KR0140261B1 - 혈소판 응집 효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

혈소판 응집 효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질 및 그의 제조방법

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Abstract

본 발명은 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura)환자의 혈장으로부터 분리한 분자량 37kDa의 단일 펩타이드로 구성되고 혈소판 응집 효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질 및 황산 암모늄 침전, 투석, DEAE-세파셀(Sephacel)컬럼 크로마토그래피, 콘(Con) A-세파로즈(Sepharose)컬럼 크로마토그래피 및 슈퍼로즈(Superose)12젤 여과 크로마토그래피 단계를 포함하는 상기 단백질의 분리 정제 방법에 관한 것이다.

Description

혈소판 응집 효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질 및 그의 제조 방법.
제1도는 혈소판 응집 단백질의 혈소판 응집효과를 나타낸 것이고,
제2도는 콘(Con)A- 세파로즈(Sepharose)컬럼 크로마토그래피에 의한 정제과정 중 본 발명의 단백질의 용출 프로필(profile)을 나타낸 것이고,
제3도는 본 발명의 단백질과 트롬빈의 구조적 상이성을 확인하기 위한 SDS-폴리아크릴 아미드 젤 전기영동 분석의 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 혈전성 혈소판 감소성 자반증(thrombotic thrombocytopenic purpura, 이하 'TTP'라 함) 환자의 혈장으로부터 분리한 트롬빈 유사 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, TTP환자의 혈장으로부터 분리한 분자량 37kDa의 단일 펩타이드로 구성되고 혈소판 응집 효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질 및 황상 암모늄 침전, 투석 및 콘 A-세파로즈 크로마토그래피 등 여러 단계를 포함하는, TTP환자의 혈장으로부터 상기 단백질을 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.
혈전성 혈소판 감소성 자반증은 신경학적 증세, 혈소판 감소증, 미세혈관 용혈성 빈혈, 발열, 신기능 장에 등의 임상 증후군을 보이며 이러한 임상 증후군의 전형적인 병리학적 병변은 미세혈관에 초자양 물질의 침착으로 인한 폐쇄가 전신적으로 광범위하게 존재하는 것이다. 그의 발병 원인에 대해서는 여러가지 가설이 제시되고 있으나 아직 정확한 원인이 밝혀지지 않았으며 근래에는 발병 원인 중의 하나로 혈소판 응집에 대한 연구가 진행중이다. 이 혈소판 응집 단백질은 시디퀴(Siddiqui)와 라이안 (Lian)에 의해 분리 정제되었으며, 분자량이 37kDa인 당단백질임이 보고되었다(Siddiqui F. A. Lian E. C. Y., J. Clin. Invest., 76, 1330(1985)).
본 발명자들은 이러한 발병의 원인을 해결하기 위하여 TTP환자의 혈자으로부터 혈소판 응집 효과르 나타내는 단백질을 분리하기 위해 노력한 결과, 트롬빈과, 유사한 아미노산 서열을 갖는 신규 단백질을 분리 정제하였다.
본 발명자에 의해 분리 정제된 트롬빈 유사 단백질은 시디퀴와 라이안에 의해 보고된 혈소판 응집 단백질과 활성면에서는 매우 유사하였으나 콘카나발린(concanavalin) A에 대한 결합능은 서로 다르다. 또한, 그의 아미노 말단의 아미노산 서열은 트롭빈의 아미노산 서열과 거의 일치하고 있으나 트롬빈과 다른활성을 나타내고 있을 뿐만 아니라 두개의 펩타이드로 구성된 트롬빈과는 달리 단일 펩타이드로 구성되어 있다.
본 발명의 목적은 TTP환자의 혈장으로부터 분리한 혈소판 응집 활성을 갖는 신규 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 단백질을 TTP환자의 혈장으로부터 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, TTP 환자의 혈장에서 분리된 혈소판 응집효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질 및 황산 암모늄 침전, 투석, 콘 A-세파로즈 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피 단계를 포함하는 상기 단백질의 분리 정제 방법이 제공된다.
본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 트롬빈 유사 단백질은 시디퀴와 라이안에 의하여 분리 정제된 혈소판 응집 단백질과 의학적, 생화학적으로 거의 동일한 성질을 가지나, 알파-D-만노피라노스, 알파-D-글루코피라노스 및 이들과 입체적으로 유사한 당 잔기를 포함하는 분자와 결합하는 것으로 알려진 콘가나발린 A에 대한 친화력을 측정하는 크로마토그래피에서 서로 다른 시간에 용출되므로 콘카나발린 A에 대한 친화력에는 차이가 있다. 상기 단백질의 아미노-말단의 20개 아미노산의 서열은 Thr-PheGly-Ser-Gly-Glu-Ala-Asp-X-Gly-Leu-Arg-Pro-Leu-Phe-Glu-Lys-Lys-Ser-Leu(여기에서, X는 분석하기 어려운 아미노산 잔기를 의미함)으로서 이러한 서열은 트롬빈 중쇄(heavy chain)의 아미노-말단의 서열과 95%일치하고 있다.
본 발명의 트롬빈 유사 단백질은 트롬빈과 유사한 아미노산 서열을 가질 것으로 여겨지며, 임의의 위치에서 각 아미노산 잔기의 삭제, 치환 및 첨가가 일어날 수 있고 그 결과 단백질의 활성이 변화되지 않는 한 그렇나 변형도 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 트롬빈 유사 단백질의 분자량은 산화 상태에서는 37kDa으로 트롬빈의 분자량과 동일하나 환원 상태에서는 트롬빈의 분자량이 32kDa인데 반해 본 발명의 트롬빈 유사 단백질의 분자량은 37kDa이다. 또한 본 발명의 트롬빈 유사 단백질은 트롬빈과 같이 혈소판 응집효과를 나타낼 수 있으나 트롬빈의 혈소판 응집효과는 정상인의 혈장에 의해서 억제되지 않는 반면 본 발명의 단백질은 정상인의 혈장에 의해서 억제된다. 따라서 본 발명의 단백질은 시디퀴와 라이안에 의해 이미 보고된 혈소판 응집 단백질과 유사한 기능을 가지고 있으나 구조면에서는 트롬빈과 유사하고 생화학적인 성질과 기능면에서는 트롬빈과 다른 신규단백질이다.
