KR0137855B1 - 저분자량-우로가스트론의 정제방법 - Google Patents
저분자량-우로가스트론의 정제방법Info
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Abstract
본 발명은 사람이나 동물의 뇨를 흡착제를 사용한 흡착, 에탄올-분별침전, 다단계 이온교환 컬럼크로마토그래피 및 항-EFG 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 행함으로써 저분자량의 우로가스트론을 전제하는 방법에 있어서, 에탄올 분별침전후, 상대적으로 간단한 공정인 추출 및 한외여과단계, 일단계의 컬럼크로마토그래피, 아세톤 침적, 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 거치므로써 컬럼크로마토그리피공정을 최소화하여 저분자량-우로가스트론을 고수율로 간편하게 정제하는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론정제방법에 관한 것이다.
Description
제1도는 표준 시료(Standard EGF)로부터 구한 검량선을 나타낸 도면이고,
제2도는 정제단계로부터 얻어진 분획의 전기영동 사진을 나타낸 도면이다.
본 발명은 분자량 6,000의 저분자량의 우로가스트론(Urogastron) 정제 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 사람이나 동물의 뇨를 흡착제를 사용한 흡착, 에탄올-분별침전, 다단계 이온교환 컬럼크로마토그래피 및 항-EGF 컬럼크로마토그래피등의 과정을 순차적으로 수행하여 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론을 정제하는 방법에 있어서, 에탄올-분별침전후, 상대적으로 간단한 공정인 추출 및 한외여과 단계, 일단계의 컬럼크로마토그래피, 아세톤 침적, 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 행함으로써 컬럼크로마토그래피공정을 최소화하여 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론을 고수율 및 고순도로 간편하게 정제하는 것을 특징으로하는 저분자량-우로가스트론 정제방법에 관한 것이다.
사람이나 동물의 뇨에 존재하는 것으로 공지되어 있는 우로가스트론은 분자량 36,000이상, 분자량 6,000등의 다양한 종류로 존재한다. 이중, 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론은 3개의 디설파이드 결합(disulfide bond)을 가지고 있는 53개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 탄수화물 분획이 없는 것이 특징이다. 또한 저분자량-우로가스트론은 아미노산, 말단의 아르기닌 잔기의 유무에 따라 β-우로가스트론, γ-우로가스트론으로 분류하기도 한다. 여기서 β-우로가스트론은 사람의 표피증식인자(Epidermal Growth Factor)와 동일한 것으로서, 이러한 표피세포증식을 촉진하는 작용을 이용하여 상처 및 화상의 치료, 안과수술후 처리, 당뇨성 궤양치료, 피부이식, 무혈청 배지등에 사용될 수 있다.
뇨로부터 저분자량의 우로가스트론을 분리정제하는 종래의 방법으로는 단순히 등전점에 기초하여 용매의 pH를 변화시켜 저분자량의 우로가스트론을 분리정제한 이래로(일본특허공개 소 제33-12744호), 다수의 저분자량의 우로가스트론 정제방법이 발표되어 왔다.
이들은 주로 흡착제를 사용하여 저분자량의 우로가스트론을 함유한 분획을 흡착시켜 불필요한 단백질을 제거한 후, 이를 일정한 용매에 용해시켜 다단계의 이온교환크로마토그래피를 행하여 정제하는 방법이다.
예를 들면, 사람의 뇨를 Bio-Rex 70 이온교환수지로 처리한 후, 그 용출액에 에탄올을 가하여 조우로가스트론을 회수하고 DE-52 셀룰로오스 컬럼 및 Bio-Gel P-10 컬럼을 통과시켜 처리한 다음, CH-52 셀룰로오스에 흡착시킨 후, 이를 다시 DE-52 셀룰로오스크로마토그래피에 의해 저분자량의 우로가스트론을 정제하는 방법(C, Richard Savage, JR. and robert Harper, Analytical Biochemistry, 111, 195-202, 1981)이나 저분자량의 우로가스트론을 함유하는 시료로부터 역-액상분액 액체 크로마토그래피(reverse-phase HPLC Chromatography)를 사용하여 저분자량의 우로가스트론을 정제하는 방법(일본 특허공개소 제60-16193호), 뇨를 벤조산으로 흡착시켜 저분자량이 우로가스트론 분획을 침전시킨 후, CM-셀룰로오스, DEAE-셀룰로오스, Bio-GelP-10크로마토그래피, 역-액상분배크로마토그래피(reverse-phase HPLC chromatography)를 순차적으로 사용하는 저분자량의 우로가스트론을 분리하는 방법등이 있다.(Charles D. Mount, et. al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 240, No.1, July, pp.33-42, 1985). 이 밖에도, 저분자량의 우로가스트론을 정제하기 위한 다른 방법으로서 단세포 항체(Monoclonal antibody)를 이용하는 방법도 있다.(P.H. Hissey, et. al., Journal of Immunological Methods, 78, 211-216, 1985, Debra M. Moriarity, et. al., Hybridoma, Vol. 2, No.3, 1983).
