淀下来。而在pH值大于8时，由于整个体系处于碱性状态下，容易对血清中的稳定性产生影响，此时得到的沉淀中大部分属于杂质蛋白。
实施例8透析溶液EGTA浓度对目的蛋白纯化的影响-1
本实施例将目的蛋白纯化过程中采用不同浓度的EGTA透析溶液对目的蛋白C1q纯化的影响进行了比较。具体实施方法如下所述：
表12
Figure BDA0002599094770000101
Figure BDA0002599094770000111
注：方案④技术方案与实施例1相同；方案①-③以及⑤-⑥除使用的EGTA透析溶液浓度与实施例1不相同，其余操作步骤与实施例1完全相同。
收集上述方案①-⑥纯化后的目的蛋白样品，并进行检测，检测结果如下表所述：
表13实施例8检测结果
实施例8 方案① 方案② 方案③ 方案④ 方案⑤ 方案⑥
总蛋白(mg) 3.56 4.20 5.21 5.25 4.65 4.07
总活力(U) 4025 4452 5024 6525 5103 3956
回收率(％) 34.73 38.42 43.36 56.31 44.04 34.14
将使用上述六种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现，目的蛋白经过不同浓度的 EGTA溶液透析后，蛋白回收率在EGTA溶液浓度为30mM时达到峰值，在5-30mM以及30-50mM的浓度范围内，各项指标均呈现下降趋势。据此可知，在透析液EGTA浓度为30mM时，蛋白纯化的效果最佳。
实施例9透析溶液EDTA浓度对目的蛋白纯化的影响-2
本实施例将目的蛋白纯化过程中采用不同浓度的EDTA透析溶液对目的蛋白C1q纯化的影响进行了比较。具体实施方法如下所述：
表14
Figure BDA0002599094770000112
Figure BDA0002599094770000121
注：方案②技术方案与实施例2相同；方案①以及③-⑥除使用的EDTA透析溶液浓度与实施例2不相同，其余操作步骤与实施例2完全相同。
收集上述方案①-⑥纯化后的目的蛋白样品，并进行检测，检测结果如下表所述：
表15实施例9检测结果
实施例9 方案① 方案② 方案③ 方案④ 方案⑤ 方案⑥
总蛋白(mg) 4.69 5.65 5.21 4.02 4.26 3.96
总活力(U) 5690 7026 5585 4256 4852 4025
回收率(％) 49.11 60.64 48.20 36.73 41.87 34.73
将使用上述六种技术方案得到的检测结果进行比对分析发现，目的蛋白经过不同浓度的EDTA溶液透析后，蛋白回收率在EDTA溶液浓度为10mM时达到峰值，在浓度为5mM以及20-50mM范围内，各项指标的值都较低。据此可知，在透析液EDTA浓度为10mM时，蛋白纯化的效果最佳。

Claims (9)

1.一种纯化C1q蛋白的方法，其特征在于，所述方法为采用低盐离子透析、强阳离子交换柱层析以及硫酸铵沉淀进行蛋白纯化，所述强阳离子交换柱的填料选自UniGel-30SP、UniGel-50SP或UniGel-80SP中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低盐离子透析包括以下步骤：
(1)预处理：将样本置于4℃，8000-12000g离心20-30min，弃沉淀；
(2)透析：将上清透析于低盐离子溶液中；
(3)过滤：收集透析后的上清，过滤膜，收集滤液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的低盐离子溶液为pH7-8、20-30mM的EGTA溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的低盐离子溶液为pH7-8、6-12mM的EDTA溶液。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的滤膜粒径大小为0.2-2μm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述强阳离子交换柱层析包括以下步骤：
(1)柱平衡：用2M NaCl与水洗涤柱子，之后用平衡缓冲液A进行平衡；
(2)上样：将低盐离子溶液透析后样品加载到平衡后的柱子中，流速度控制在140-160cm/h；
(3)平衡：用平衡缓冲液A继续冲洗柱子，使未结合的组分从柱子上分离；
(4)洗脱：用洗脱缓冲液B进行洗脱，使结合后的目的蛋白被充分洗脱下来，收集洗脱液并保存。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中平衡缓冲液为pH7.0-8.0 20mM的PBS，所述洗脱缓冲液B为平衡缓冲液A中补加350mM NaCl。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀包括以下步骤：
(1)在强阳离子交换柱层析后样品中加入饱和(NH4)2SO4至终浓度为30％-40％，2-6℃下静置6-8min，8000-12000g离心6-8min，收集沉淀；
(2)用保存缓冲液C溶解沉淀，并于2-6℃下透析于保存缓冲液C中，透析后溶液即为目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的保存缓冲液为0.75MNaCl、0.02M acetate buffer、0.01M EDTA，pH 7.5的溶液。
CN202010718525.4A 2020-07-23 2020-07-23 一种纯化C1q蛋白的方法 Active CN113968900B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010718525.4A CN113968900B (zh) 2020-07-23 2020-07-23 一种纯化C1q蛋白的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010718525.4A CN113968900B (zh) 2020-07-23 2020-07-23 一种纯化C1q蛋白的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113968900A true CN113968900A (zh) 2022-01-25
CN113968900B CN113968900B (zh) 2023-07-25

