JP3390836B2 - 線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法 - Google Patents
線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、線維芽細胞増殖因子に
結合性を有するオリゴ糖及びその製造法に関する。詳し
くは、本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンＣ
ｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第４因子等に作用せず、
かつ、線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及
びその製造法に関する。
結合性を有するオリゴ糖及びその製造法に関する。詳し
くは、本発明は、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンＣ
ｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第４因子等に作用せず、
かつ、線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及
びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）
は、血管系、結合組織系、脳神経系、免疫系など極めて
広範な細胞の増殖を強く促進するタンパク質（１４６ア
ミノ酸）残基である。
は、血管系、結合組織系、脳神経系、免疫系など極めて
広範な細胞の増殖を強く促進するタンパク質（１４６ア
ミノ酸）残基である。
【０００３】１９７４年線維芽細胞（３Ｔ３）増殖因子
として発見されたことと、その等電点（ｐＩ）が９．６
であることから広くこの名称が使われており、さらに他
に幾つかの同義語も知られている。
として発見されたことと、その等電点（ｐＩ）が９．６
であることから広くこの名称が使われており、さらに他
に幾つかの同義語も知られている。
【０００４】一方、１９７９年には筋原細胞（ｍｙｏｂ
ｌａｓｔ）の増殖を促進する因子として、ｂＦＧＦに構
造が類似（１４０アミノ酸残基）するものの、ｂＦＧＦ
と違つてｐＩが５．６のタンパク質が分離され、酸性線
維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）と名付けられるに至つて
いる。
ｌａｓｔ）の増殖を促進する因子として、ｂＦＧＦに構
造が類似（１４０アミノ酸残基）するものの、ｂＦＧＦ
と違つてｐＩが５．６のタンパク質が分離され、酸性線
維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）と名付けられるに至つて
いる。
【０００５】ａＦＧＦは、ｂＦＧＦと共通の細胞表面レ
セプターにも結合することから、両者の作用機構は本質
的に類似しているものと予想される。組織分布について
もａＦＧＦはｂＦＧＦと量的分布が異なるものの、基本
的には類似している。
セプターにも結合することから、両者の作用機構は本質
的に類似しているものと予想される。組織分布について
もａＦＧＦはｂＦＧＦと量的分布が異なるものの、基本
的には類似している。
【０００６】ａＦＧＦとｂＦＧＦに共通した性質の一つ
として注目すべきものにヘパリンに対する強い親和力が
ある（Ｋｄ＝約１０-7Ｍ）。両者はまた組織の細胞外マ
トリツクスあるいは基底膜に組み込まれているヘパラン
硫酸プロテオグリカンの糖鎖部分とも強く結合し、非拡
散性の貯蔵状態となることも知られている。
として注目すべきものにヘパリンに対する強い親和力が
ある（Ｋｄ＝約１０-7Ｍ）。両者はまた組織の細胞外マ
トリツクスあるいは基底膜に組み込まれているヘパラン
硫酸プロテオグリカンの糖鎖部分とも強く結合し、非拡
散性の貯蔵状態となることも知られている。
【０００７】ａＦＧＦもｂＦＧＦもそれらを生産する細
胞自身あるいは近隣細胞が分泌するタンパク分解酵素に
対して抵抗力がない（容易に分解される）が、一旦ヘパ
リンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合すれ
ば強い抵抗性を示す。
胞自身あるいは近隣細胞が分泌するタンパク分解酵素に
対して抵抗力がない（容易に分解される）が、一旦ヘパ
リンあるいはヘパラン硫酸プロテオグリカンに結合すれ
ば強い抵抗性を示す。
【０００８】したがつて細胞マトリツクス中のヘパラン
硫酸プロテオグリカンとの結合は、これら成長因子が蓄
積され、貯蔵され必要に応じて有効に機能するために不
可欠の現象と考えられる。
硫酸プロテオグリカンとの結合は、これら成長因子が蓄
積され、貯蔵され必要に応じて有効に機能するために不
可欠の現象と考えられる。
【０００９】しかし、一旦マトリツクスに結合して非拡
散化した貯蔵型の成長因子が、必要に応じて、拡散型の
成長因子に変わり、動員される機構は不明である。
散化した貯蔵型の成長因子が、必要に応じて、拡散型の
成長因子に変わり、動員される機構は不明である。
【００１０】ａＦＧＦ及びｂＦＧＦは現在極めて有効な
