KR970001810B1 - 태반조직 단백질 pp4의 정제방법 - Google Patents

태반조직 단백질 pp4의 정제방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

태반조직 단백질 PP4의 정제방법
본 발명은 응고방지 특성을 가진 태반조직 단백질 PP4를 정제하는 방법에 관한 것이다.
조직 단백질 PP4는 다음과 같은 파라메터와 함께 문헌[참조 : DE 제33 15 000 AI호(미합중국 특허 제4,507,229)]에 기술되어 있다 :
전기영동 이동성 : 알파1내지 알파2글로불린의 범위.
등전점 :4.85±0.15.
침강계수 S0 20,W: 3.3±0.2S.
나트륨 도데실 설페이트(SDS)-함유 폴리아크릴아미드 겔에서 측정한 분자량 : 35,000±5,000,
흡광계수 E1%11cm(280nm) : 5.9±0.6,
탄수화화물 함량 : 2.4±0.94%(g/100g)(만노스 0.3±0.2%, 갈락토스 0.4±0.2%, 크실로스 0.1±0.04%, 글루코스 0.2±0.1%, 글루코사민 1.0±0.2%, 뉴라민산 0.4±0.2%), 및 하기의 아미노산 조성 :
Figure kpo00001
Figure kpo00002
종래의 PP4정제방법, 예를 들어, 역흡착법, 겔 여과법 등[참조 : Bokn e±al., 1985. Arch. Gynaecoll. 236. 225-233]은 산업적 규모로 PP4를 분리하기에는 적합하지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 PP4를 정제하는 방법을 개발하는 것이다.
본 발명에 이르러, 놀랍게도, PP4는 칼슘이온의 존재하에서 삭카라이드 폴리설 페이트 또는 설페이트화된 당에 대하여 친화성을 나타내며, 담체-결합된 삭카라이드 폴리설페이트 또는 설페이트화된 당에 결합될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 칼슘이온의 존재하에서, PP4-함유 용액을 담체-결합된 삭카라이드 폴리설페이트 또는 설페이트화된 당과 접촉시키고, 상등액을 제거한 다음, 경우에 따라 PP4가 함유된 담체기질을 세척한 후,PP4를 용출시킴을 특징으로 하여, PP4를 정제하는 방법에 관한 것이다.
물중에서 불용성이며, 삭카라이드 폴리설페이트 또는 설페이트화된 당이 공유결합될 수 있는 담체 기질의 예로는 불용성 아가로스, 덱스트란, 폴리아크릴아미드 또는, 폴리에틸렌 글리콜, 펜타에리쓰리톨 및 메타크릴레이트의 공중합체, 또는 이의 혼합물이 있다.
이러한 유형의 담체에 의한 삭카라이드 폴리설페이트 또는 설페이트화된 당의 커플링화는 공지된 방법으로 수행할 수 있으며, 예를들어 CNBr또는 에폭사이드로 미리 활성화시간 담체수지와 반응시키거나, 아미노-작용화된 담체수지에 의한 카보디이미드 커플링을 경유하여 수행할 수 있다.
바람직한 공정에서는, 용액 1ml당 PP4 0.01내지 50mg을 바람직하게 함유하여, 예를들어 염화칼슘, 칼슘 아세테이트 또는 칼슘 락테이즈 형태로 칼슘이온 0.001 내지 0.2mol/l를 함유하는, pH가 5.5내지 9.5인 PP4-함유 용액응 담체-결합된 삭카라이드 폴리설페이트 또는 담체-결합된 설페이트화된 당, 예를들어 담체-결합된 헤파린, 덱스트란 설페이트, 해파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트 또는 데르마탄 설페이트와 접촉시키고, 상등액을 제거한 다음, 경우에 따라, PP4가 함유된 담체물질을 칼슘이온 0.001내지 0.2mol/l 및 NaCl, Kcl 또는 Licl 같은 염 0.001 내지 0.4mol/l를 함유하며 pH가 5.5 내지 9.5인 완충제로 세척하고, 염농도를 증가시키면서 단계 또는 구배용출시켜 PP4를 용출시킨다.
특히 바람직한 공정에서는, 칼슘이온 0.003내지 0.02mol/l를 함유하며 pH가 7.0 내지 9.0인 PP4-함유용액을 담체-결합된 헤파린 또는 덱스트란 설페이트, 특히 바람하게는 담체-결합된 헤파린과 접촉시키고, 혼합물을 , 예를 들어 4 내지 30℃에서 5 내지 300분 동안 배양시킨 다음, 상등액을 PP4가 함유된 담체 수지로부터 분리하고, 경우에 따라 칼슘이온 0.003 내지 0.02mol/l 및, NaCl, kcl 또는 Licl 0.05내지 0.3mol/l를 함유하며 pH가 7.0 내지 9.0인 용액으로 세척한 후, 단계 또는 구배용출에 의하여 염농도를 0.35 내지 1.5mol로 증가시킴으로써 PP4를 세척하여 담체수지를 제거한다.
또한 경우에 따라, 후속으로, 예를들어 다른 담체-결합된 삭카라이드 폴리설페이트 또는 담체-결합된 설페이트화된 당에 대하여 재크로마토그라피할 수도 있다.
본 발명에 따른 방법의 특징은 산업적 규모상으로도 PP4를 몇가지 단계에서 매우 높은 순도 및 수율로 분리할 수 있다는 점이다, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다.
실시예 1
문헌[참조:DE-A 제36 43 182호]의 실시예 1에서와 같이 제조한 페닐-R세파로스 용출물(1ml당 PP4160μg) 3l를 완충제 A(50mmol/l Tris/HCl, 25mmol/l NaCl, 5mmol/l CaCl2pH8.0)에 대하여 투석시킨다. 용액을 배치법에서 헤파린-R세파로스(Pharmacia, Uppsala, Sweden, 제품번호 제17-0467-01호) 300ml와 혼합하고, 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 상등액을 제거한다. 이어서, 흡착제를 완충제 A로 세척하고, PP4를 단계적으로 NaCl 구배용출시킨다(180mmol/l, 3000mmol/l 및 1.5mol/l NaCl). 경우에 따라, 생성된 PP4물질을, CaCl2을 함유하지 않는 완충제 A중에서 덱스트란 설페트-R세파로스에 대하여 재크로마토그라피하여 추가로 정제할 수 있다. 이와같이 정제한 PP4의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 분자량이 약 32kDa인 하나의 밴드를 생성시킨다.
실시예 2
페닐-R세파로스 용출물(실시예 1과 동일) 1l를 완충제 A 에 대하여 투석시킨다. 투석물은 완충제 A로 평형시킨 덱스트란-설페이트-R세파로스[에톡시-활성화된 세파로스 6B, 덱스트란 설페이트 : Pharmacia,Uppsaia, Sweden, 제품번호 제17-0480-01호, 제17-0340-01호 ; 성분은 문헌(참조:Sundberg, L., Porath J. (1974), J. Chromatagr. 90, 87-98)의 방법과 같은 공지된 방법으로 커플링시킨다] 200ml에 적용시키고, 세척한다. PP4-를NaCl 구배 용출시킨다. PP4-함유 분획을 완충제 A에 대하여 투석시킨 다음, 예를 들어 헤파린-R세파로스 상에서 재크로마토그라피한다. PP4 물질의 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 분자량이 약 32kDa인 하나의 밴드를 생성시킨다.