그러나, 상기한 종래의 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론(이하, LMW-EGF라 한다)의 정제방법은 컬럼크로마토그래피단계를 여러번 거쳐 제조되기 때문에 공정이 매우 복잡할 뿐 아니라, 그러한 공정을 거쳐 제조하는 경우에도 정제수율이 매우 낮아 다양한 응용가능성을 가지고 있는 LMW-EGF를 실제로 제품화하는데 있어서 어려움이 따를 뿐 아니라, 제품의 가격을 올리는 효과를 가져오게 된다.
따라서 본 발명자들은 종래의 LMW-EGF 정제방법중 컬럼크로마토그래피공정을 최소화하여 정제방법을 간단히하고, 정제수율을 높이고자 연구를 거듭한 결과, 정제과정에서 간단한 공정인 추출 및 한외여과과정을 도입합으로써, 종래의 정제방법에 비해 간단한 공정으로 고수율의 LMW-EGF를 정제하는 방법을 제공하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 사람 또는 동물의 뇨를 흡착제를 사용한 흡착, 에탄올 분별침전, 다단계 이온교환 컬럼크로마토그래피, 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 행하여 저분자량-우로가스트론(LMF-EGF)를 정제하는 방법에 있어서, 에탄올 분별침전후, 회수된 침전물을 pH8.0-10.0하에서 추출한 뒤, 분자량 컷오프(Molecular cut off) 30,000의 여과막으로 한외여과하고, 그 여과액(filtrate)을 분자량 컷오프(Molecular cut off) 3,000의 여과막으로 한외여과하여 농축물을 얻은 다음, 일단계의 이온 교환 컬럼크로마토그래피, 아세톤 침적; 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론(LMW-EGF)의 정제 방법에 관한 것이다.
한외여과공정을 도입함으로써 컬럼크로마토그래피 공정을 최소화한 본 발명에 따른 LMF-EGF 정제방법은 다음의 5단계에 의하여 제조되며, 이를 상세히 설명하면 다음과 같다.
(a) 사람 또는 동물의 뇨를 흡착제를 사용한 흡착 및 35-45%의 에탄올 분별침전.
(b) pH8.0-pH10.0이하에서 추출.
(c) 분자량 컷오프(Molecular cut off) 30,000의 여과막으로 한외여과.
(d) DEAE-세파셀 음이온교환수지를 사용한 컬럼크로마토그래피
(e) 아세톤에 침적 및 항-EGF 컬럼크로마토그래피
본 발명에 따른 LMF-EGF의 정제방법을 단계별로 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계
채집한 사람 또는 동물의 뇨에 우선 빙초산 용액을 가하여 pH를 4.0-5.0으로 조정하고 뇨중에 함유된 단백질을 안정화시키고 부패를 방지하기 위하여 이를 냉각시킨 후, 흡착제를 사용하여 LMW-EGF를 함유한 분획을 분리한다.
냉각된 뇨중에서 LMW-EGF을 포함한 단백분획을 분리하기 위해서는 1차적으로 흡착제를 사용한다.
흡착제는 우로가스트론을 포함한 단백질 분획은 흡착시키고, 나머지 불순 단백질은 흡착시키지 않는 것으로서 벤조산, 실리카겔, 카올린등이 알려져 있으나, 산성용액에서도 흡착력이 우수하고, 흡착된 단백질 분리에 용이하다는 점에서 벤조산이 본 발명에 바람직하다.
여기서 빙초산에 의해 pH를 조정하는 이유는 LMW-EGF의 pH값이 약 4.0-5.0이므로 이를 흡착시켜분리하기 위해서는 부분전하(net charge)를 0으로 하여야 하기 때문이다. 벤조산-흡착 침전물은 이를 원심분리하면 분리해낼 수 있다.