組織成長因子として広く細胞学実験に試薬として使われ
ているが、血管造成、組織修復、血液細胞増加など医療
上の薬剤としての有効性も期待され、多くのテストが報
告されるに至つている。
組織成長因子として広く細胞学実験に試薬として使われ
ているが、血管造成、組織修復、血液細胞増加など医療
上の薬剤としての有効性も期待され、多くのテストが報
告されるに至つている。
【００１１】この場合の障害の一つは投与後のプロテア
ーゼによる分解、そして低い分散性である。これをのり
こえる方策の一つとしてヘパリン存在下での使用例が報
告されその有効性も認められているが、ヘパリンは強い
抗血液凝固活性、そしてしばしば出血作用があり、医薬
としての使用に制限がある。
ーゼによる分解、そして低い分散性である。これをのり
こえる方策の一つとしてヘパリン存在下での使用例が報
告されその有効性も認められているが、ヘパリンは強い
抗血液凝固活性、そしてしばしば出血作用があり、医薬
としての使用に制限がある。
【００１２】また、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の構
成アミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている線維芽細
胞増殖因子ムテイン（ＦＧＦムテイン）とグリコサミノ
グリカンとの複合体あるいはこれらを配合した組成物が
報告されている（特開平２−４０３９９号）。
成アミノ酸が、別のアミノ酸で置換されている線維芽細
胞増殖因子ムテイン（ＦＧＦムテイン）とグリコサミノ
グリカンとの複合体あるいはこれらを配合した組成物が
報告されている（特開平２−４０３９９号）。
【００１３】この報告には、ＦＧＦムテインの水溶液に
グリコサミノグリカンを添加することにより、ＦＧＦム
テインの安定性が顕著に増大するという発見に基づき完
成された発明であると説明されている。また、この報告
には、グリコサミノグリカンの具体例として、ヘパラン
硫酸等が挙げられること、さらに、過酸化水素等を用い
て低分子化した低分子ヘパラン硫酸等が挙げられること
が記載されている。
グリコサミノグリカンを添加することにより、ＦＧＦム
テインの安定性が顕著に増大するという発見に基づき完
成された発明であると説明されている。また、この報告
には、グリコサミノグリカンの具体例として、ヘパラン
硫酸等が挙げられること、さらに、過酸化水素等を用い
て低分子化した低分子ヘパラン硫酸等が挙げられること
が記載されている。
【００１４】さらに、細胞の成長因子に親和性を示すヘ
パリン系少糖類と題する発明が報告されている（特開昭
６３−６６１９２号、以下サノフイ出願ということがあ
る）。
パリン系少糖類と題する発明が報告されている（特開昭
６３−６６１９２号、以下サノフイ出願ということがあ
る）。
【００１５】この発明は、ヘパリンに固着可能な細胞成
長因子に対して顕著な親和性を示すヘパリン型又は硫酸
ヘパラン型の少糖類の提供を目的とし、これらの少糖類
は、要約すれば、次に示す方法等によつて製造されるこ
とが示唆されている。
長因子に対して顕著な親和性を示すヘパリン型又は硫酸
ヘパラン型の少糖類の提供を目的とし、これらの少糖類
は、要約すれば、次に示す方法等によつて製造されるこ
とが示唆されている。
【００１６】すなわち、これらの少糖類は、原料として
自然のヘパリンもしくは自然の硫酸ヘパラン鎖を、硝
酸、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、過沃素酸により解
重合し（低分子化）、そしてアルコール沈殿して、１０
糖以下の部分と１０糖以上の部分とに分離し、１０糖以
下の部分をアガロースアクリルアミド・カラムにより、
２、４、６、８、１０糖に分離し、次いでＦＧＦアニオ
ン−セフアロースによりＦＧＦに親和性を示さない鎖又
は中庸の親和性を示す鎖を除去することにより、目的物
である各６糖、８糖、１０糖、末端が必要に応じて化学
的に変成された１２糖、又は多くとも１４糖を含むフラ
グメント（少糖類）を製造する方法に関する発明を示唆
している。
自然のヘパリンもしくは自然の硫酸ヘパラン鎖を、硝
酸、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、過沃素酸により解
重合し（低分子化）、そしてアルコール沈殿して、１０
糖以下の部分と１０糖以上の部分とに分離し、１０糖以
下の部分をアガロースアクリルアミド・カラムにより、
２、４、６、８、１０糖に分離し、次いでＦＧＦアニオ
ン−セフアロースによりＦＧＦに親和性を示さない鎖又
は中庸の親和性を示す鎖を除去することにより、目的物
である各６糖、８糖、１０糖、末端が必要に応じて化学
的に変成された１２糖、又は多くとも１４糖を含むフラ
グメント（少糖類）を製造する方法に関する発明を示唆
している。
【００１７】そして、この発明は、次式Ｉ：
【００１８】
【化１】
−(Ｇ−Ｈ）n−Ｇ− または−Ｈ−(Ｇ−Ｈ)n （I）
で示される構造の単位の連鎖を有する、式中、ｎは２〜
６の数を表わし、Ｇ−Ｈは、（イズロン酸・２−０−サ
ルフエート）−（Ｄ−グルコサミン−ＮＨ−サルフエー
