PT88067B - Processo para a purificacao de proteina tecidual pp4 placentaria - Google Patents

Processo para a purificacao de proteina tecidual pp4 placentaria Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 88 067
REQUERENTE: BEHRINGWERKE-AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Mar burg, República Federal Alemã.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE PROTElNA
TECIDUAL PP4 PLACENTÁRIA.
INVENTORES: Dr.Hartmut Lõbermann.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Republica Federal Alema, em 25 de Julho de 1987, sob o n?. P 37 24 726.3.
•NP1. MOQ 113 RF 1A732
£. ο Ό I
Memória descritiva referente à patente de invenção de BEHRIKGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT; alemã industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Hartbut Lõbermann), para PROCES SO PARA A PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA TECIDUAL PP4 PLACENTÁRIA.
Memória Descritiva
A presente invenção refere-se a um pre cesso para a purificação da proteína tecidual PP4 placentária, a qual apresenta propriedades inibidoras da coagulação .
A proteína tecidual PP4 é descrita na patente de 33 15 000 A 1 (USP 4 507 229) com os seguintes parâmetros:
- uma mobilidade electroforética no domínio entre as globulinas alfa^ e alfa2;
- um ponto isoeléctrico de 4,85 + 0,15;
- um coeficiente de sedimentação S°20, w de 3,3 + O,2S;
- um peso molécular determinado em gel de poliacrilamida contendo dodecilsulfato de sódio (SDS) de 35 OOO + 5 000;
1%
- um coeficiente de extinção E 0 lem (280 nmm) de 5,9 + 0,6;
- uma fracção de hidratos de carbone de 2,4 + 0,94% (g/100 g) (manose 0,3 + 0,2 %, galactose 0,4 +0,2 %, xilose 0,1 + 0,04 %, glucose 0,2 +0,1 %, glucosamina 1,0 + 0,2 %, ácido neuraminico 0,4 + 0,2 %) e
- a seguinte composição em ácidos aminados:
Residuos por 100 resíduos
VariaçÕes-
Ácidos aminados (Mol %) coeficiente
Lisina 6, 95 1,14
Histidina 0, 97 17,40
Arginina 5,44 1,77
Ácido aspártico 11,41 1,68
Treonina 6, 78 2,40
Serina 6, 21 2,26
Ácido glutâmico 12, 25 0,43
Prolina 1, 96 6,20
Glicina 6,68 3, 83
Alanina 7, 92 1,67
Cistina 1/2 0, 77 19, 50
Valina 5, 34 3,80
Metionina 1,98 6,00
Isoleucina 5, 21 2, 23
Leucina 11,50 0,45
Tirosina 3,55 4,21
Fenilalanina 4,07 3,77
Triptofano 0, 93 2 3,90
Os processos até agora conhecidos para
a purificação de ' PP4, como por exemplo por imunoadsorção,
filtração em gel, etc. (3ohn et al. 1985, Arch. Gynaecol.
236,225-233), não são adequados paraoo isolamento de PP4
em escala técnica 0 objectivo da presente invenção é, po
conseguinte, o estabelecimento de um processo para a puri-
ficação de PP4 .
Surpreendentemente constatou-se agora que a proteína PP4 apresenta, na presença de iões de cálcio afinidade para polissulfatos de sacáridos ou para açúcares sulfatados e pode ligar-se a polissulfatos de sacáridos ou a açúcares sulfatados ligados a um suporte.
O objecto da presente invenção é, por conseguinte, um processo para a purificação da proteína PP4 caracterizado por se fazer contactar uma solução que contenha PP4 na presença de iões de cálcio com um polissulfato de um sacárido ou com um açúcar sulfatado ligados a um suporte, eliminar o liquido sobrenadante, lavar eventual mente a matriz do suporte carregada com PP4 e eluir a proteína PP4.
No que se refere a matrizes de suporte insolúveis em água que se podem ligar com ligações covalentes a um polissulfato de sacárido ou a um açúcar sulfatado, podem referir-se, por exemplo, mateiais insolúveis, como agarose, dextrano, poliacrilamida ou copolimeros de polietilenoglicol, pentaeritrite e matacrilato ou ainda as respectivas combinações.
O acoplamento de um polissulfato de um sacárido ou de um açúcar sulfatado a um suporte como os mencionados pode ser levado a efeito de acordo com métodos conhecidos, por exemplo por meio da reacção com uma resina de suporte pré-activada com CNBr ou com epóxido pu por meio de acoplamento por carbodiimida a uma resina de suporte funcionalizada com funções amina.
De acordo com uma variante processual preferida, faz-se contactar uma solução contendo PP4 com um pH de 5,5 a 9,5 com uma concentração de preferência de 0,01 a 50 mg de PP4/ml de solução e de 0,001 a 0,2 mol/1 de iões de cálcio ou de lactato de cálcio com um polissulfato de um sacárido ligado a um suporte ou com um açúcar sulfatado ligado a um suporte, por exemplo, heparina, sulfato de dextrano, sulfato de heperano, sulfato de condroitina, sulfato de queratano ou sulfato de dermatano li3
gados a um suporte, separa-se a solução sobrenadante, lava-se eventualmente o material de suporte carregado com PP4 com um· tampão de pH 5,5 a 9,5 contendo 0,001 a 0,2 mol/ml de iões de cálcio e 0,001 a 0,4 mol/1 de um sal, por exemplo de NaCl, KC1 ou LiCl e elui-se por meio de uma ou duas fases de eluição por patamares ou por gradiente com elevação da concentração salina.