본 발명의 단백질은 공지된 아미노산 합성 방법에 의해 합성할수도 있고 TTP환자의 혈장으로부터 분리하여 정제함으로써 얻을 수도 있다.
예를 들어, 본 발명의 단백질은 다음과 같은 방법으로 분리 정제할 수 있다. 동결건조한 TTP환자의 혈장을 적절한 완충용액, 예를 들면, 10mM트리스-염산 완충용액(pH 7.4)에 녹인 후 원심분리하여 얻은 상층액에 황산 암모늄을 첨가하여 단백질을 침전시킨다. 이 때, 황산 암모늄은 상층액을 50% 포화시킬 수 있는 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 원심분리 후 침전물을 동일 완충액에 용해시킨 후 투석하고 투석된 현탁액을 원심분리하여 얻은 상층액을 DEAE-세파셀(Sephacel)컬럼 크로마토그래피, 콘(Con) A-세파로즈(Sepharose)컬럼 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피 단계와 슈퍼로즈(Superose)12젤 여과 크로마토그래피 단계를 거쳐 혈소판 응집효과를 보이는 트롬빈 유사 단백질을 순수하게 분리 정제할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세히 설명하고자 하나 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 그에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
동결건조한 TTP환자의 혈장을 10mM트리스 - 염산 완충용액 (pH 7.4)에 넣고 천천히 녹인 후 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상층액에 분말 상태의 황산 암모늄을 4℃에서 50% 포화용액이 되도록 천천히 첨가하여 30분간 잘 섞었다. 4℃에서 30분간 방치한 후 10,000g에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 침전물을 적당량의 10mM트리스-염산 완충용액(pH 7.4)으로 잘 녹인 후, 반투과막을 사용하여 동일 완충용액으로 투석하였다.
투석 후의 현탁액을 다시 10,000g로 20분간 원심분리하여 얻은 상층액을 10mM트리스 - 염산 완충용액 (pH 7.4)으로 평형화시킨 DEAE-세파셀(Sephacel)컬럼(2.3×9.0cm)에 주입하고 동일 완충용액으로 280nm의 흡광도가 거의 0이 될 때까지 세척하였다. 이후 0.2M NaCl를 함유하는 동일 완충용액으로 용출시킨 후, NaCl의 농도를 계단식으로 0.3M로 증가시켜 용출시켰다. 용출액의 속도를 20㎖/hr로 하고 용출물을 2.0㎖씩의 분획으로 수집하였다.
각 분획의 혈소판 응집효과를 크로노-로그 응집 검출계 (Chrono-log aggregometer, 미국)로 조사하여 가장 강한 혈소판 응집반응이 나타나는 분획을 20mM트리스 - 염산 완충용액 (pH 7.4, 0.5 M NaCl, 1mM CaCl2, 1mM MnCl2포함)으로 투석한 후 농축하여 다음 분리과정에 사용하였다.
투석 농축한 분획을 콘(Con)A- 세파로즈(Sepharose)컬럼(1.3×9.0cm, 파마시아, 미국)에 주입한 후 동일 용액으로 흡광도가 280nm에서 거의 0이 될 때까지 세척하였다. 용출 속도는 20㎖/hr로 하였으며 1.2㎖씩 분획하였다. 이 단계에서 얻은 분획을 ConA-I 로 명명하였다. 그 후, 0내지 0.5M의 α-메틸 -D-글루코사이드 (α-methyl-D-glucoside)의 선형 농도 구배를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 이 단계에서 얻은 분획은 ConA-II로 명명하였다. 이후 0.5M 과 1.0M의 α-메틸-D-글루코사이드로 계단식으로 용출시키고, 마지막 분획은 0.1M아세테이트 완충액 (pH 4, 0.5M NaCl 포함)으로 용출시켰다. 용출된 분획을 ConA-III로 명명하였으며, 상기 용출 프로필은 제2도에 나타내었다.
각 분획에 대하여 혈소판 응집 효과를 조사한 결과 ConA-II의 분획에서 가장 강한 응집력이 나타났다. 10mM트리스-염산완충용액(pH 7.4, 0.15M NaCl 포함) 으로 투석한 후 농축한 ConA-II분획을 FPLC의 슈퍼로즈 (Superose)12젤 여과 컬럼(파마시아, 미국)에 주입하고 동일 완충액으로 용출시켜 가장 강한 혈소판 응집 효과를 가지고 있는 분획에 분자량이 37kDa에 해당하는 트롬빈 유사 단백질이 존재함을 확인하였다.
실시예 2
상기 실시예 1에서 최종 정제된 단백질의 혈소판 응집 효과는 크로노-로그 응집 검출계를 사용하여 측정하였다. 혈소판이 풍부한 혈장(platelets rich plasma, PRP) 400㎕ 에 10mM트리스-염산 완충용액 (pH 7.4, 0.15M NaCl 포함) 100㎕ 르 ㄹ첨가한 후 정제된 본 발명의 단백질을 0.43㎍첨가하였을 때 강한 혈소판 응집 현상이 관찰되었으나, 완충용액 대신에 정상인의 혈장 100㎕를 처리하였을 경우에는 혈소판 응집 현상이 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 3
분리 정제된 본 발명의 단백질의 아미노 말단의 20개 아미노산의 서열을 자동 아미노산 서열결정기(automatic peptide sequencer, Applied Biosystem Instrument Model 477, USA)로 확인한 결과, 아미노산 서열은 Thr-PheGly-Ser-Gly-Glu-Ala-Asp-X-Gly-Leu-Arg-Pro-Leu-Phe-Glu-Lys-Lys-Ser-Leu(여기에서, X느 분석하기 어려운 아미노산 잔기를 의미함)으로 나타났으며, PIR-국제 단백질 서열 데이타베이스(International Protein Sequence Database)에서 FASTA/RDF2프로그램으로 서열 상동성 (sequence homology)을 조사한 결과, 본 발명의 단백질이 트롬빈과 매우 큰 유사성을 가지고 있음이 확인되었다.
분리 정제된 본 발명의 단백질과 기존의 트롬빈을 β-머캅토에탄올 (β-mercaptoethanol)로 각각 처리한 시료와 처리하지 않은 시료를 동시에 SDS-젤 전기영동하여 동일성 유무를 조사하였다. 그 결과, 트롬빈은 이황화 결합으로 연결된 두 개의 펩타이드로 구성되어 있으나 본 발명의 단백질은 37kDa의 단일 펩타이드로 구성되어 있음을 확인하였다(제3도). 제3도에서, β-Me(+)는 본 발명의 단백질 (a)과 기존의 트롬빈 (b)시료에 β-머캅토에탄올을 처리한 것을 나타내고, β-Me(-)는 β-머캅토에탄올을 처리하지 않은 본 발명의 단백질 (a)과 기존의 트롬빈 (b)시료를 나타내며, S는 표준 단백질 분자량 표지로서 우측의 숫자는 표준물질의 분자량 크기를 나타낸다.