Claims (9)

  1. 칼슘이온의 존재하에서, PP4-함유 용액을 담체-결합된 삭카라이드 폴리설페이트 도는 설페이트화된당과 접촉시키고, 상등액을 제거한 다음, 경우에 따라 PP4가 함유된 담체기질을 세척한 후, PP4를 용출시킴을 특징으로 하여, PP4를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 담체물질이 불용성 아가로스, 텍스트란, 폴리아크릴아미드, 아미노-작용화된 담체수지 또는, 폴리에틸렌 글리콜, 펜타에리쓰리톨 및 메타크릴레이트의 공중합체, 또는 이의 혼합물인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 삭카라이드 폴리설페이트가 헤파린, 텍스트란 설페이트, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴, 설페이트, 케라탄 설페이트 또는 데르마탄 설페이트이트인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 담체-결합된 헤파린 또는 텍스트란 설페이트를 사용하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 칼슘이온 0.001 내지 0.2mol/l가 존재하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 담체-결합된 헤파린, 덱스트란 설페이트, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트 또는 데르마탄 설페이트를 사용하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 칼슘이온 0.001 내지 0.2mol/l 및 NaCl, KCl 또는 LiCl 0.001 내지 0.4mol/l를 함유하며 pH가 5.5 재지 9.5인 완충제를 세척용으로 사용하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 담체-결합된 헤파린을 사용하는 방법
  9. 제7항에 있어서, 칼슘이온 0.003 내지 0.2mol/l 및 NaCl, KCl 또는LiCl 0.05 내지 0.3mol/l를 함유하는 완충제를 사용하는 방법.
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