원심분리하여 얻은 침전물은 아세톤으로 세척, 건조하여 벤조산 및 함유수분을 제거하고 이를 에탄올로 분별침전한다. 여기서 에탄올의 농도가 약 35-45%일 때, LMW-EGF 분획이 침전되므로 에탄올의 농도는 35-45%가 바람직하다.
에탄올에 의한 분별침전과정에서 얻어진 침전물은 원심분리하고, 이를 건조하면 조우로가스트론분말을 얻을 수 있다.
(b) 단계
(a) 단계에서 얻은 조우로가스트론 분말은 적당한 pH를 유지하면서 증류수 또는 적당한 pH를 갖는 완충액으로 추출한다. 이때 LMW-EGF는 pH8.0-10.0에서 용출되므로 완충액의 pH는 8.0-10.0이 바람직하며, 증류수를 가한 후 약 3분간 추출한 후, 4℃에서 12시간이상 방치한 다음, 원심분리하여 상층액(supernatant)을 취한다.
(c) 단계
(b) 단계에서 얻은 상층액은 한외여과를 실시하여 저분자량의 우로가스트론과 고분자량의 우로가스트론과 고분자량의 우로가스트론을 분리한다. 고분자량의 우로가스트론은 분자량이 약 36,000이상이고, 분리하고자 하는 LMW-EGF는 분자량이 약 6,000이므로 분자량 컷 오프(cut off) 30,000의 여과막을 사용하여 한외여과하면 손쉽게 이들을 분리할 수 있다.
한외여과하여 얻은 여과액(filtrate)은 분자량 컷오프(cut off) 3,000의 여과막으로 한외여과하여 농축하는 것이 수율상 바람직하다. 여기서 LMW-EGF는 분자량이 6,000이고, LMW-EGF의 회수 및 공저의 간편성을 위하여 농축을 위한 여과막으로는 분자량 컷오프(Molecular cut off) 3,000의 여과막이 바람직하다.
상기의 농축물은 다음 공정이 이온 교환 컬럼크로마토프래피공정을 수행할 수 있으나, 대량생산(scale-up)하는 경우 아세톤이나 황사암모눔으로 단백질 침전물을 회수하여 뇨속의 많은 색소를 제거함으로써 더욱 정제된 LMW-EGF 분획을 얻을 수 있으며, 이온교환수지를 장기간 효과적으로 사용할 수 있다.
(d) 단계
(c) 단계에서 얻어진 농축물은 이온교환수지를 통과시켜 더욱 정제된 LMW-EGF을 얻는다. 여기서 이온교환수지로는 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지 모두를 사용할 수 있으나 양이온 교환수지를 사용할 경우 불순물로 함유될 수 있는 태반성성선자극호르몬(Human chorigonadotropin, HCG)의 배제가 어렵고, 컬럼에 LMW-EGF를 결합시키기 위하여 사용되는 낮은 pH조건(pH4.0이하)에서 침전이 형성되어 작업조건 및 회수율면에서 불리하므로 음이온 교환수지가 바람직하다.
또한 음이온 교환수지중에서도 DEAE-세파셀겔로 이루어진 컬럼은 DEAE-세파로스겔로 이루어진 컬럼에 비하여 약 3배의 높은 결합능(binding capacity)을 가지고 있을 뿐 아니라, 상대적으로 높은 농도의 단백질 수용액(20-30㎎/㎖)을 컬럼에 로딩(loading)할 수 있어 적은 부피의 겔에 많은 양의 단백질 수용액을 로딩하여 농축된 용출액을 얻을 수 있기 때문에 공정의 간소화면에서 DEAE-세파셀 컬럼이 본 발명에 바람직하다.
(c) 단계에서 얻어진 농축물은 pH8.5의 0.05M의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl)에 용해시켜 사용하며, 컬럼은 크로마토그래피를 수용하기 전에 0.05M의 트리스-염산과 0.05M의 NaCl로 이루어진 pH8.0의 완충액으로 평행시켜야 한다. 용출액은 0.1M의 트리스-염산과 0.3M의 NaCl로 이루어진 pH8.0의 완충액이 바람직하다.
상기의 컬럼크로마토그래피를 수행한 LMW-EGF 분획은 대량생산시에는 분자량 컷오프(molecular cut off) 3,000의 여과막으로 한외여과하여 농축함으로써 다음 공정에 보다 효율적으로 적용할 수 있으며 또한 더욱 효과적으로 정제할 수 있다.