Claims (5)

  1. 혈전성 혈소판 감소성 자반증(TTP)환자의 혈장에서 분리된, 산화 및 환원 상태에서의 분자량이 37kDa이고 단일 펩타이드로 구성되며 혈소판 응지 효과를 갖는 트롬빈 유사 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 아미노-말단의 20개 아미노산이 하기 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    N-Thr-PheGly-Ser-Gly-Glu-Ala-Asp-X-Gly-Leu-Arg-Pro-Leu-Phe-Glu-Lys-Lys-Ser-Leu-C
    (여기에서, X는 분석하기 어려운 아미노산 잔기를 의미한다).
  3. 혈전성 감소성 자반증 환자의 혈장으로부터 신규 트롬빈 유사 단백질을 정제하는데 있어서,
    (가)혈전성 혈소판 감소성 자반증 환자의 혈장을 원심분리하여 얻은 상층액에 황상 암모늄을 가하여 단백질을 침전시키고,
    (나)단백질을 용해시키고 투석한 후, 투석된 현탁액을 원심분리하여 상층액을 얻고,
    (다)상기 (나) 단계에서 얻은 상층액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계들을 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (가)단계에서 황산 암모늄을 상층액에 50%포화용액이 되도록 첨가하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 (다)단계의 컬럼 크로마토그래피가 DEAE-세파셀(Sephacel)음이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 콘(Con)A-세파로즈(Shepharose) 컬럼 크로마토그래피 및 슈퍼로즈 (Superose)12 젤 여과 크로마토그래피를 포함하는 방법.
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