Numa variante processual especialmente preferida faz-se contactar uma solução contendo PP4 com pH 7,0 a 9,0 com uma concentração de 0,003 a 0,02 mol/1 de iões de cálcio com heparina ou sulfato de dextrano ligados a um suporte, de preferência de modo especial com heparina ligada a um suporte, incuba-se a mistura por exemplo duran te 5 a 300 minutos a uma temperatura de 4 a 30°C, separa-se a solução sobrenadante da resina de suporte carregada com PP4, lava-se eventualmente com uma solução com um pH de 7,0 a 9,0 com uma concentração de iões de cálcio de 0,003 à 0,02 mol/1 e 0,05 a O,3 mol/1 de NaCl, KC1 ou LiCl, e separa-se a proteína PP4 da resina de suporte por dissolução mediante uma elevação da concentração salina até 0,35 a 1,5 mol/1 por meio de um gradiente de concentração.
De acordo com a presente invenção é possível, por exemplo, associar-se também uma nova cromatografia num outro polissulfato de um sacárido ligado a um suporte ou açúcar sulfatado ligado a um suporte.
O processo da presente invenção caracteriza-se pela possibilidade de se obter a proteina PP4 em menos fases com um grau de pureza e um rendimento muito altos também em escala industrial.
A presente invenção pode ser elucidade mais em pormenor nos exemplos que se seguem.
Exemplo 1
Dialisaram-se 3 1 de um eluido de fenil- Sepharose, que tinha sido preparado de acordo com o Exemplo 1 da DE-A-36 43 182 (160 ^ug de PP4/ml) contra
tampão A (Tris.HCl a 50 mmol/1, NaCl a 25 mmol/1, CaClg a ; 5 mmol/1, pH 8,0). Tratou-se a solução num processo desI r j contínuo com 300 ml de uma heparina- Sepharose (Sociedade i: Pharmacia, Upsala, Suécia, N2. de cat. 17-0467-01), agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente e separou-se a solução sobrenadante. Em seguida lavou-se o adsorvente com tampão A e eluiu-se a proteína PP4 por meio de um gradiente de NaCl por ou 300 patamares (180 mmol/1, 300 mmol/1 e 1,5 mol/1 de NaCl).
Eventualmente pode cromatografar-se novamente para purificação adicional da proteina PP4 assim p
obtida num sulfato de dextrano- Sepharose em tampão A sem CaCl^. A PP4 purificada deste modo deu, numa electroforese em gel de poliacrilamida com SDS, uma banda com peso molecular de cerca de 32 kDa.
Exemplo 2
Dialisou-se 1 1 de eluido de fenilo (como no Exemplo 1) contra tampão A. O dialisado foi feito passar através de uma coluna de 200 ml de sulfato de dextrano-RSepharose (Sepharose 6B activada por epóxido, Sociedade Pharmacia, Upsala, Suécia, N9 de cat. 17-0480-01, 17-0340-01; o acoplamento das substâncias foi levado a efei to de acordo com métodos conhecidos, por exemplo de acordo com Sundberg, L., Porath, J. (1974) J. Chromatogr. 90, 87-98.) que tinha sido equilibrada com tampão A. Lavou-se a coluna e eluiu-se a proteina PP4 por meio de eluente de NaCl. As fracçoes contendo PP4 foram, após diálise contra tampão A, novamente cromatografadas numa coluna de heparina-RSepharose. O material PP4 deu numa electroforese em gel de poliacrilamida com SDS uma banda com um peso molecular de cerca de 32 kDa.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES _ lâ _
    Processo para a purificação de proteína PP4 caracterizado por se fazer contactar uma solução contendo proteina PP4 na presença de iões de cálcio com um sacárido ligado a um suporte ou com um açúcar sulfatado ligado a um suporte, separar o liquido sobrenadante, lavar eventualmente a matriz do suporte com a proteina PP4 carre gada e eluir a proteína- PP4.
    - 25 Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o material de suporte ser insolúvel e ser agarose, dextrano, poliacrilamida, uma resina de supor te funcionalizada com funções amina ou um copolimero de polietilenoglicol, pentaeritrite e metacrilato ou uma combinação destes materiais.
    - 35 Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o polissulfato de um sacárido ser hepa rina, sulfato de dextrano, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de queratano ou sulfato de dermatano.
    Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se utilizar heparina ou sulfato de dextrano ligados a um suporte, de preferência heparina li6 gada a um suporte.
    _ 5ã Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por estarem presentes 0,001 a 0,2 mol/1 de iões de cálcio.
    - 63 Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se utilizar heparina, sulfato de dextra no, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, sulfato de queratano ou sulfato de dermotano ligados a um suporte.
    - 7θ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se lavar com um tampão de pH 5,5 a 9,5 que contém 0,001 a 0,2 mol/1 de iões cálcio, de preferência 0,003 a 0,02 mol/1, e 0,001 a 0,4 mol/1 de NaCl, KC1 ou LiCl, de preferência 0,05 a 0,3 mol/1.
    A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 25 de Julho de 1987, sob ο K5 P 37 24 726.3.
PT88067A 1987-07-25 1988-07-22 Processo para a purificacao de proteina tecidual pp4 placentaria PT88067B (pt)

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