(e) 단계
이온교환 컬럼크로마토그래피를 수행하여 얻어진 LMW-EGF 분획은 아세톤에 침적하여 침전물을 회수한 다음, 생리식염수로 추출한 뒤, 생리식염수로 평형시킨 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 수행한다. 항원-항체 반응은 생리적 조건인 pH7.2에서 가장 이상적이므로 추출용매로는 생리식염수가 가장 바람직하다.
항-EGF 컬럼이란 단세포 항체 또는 다세포항체(polyclonal antibody)를 세파로스겔에 화학적으로 결합시켜 제조된 컬럼을 말한다. 본 발명에서는 단세포 항체 컬럼을 사용할 수 있으나, 그 제조가 어렵고, 시간이 많이 소요될 뿐 아니라, 제조가 용이한 다세포 항체를 사용하여 정제한 경우에도 실시예 및 시험예에서 보는 바와 같이, 정제수율 및 정제도가 우수하기 때문에 간단하고 고수율의 LMW-EGF 정제방법을 제공하는 것이 목적인 본 발명에서는 다세포항체 컬럼크로마토그래피를 사용하는 것도 무방하다.
다세포 항체를 제조하는 방법은 공지의 방법에 의하여 제조할 수 있으며, 본 발명에서 사용된 제조방법은 다음과 같다. EGF 일정량을 생리식염수에 용해하여 프로인드보조액(Freunds Adjuvant)에 혼합하여 유화(emulsifying)한 후 , 토끼등에 10일 간격으로 4차례 피하주사한 다음 10일 후에 혈액을 취하여 혈청을 얻어 항체형성을 확인한다. 항체형성의 확인후, 생리식염수에 녹인 EGF를 토끼귀에 정맥주사한 후 7일 후에 혈액을 취하면, 항-EGF 혈청을 얻을 수 있다.
항-EGF 컬럼크로마토그래피를 수행하기 위해서는 미리 컬럼을 생리식염수로 평형시켜야 하며, 항체에 결합된 항원에 대한 친화력의 감소를 유발시키기 위한 용출액은 pH2.5의 0.1M 글라이신 완충액이 바람직하다.
상기의 공정에 의하여 LMW-EGF를 정제하는 본 발명은 종래의 컬럼크로마토그래피에 의한 공정을 여러번 반복하여 LMW-EGF를 정제함으로써 공정이 복잡하고, 수율이 낮은 정제방법에 비하여 컬럼크로마토그래피 공정을 최소화함으로써 상대적으로 간단한 공정에 의하여 LMW-EGF를 분리정제할 수 있을 뿐 아니라, 다음의 실시예 및 시험예에 확인될 수 있는 바와 같이, 고수율로 LMW-EGF를 분리정제할 수 있다.
본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명이 이제 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
(a) 단계
사람의 뇨 2,000L에 빙초산 용액 6L를 가하여 pH를 4.8로 조정하고, 이를 냉각시킨 후, 벤조산 70㎏을 가하여 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물을 아세톤 310L로 3회 세척하고 이를 건조한 다음, 40% 에탄올이 함유된 완충용액 12L에 용해시킨 후, 10,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 회수한 다음, 건조시켜 조우로가스트론분말을 얻었다.
[실시예 2]
(b) 단계
조우로가스트론 분말 1,000g에 증류수 20L를 가한 후 pH 8.5로 유지하면서 30분간 교반시킨 다음, 4℃에서 12시간 방치하여 추출했다. 방치하여 얻은 추출액은 10,000rpm으로 10분간 원심분리하였다.
[실시예 3]
(c) 단계
원심분리하여 얻은 상층액을 분자량 컷 오프(Cut off) 3,000의 여과막으로 한외여과한 다음, LMF-EGF를 함유한 여과액(filtrate)을 분자량 컷 오프(Cut off) 3,000의 여과막으로 한외여과하여 2L까지 농축한 후 10L의 아세톤을 가해 건조하여 분획분말 6.4g을 얻었다.
[실시예 4]
(d) 단계
한외여과하여 농축한 LMW-EGF 함유분획 1g을 pH 8.5, 0.05M 트리스-염산 완충액 500㎖에 용해시킨 뒤, 0.05M의 NaCl이 함유된 pH8.0, 0.05M 트리스-염산 완충액으로 평형시킨 DEAE-세파셀 겔로 이루어진 컬럼에 로딩(loading)한 후, 0.3M의 NaCl이 함유된 pH8.0, 0.1M 트리스-염산 완충액으로 30㎝/hr의 속도로 용출시켰다.
[실시예 5]
(e) 단계
이온교환수지 컬럼을 통한 LMW-EGF분획(250㎖)에 1250㎖의 아세톤을 가하여 침전물을 회수한 다음, 생리식염수 50㎖로 추출한 후, 생리식염수로 평형시킨 항-EGF 친화성 컬럼에 로딩(loading)하여 결합시킨 뒤, pH2.4, 0.1M 글라이신 완충액으로 120㎖/hr의 속도로 용출시킨 다음 즉시 pH8.5, 1.0M 트리스 -염산 완충액을 가하여 중성으로 pH를 맞추었다.
상기의 실시예로부터 얻어진 LMW-EGF는 그 정제도는 다음의 시험예 1의 방법으로 측정했으며, 정제효과는 시험예 2의 방법으로 전기영동 시험을 하여 측정했다.
[시험예 1]
EGF 정량용 시약키트(EGF reagent pack for RIA, Cat. No. IM1961, Amersham Com.)를 사용하여 지지농도의 표준시료(Standard EGF)를 사용하여 검량선(Standard curve)을 구하였다.(제1도)
상기 실시예에서 얻어진 분획 각각에 대하여 총단백질량을 산출하였고, EGF 정량용 시약키트를 사용하여 검량선(제1도)로부터 LMW-EGF총량을 구하여 정제도를 계산하였다. 그 결과는 표 1과 같다
표 1
*정제도 : 단백질 1㎎중에 함유된 LMW-EGF의 ㎍.
상기 표에서(1)은 실시예 3에서 얻어진 분말중 1g을 취하여 500㎖의 0.05M 트리스 완충액에 용해시킨 후, 다시 이로부터 0.1mL를 취하여 20배로 희석하고 분광분석계(Spectrophotometer)로 280㎚에서 흡광도를 측정하여 단백질양을 산출하였다(흡광도 1은 1㎎/㎖의 단백농도를 의미한다). (2)는 실시예 4에서 얻어진 용출액으로부터 0.1mL을 취하여 10배 희석후, (1)과 동일한 방법으로 단백질양을 산출하였고,(3)은 실시예 5에서 얻은 용출액으로부터 1mL를 취하여 분광분석계로 (1)과 동일한 방법으로 단백질양을 산출하였다.
상기 표 1의 결과로부터 확인할 수 있듯이 최종적으로 항-EGF 컬럼을 통과시킨 경우, 고순도의 LMW-EGF을 고수율로 얻을 수 있다.
[시험예 2]
30% 아크릴 아미드용액과 2.7% N,N-메틸렌-비스아크릴아미드 용액을 이용하여 5.6%의 스택킹 겔(stacking gel)과 15% 분리겔(Separation gel)을 분비한 후, 실시예의 각 단계로부터 얻어진 분획을 전기영동법으로 정제도를 확인하여 제2도에 나타내었다
제2도에서 보는 바와 같이, 최종 정제단계인 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 통한 후, 얻어진 용출액은 정제도가 매우 우수한 것을 알 수 있다.
Claims (5)
- 사람 또는 동물의 뇨를 흡착제를 사용한 흡착, 에탄올 분별침전, pH 8.0-10.0 하에서 추출, 한외여과, 일단계이온교환 컬럼크로마토그래피, 아세톤 침적, 항-EGF 컬럼크로마토그래피를 순차적으로 행하는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론(LMW-EGF)의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 한외여과시 분자량 컷 오프(Molecular cut off) 3,000의 여과막으로 한외여과하는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론(LMW-EGF)의 정제방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 한외여과후 그 여과액(filtrate)을 분자량 컷 오프(Molecular cut off) 3,000의 여과막으로 더욱 한외여과하는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론(LMW-EGF)의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 이온교환 컬럼크로마토그래피 단계가 0.05M의 트리스-염산과 0.05M의 NaCl로 이루어진 pH8.0의 완충용액으로 평형시킨 DEAE-세파셀겔 컬럼크로마토그래피이고, 0.1M의 트리스-염산과 0.3M의 NaCl로 이루어진 pH8.0의 완충액으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량 -우로가스트론(LMW-EGF)의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 항-EGF-컬럼크로마토그래피공정이 생리식염수로 평형시킨 저분자량-우로가스트론(LMW-EGF)에 대한 다세포항체 컬럼크로마토그래피이고, pH2.5, 0.1M 그랄이신 완충액으로 용출시키는 것을 특징으로 하는 분자량 6,000의 저분자량-우로가스트론(LMW-EGF)의 정제방법.
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