Family

ID=79585337

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010718525.4A Active CN113968900B (zh) 2020-07-23 2020-07-23 一种纯化C1q蛋白的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113968900B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1396176A (zh) * 2001-07-06 2003-02-12 阿尔法·瓦瑟曼公司 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
WO2003027139A2 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Novel purified polypeptides involved in membrane biosynthesis
CN1587275A (zh) * 2004-07-13 2005-03-02 福建师范大学 一种微藻藻红蛋白分离纯化技术
CN101182504A (zh) * 2007-11-12 2008-05-21 惠静璇 一种冬瓜蛋白酶的纯化方法
CN102206282A (zh) * 2011-03-29 2011-10-05 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种高效生产Trx-hCTRP2的方法
US20150329606A1 (en) * 2012-10-09 2015-11-19 Commissariat A L' Energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for preparing c1q recombinant protein
CN106478810A (zh) * 2016-12-09 2017-03-08 合肥工业大学 一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法
CN111116704A (zh) * 2020-02-24 2020-05-08 中国科学院长春应用化学研究所 一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1396176A (zh) * 2001-07-06 2003-02-12 阿尔法·瓦瑟曼公司 通过阳离子交换层析纯化药物活性蛋白的方法
WO2003027139A2 (en) * 2001-09-24 2003-04-03 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Novel purified polypeptides involved in membrane biosynthesis
CN1587275A (zh) * 2004-07-13 2005-03-02 福建师范大学 一种微藻藻红蛋白分离纯化技术
CN101182504A (zh) * 2007-11-12 2008-05-21 惠静璇 一种冬瓜蛋白酶的纯化方法
CN102206282A (zh) * 2011-03-29 2011-10-05 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种高效生产Trx-hCTRP2的方法
US20150329606A1 (en) * 2012-10-09 2015-11-19 Commissariat A L' Energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Method for preparing c1q recombinant protein
CN106478810A (zh) * 2016-12-09 2017-03-08 合肥工业大学 一种同时分离纯化试剂级的藻蓝蛋白与别藻蓝蛋白的方法
CN111116704A (zh) * 2020-02-24 2020-05-08 中国科学院长春应用化学研究所 一种大批量纯化克级力学功能蛋白的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A J TENNER ET AL.: "Purification and radiolabeling of human C1q", 《J IMMUNOL》, vol. 127, no. 2, pages 648 - 653 *
D A POHL ET AL.: "Isolation and purification of human C1q from plasma", 《J IMMUNOL METHODS》, vol. 36, no. 1, pages 13 - 27, XP023667268, DOI: 10.1016/0022-1759(80)90090-3 *
李洪波: "C１ｑ／ＴＮＦα相关蛋白－１功能区的表达、纯化及生物活性分析", 《中国医院药学杂志》, vol. 35, no. 3, pages 194 - 197 *
王雄: "以高pH沉淀优球蛋白分离Clq", 《国外医学.生物制品分册》, vol. 1982, no. 2, pages 96 *
蒋佳宏: "贻贝珍珠质蛋白Ｃ１Ｑ结构域的异源表达", 《北京师范大学学报》, vol. 51, no. 6, pages 586 - 590 *
陈伟杰: "菠萝皮蛋白酶的制备、特性及应用的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (工程科技Ⅰ辑)》, pages 024 - 124 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113968900B (zh) 2023-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105153297B (zh) 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法
Connell et al. The purification of haptoglobin
US6893639B2 (en) Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates
US10981975B2 (en) Method for efficient purification of human serum albumin
US9145448B2 (en) Method for the isolation of haptoglobin
FR2676231A1 (fr) Concentre de facteur xi de la coagulation sanguine a haute activite specifique, approprie a usage therapeutique et son procede de preparation.
CN113968900A (zh) 一种纯化C1q蛋白的方法
JP2023515123A (ja) アダリムマブのｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａ精製方法
CN112480246A (zh) 一种犬免疫球蛋白的分离纯化方法及其应用
SU1600633A3 (ru) Способ очистки белкового токсина бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS
CN109206507B (zh) 一种从虾夷扇贝中同时提取两种亚型金属硫蛋白的方法
CN109535248A (zh) 洗涤缓冲液及采用该洗涤缓冲液提纯牛血红蛋白的方法
US20230079633A1 (en) Optimized method for bevacizumab purification
AU2021414086A1 (en) Systems and Methods for Process Scale Isolation of Immunoglobulin G
US20140124448A1 (en) IMMUNOAFFINITY SEPARATION MATERIALS COMPRISING ANTI-IgE ANTIBODY DERIVATIVES
JP5931363B2 (ja) タンパク質の精製方法
CN112409476B (zh) 四种血液来源蛋白的纯化方法
JP2014529330A (ja) 単一ユニットクロマトグラフィー抗体精製
JP2017025025A (ja) タンパク質の精製方法
JP2012112930A (ja) 高分子量物質の精製方法
JP4154743B2 (ja) インターロイキン６レセプターの精製方法
CN117866080A (zh) 一种快速从牛初乳中制备高纯度分泌型免疫球蛋白a的方法
EP2961760A1 (en) Selective removal of a protein from a mixture of proteins using activated carbon by adjusting solution conditions
CN116606370A (zh) 一种天然IgM纯化的方法
KR0137855B1 (ko) 저분자량-우로가스트론의 정제방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant