PT95992A - Processo para a purificacao de lipocortinas - Google Patents

Description

Descrição referente ã patente de invenção de BEHRINfíWERKE AKTIENSESELL SCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg* República Federal Alemã, (inventores: Dr« Júrgen Romisch e Prof* Dr* Nor-bert Heim Burger, residentes na Rep» Federal Alemã), para "PROCESSO PARA A PORXFICAÇSO DE LIP0C0RTINA"

DESCRICSO À invenção refere-se a um processo para a purificação do lipocortinas, em especial das proteínas PP4-X, PAP III, p68, ancorina II e ainda ILipocortina I e II.

Estas proteínas pertencem a uma família que se designa das lipocortinas, Calpactinas ou enexí-j nas· podem encontrar-se em muitos organismos e ainda em seres ; humanos na maior parte dos órgãos ou tipos de células. As I propriedades funcionais mais importantes até agora conhecidas destas proteínas são um efeito anti-coagulante. Esta família de proteínas pode ter uma influência em estados inflamatórios e distúrbios de coagulação com eles relacionados, como a coagulação intravasol disseminada (BIC), diminuindo-os ou mesmo neutralizando-os,

Os processos até agora utilizados I para um isolante rápido destas proteínas (Tait, J.F.et al. (1988) Biochemistry 27, 6268-6276) não são adequados para um isolante técnico das mesmas* 0 objectivo desta invenção foi por . leso o desenvolvimento de um processo para a purificação das - i _ proteínas PP4-X, PAP III, p68, ancoriaa II e lipocortinas I e II.

Bescobriu-se então surpreendentemente que estas proteínas, na presença de cálcio, apresentam afinidade para esteres do acido poli-sulfúrico de sacaridos ou para açucares sulfatados e se podem ligar a esteres de ácido poli-sulfúrico de sacáridos suportados ou a açúcares sulfatados, não sendo absorvida a maior parte das impurezas proteicas, A absorção das lipocortinas pode assim efectuar-se numa coluna ou num reactor descontinuo. 0 objectivo da presente invenção é um processo para a obtenção de lipocortinas, caracterizado por se pôr em contacto uma solução contendo uma ou várias lipocortinas, na presença de iões cálcio, com um éster do ácido poli-sulfúrico de um sacárido suportado ou com um açúcar poli-sulfutado suportado, se separar a solução sobrenadaste, se lavar, conforme o caso, o material de suporte carregado, se eluirem as lipocortinas isoladamente, em grupos, ou na totalidade, por aumento da força ionica.

Um dos modos de execução do processo consiste em pôr em contacto uma solução de 0.01-50 og/ml de uma lipocortina, de pH 5.5-9,5, contendo 0.0001-0,1 mol/1 de iões cálcio, por exemplo na forma de cloreto, acetato ou lactato, com um éster do ácido poli-sulfúrico de um sacárido, ligado a um suporte, ou com um açúcar sulfatado, por exemplo heparina, sulfato de dextrano, sulfato de heparano, sulfato de cottdroitina, sulfato de queratano ou sulfato de dermatano, ligado a um suporte, separar a solução sobrenadaste, lavar, conforme o caso, o material de suporte carregado, com um tampão de pH 5.5-95» contendo Q.GOOi-Gul mol/1 de cálcio, e eluir a lipocortina por meio de um gradiante linear de KaCl-, lidou KC1.

No caso das Lipocortinas existirem misturadas em solução, podem também eluir-se em grupos ou na totalidade* 2 -

Como matriz de suporte insolúvel em água, a qual se liga o éster do âciáo poli-sulfúrico de um sacarido o» um açúcar sulfatado, de modo covalente, pode utilizar-se por exemplo dextrano insolúvel, agarose, acrilami-da, um polímero amino-funcionalizado e/ou copolímeros do polie-tileno glicol, pentaeritritol e metacrilato ou ainda combinações destes. 0 acoplamento do éster do acido poli-sulfúrico de sacúridos ou de açucares sulfatados pode efectuar-se de acordo com métodos conhecidos, p. ex. por meio de suportes pré-activados com CNBr ou epoxido, ou por meio de carhodiimida em suportes amino-funcionalizados.

Numa forma preferencial de execução do processo poe-se em contacto uma solução contendo uma lipo-cortina ou uma solução contendo uma combinação destas proteínas ou todas estas proteínas, na presença de 0.0002-0.03 mol/1 de cálcio, a pH 6-9, com heparina ou sulfato de dextrano suportados, de preferência com uma resina de afinidade para a heparina, incuba-se a mistura durante 3-300 min a 4°-30°C, separa--se a solução sobrenadante da resina de suporte, lava-se o absorvente, conforme o caso, com uma solução a pH 6-9 contendo 0.0002-0.03 moi/i de cálcio, e eluem-se as proteínas isolada-mente por aumento de condutividade, de preferência por meio de um gradiente salino linear, em grupo por meio de uma eluição em passos, ou na totalidade, de preferência por aumento da concentração salina a 0.6-1.0 mol/1 de Na Cl, Kei Li Cl ou de um sal do ácido cítrico.

Em alguns casos pode seguir-se uma purificação posterior dos lipocortinas isoladamente ou em conjunto. Para tal existem as seguintes possibilidades: 1. Re-cromatografia com um outro éster do ácido poli-sulfúrico de um sacârido ligado a um suporte ou com um outro açúcar sulfatado. 2* Remoção do sal ou dos iões cálcio, por exemplo por diálise, e cromatografia com um éster do ácido poli-sulfúrico de um sacârido ligado a ura suporte ou com um . açúcar sulfatado, na ausência de cálcio ou na presença de - 3 - a

um reagente quelante como EBTA, IGTÁ ou um sal do ácido cítrico ou do ácido oxãlico. 3* Cromatografia de permuta ionica, p por exemplo com earboximetil-, BEAE-, QÂE~ Sephacel ou Celulose (Firma Pharmacia, Suécia).

0 processo de acordo com a invenção distingue-se por se poderem isolar as proteínas PP4-X, PAP

I III, p68, ancorina II e Lipocortinas I e II, em poucos passos, com uma elevadíssima pureza e bom rendimento mesmo em larga escala industrial*

Para o isolamento a escala industrial destas lipocortinas a principal matéria prima ê a placenta humana, que existe á disposição em quantidades suficientes e que contém estas proteínas em grandes quantidades. Para a purificação de ancorina II utilizam-se princípalmente os fibroblastos especialmente ricos nesta proteína.

Lista das abreviaturas;

J EDTA: ácido etilenodiamianotetraacético EGTÁj ácido bis(aιainσetil)-glicoléter-N,N,N, ,N*-tetraacético DEAE: dietilaminoetilo QAEí aminoetilo quaternário PP4-X: proteína placentâria PAP: proteína anticoagulante placentâria

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invençãoí

Exemplo 1

Pulverizaram-se 36 Kg de placenta ί humana madura* Lavaram-se várias vezes com uma solução de 0»9g/lQ0 ml de NaCl e Liofilizaram-se em seguida* Extraiu-se o liofilizado (3Kg) com 50 1 de uma solução de 0.02 mol/1 de Tris/HCl, pH 7*5, 0.15 mol/1 de NaCl e 0,1 M de Tri-Citrato de sódio, adicionou-se sulfato de amónio (saturado a 33%) . e incubou-se com 4 1 de fenil-sepharose num processo descontí- _ κ -

nuo (”batchn). Após lavagem da resina, eluiram~se as Lipocortinas com água à ebulição, precipitaram-se por adição de sulfato de amónio a 80% de saturação, peletizaram-se por centrifugação, tomaram-se numa solução de 0*02 mol/l de Tris/HCl, pH 8*0 (tampão A) e dialisaram-se contra o mesmo tampão· Após adição de CaCl2 até na concentração final de 0.05 mol/l adicionaram- -se ao dialisado, num processo descontínuo, 11 de heparina- R * - Sepharose, agitou-se durante 60 min. a temperatura ambiente e separou-se a solução sobrenadente. lavou-se depois o absorvente com o tampão A, sob adição de 0*005 aol/1 de CaC^ e prê-eluiu-se com 0.06 mol/l de NaCl. As proteínas PP4-X* PAP III, p68 e as lipocortinas I e II eluiram-sc juntamente, no mesmo ensaio, com 0*8 mol/l de HaCl*

Após diálise deste eluído contra tampao A removeram-se as impurezas ainda restantes, pondo em contacto, após adição de EDTÂ ate uma concentração final de 0.001 mol/l, a solução proteica, com 200 ml de heparina t> - Sepharose, equilibrada com 0.02 mol/l de Tris/MCl, pH 8*0 e 0.001 mol/l de EDTA» agitando durante 60 min. à temperatura ambiente e separando a camada sobrenadente que contem as proteínas e Lipocortinas. As proteínas e Lipocortinas purificadas I deste modo apresentaram-se em electroforese de gel de poliacri-lamida SBS (PAGE) bandas correspondentes ao peso moleculares de 33KB (PP4-X), 34KB (PAP III), 68KB (p68), 36KB(Lipocortina I) e 37KB (Lipocortina II, cadeia pesada) e 10KD(cadeia leve)» 0 isolante de cada uma das proteínas individualmente efectuou--se por meio de cromatografia de permuta iónica, como descrito no exemplo 2,

Os rendimentos das proteínas individuais situaram-se entre 70 e 90%, em relação ao eluido da R fenil- Sepharose. i Exemplo 2 Pôs-se em contacto uma solução contendo PP4-X» PAP III, P68, e lipocortinas I e II, como a desta no exemplo 1, com heparina-^gepjlarosef e lavou-se em seguida

o absorvente. Eluiram-se separadamente» por eluição em passos, PP4-X (0.35 mol/1 d© Na Cl) e PAP III (0.48 mol/1 de NaCl). As Lipocortinas I e II e p68 eluiram-se em conjunto com 0.8 mol/X de NaCl. Libertaram-se a PP4-X oa PAP III ou p68, as Lipocortinas I e II, das restantes impurezas, como descrito no exemplo 1. A posterior purificação das proteínas eluidas com 0.8 mol/1 de NaCl efectuou-se por cromatografia de permuta iónica:

Bialisou-se a solução contendo p68, Lipocortina I e II, contra taapio  e bombeou-se para uma ή

coluna de BEAi- Sepharose» equilibrada em tampão A. A proteína p68 absorvida eluiu-se com um gradiante de NaCl. As Lipocortinas I e II não absorvidas nesta cromatografia dialisaram-se contra um tampão de 0.01 mol/1 de imidazole/HCl, pH 6.0,. puse-ram-se em contacto, sob agitação, com carboximetilcelulose, lavou-se em seguida o absorvente e colocou-se numa coluna. | As Lipocortinas I e II separaram-se por eluição com um gradiante linear de sol de 0-0.7 mol/1 de IlaOl, As Lipocortinas assim purificadas tinham uma pureza 795% e apresentaram na electrofo-rese SBS-PAGE as bandas de peso molecular descritas no exemplo 1.

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - Ia - Processo para a purificação de lipo-cortinas, caracterizado por se pêr em contacto uma solução contendo um ou varias lipocortinas* na presença de iões cálcio, com um éster do ácido poli-sulfúrico de um sacárido ou com um açúcar poli-sulfatado, ligado a um suporte, se separar a solução sobre-nadante, se lavar, conforme o caso, o material de suporte carregado, e se eluirem as lipocortinas isoladamen-te, em grupos ou na totalidade por aumento da força iónica. - 2S - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as lipocortinas a purificar serem í a FP4-X* PAP III, p68, ancorina II ou lipocortina 1 ou II. í - 3a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se purificarem posteriormente as lipocortinas na ausência de iões cálcio ou na presença de um excesso de um reagente quelanfce» por absorção das restantes impurezas a um éster poli-sulfúrico de um sacárido ou a um açúcar sulfatado» e separação da solução contendo as lipocortinas. - 48 - Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por o material de suporte utilizado para a purificação de lipocortinas ser dextrano insolúvel, agarose* poliacrilamida, um polímero insolúvel amiao-funcionalizado ou um copolíraero de polietilenogli-col, pentaeritritol e metacrilato, ou uma combinação destes, - 5a - - 7 -

   Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por o éster polis-sulfurico de um sacárido ser heparina» sulfato de dextrano, sulfato de heparano, sulfato de condoí trina, sulfato de tjuera-tano ou sulfato» de dermatano. - 6a - Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por se utilizar para a purificação de lipocortinas heparina ou sulfato de dextrano ligados a um suporte.

   . 7» *. Processo de acordo com pelo menos uma das reivindicações 1 e 3, caracterizado por se utilizar para a purificação de lipocortinas heparina ligada a um suporte* - ga - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se conduzir o processo para a purificação de lipocortinas num tampão de pH 5»5 a 9*5» contendo iões cálcio numa concentração de 0,001 e 0,1 mol/1* - 9a - Processo de acordo com a reivindicação 2* caracterizado por se utilizar* para a purificação de lipocortinas* como reagentes quelante EBTA, EGTA, um sal do ácido cítrico ou do ácido oxálico» ou uma combinação destes. - 10a - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizar como reagente quelante EDTA ou EGTA. 8 A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 27 de Novembro de 1989» sob o N* P 39 39 169-8. Lisboa» 26 de Novembro de 1990 J

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