ト・６−０−サルフエート）の構造の二糖類の鎖状構造
に対応しＧは、Ｌ−イズロン酸・２−サルフエートの構
造単位を表わし、Ｈは、Ｄ−グルコサミン・ＮＨ−サル
フエート・６−０−サルフエートの構造の単位を表わ
し、ヘパリンを認識するカチオン性又はアニオン性の細
胞成長因子に対して特異的な親和性を示す、基本的に鎖
から成る生成物と、医薬として認容可能なその塩を対象
とする、と記載されている。
６の数を表わし、Ｇ−Ｈは、（イズロン酸・２−０−サ
ルフエート）−（Ｄ−グルコサミン−ＮＨ−サルフエー
ト・６−０−サルフエート）の構造の二糖類の鎖状構造
に対応しＧは、Ｌ−イズロン酸・２−サルフエートの構
造単位を表わし、Ｈは、Ｄ−グルコサミン・ＮＨ−サル
フエート・６−０−サルフエートの構造の単位を表わ
し、ヘパリンを認識するカチオン性又はアニオン性の細
胞成長因子に対して特異的な親和性を示す、基本的に鎖
から成る生成物と、医薬として認容可能なその塩を対象
とする、と記載されている。
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記Ｆ
ＧＦムテインとグリコサミノグリカンとの複合体に関す
る発明は、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の構成アミノ
酸が別のアミノ酸で置換されており、天然に由来する線
維芽細胞増殖因子そのものではなく、そして低分子ヘパ
ラン硫酸をグリコサミノグリカンの一例として挙げてい
るが、具体的にはＦＧＦムテインと比較的鎖長が長いヘ
パリン及びヘパラン硫酸との複合体についてのみ記載さ
れている。
ＧＦムテインとグリコサミノグリカンとの複合体に関す
る発明は、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子の構成アミノ
酸が別のアミノ酸で置換されており、天然に由来する線
維芽細胞増殖因子そのものではなく、そして低分子ヘパ
ラン硫酸をグリコサミノグリカンの一例として挙げてい
るが、具体的にはＦＧＦムテインと比較的鎖長が長いヘ
パリン及びヘパラン硫酸との複合体についてのみ記載さ
れている。
【００２０】従つて、高分子量のヘパリンや未分画ヘパ
ラン硫酸がもつ薬理的、生理的に無用あるいは不都合な
構造部分、例えばアンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンＣ
ｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第４因子等に作用する部
分を合せ持つ恐れを考慮しなければならない。
ラン硫酸がもつ薬理的、生理的に無用あるいは不都合な
構造部分、例えばアンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリンＣ
ｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第４因子等に作用する部
分を合せ持つ恐れを考慮しなければならない。
【００２１】また、上記サノフイ出願、［イズロン酸・
２−サルフエート（α１→４）グルコサミン−ＮＨ−サ
ルフエート・６−０−サルフエート］2〜6を構造単位と
しており、グルコサミン残基の６位はすべて硫酸化され
ていること、さらにＤ−グルクロン酸、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｌ−イズロン酸が存在しないことのため
に、線維芽細胞増殖因子への結合がイオン性に依存する
度合いが強く、従つて線維芽細胞増殖因子への結合が非
生理的、非特異的であり、他の蛋白質やペプチド類とも
同様に結合し、中和される恐れが考慮される。さらにこ
の少糖類はヘパリン由来のため、ヘパリン固有の不都合
な薬理的、生理的作用を示す恐れも考慮される。
２−サルフエート（α１→４）グルコサミン−ＮＨ−サ
ルフエート・６−０−サルフエート］2〜6を構造単位と
しており、グルコサミン残基の６位はすべて硫酸化され
ていること、さらにＤ−グルクロン酸、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン、Ｌ−イズロン酸が存在しないことのため
に、線維芽細胞増殖因子への結合がイオン性に依存する
度合いが強く、従つて線維芽細胞増殖因子への結合が非
生理的、非特異的であり、他の蛋白質やペプチド類とも
同様に結合し、中和される恐れが考慮される。さらにこ
の少糖類はヘパリン由来のため、ヘパリン固有の不都合
な薬理的、生理的作用を示す恐れも考慮される。
【００２２】
【課題を解決するための手段】これらの状況に対して、
本発明者らはヘパラン硫酸にはＦＧＦに結合性を有する
画分及びＦＧＦに結合性を有さない画分があることを見
いだし、ＦＧＦに結合性を有する画分より、ＦＧＦに特
異的な親和性を持つ新規なオリゴ糖を製造することに成
功し、本発明に到達した。
本発明者らはヘパラン硫酸にはＦＧＦに結合性を有する
画分及びＦＧＦに結合性を有さない画分があることを見
いだし、ＦＧＦに結合性を有する画分より、ＦＧＦに特
異的な親和性を持つ新規なオリゴ糖を製造することに成
功し、本発明に到達した。
【００２３】すなわち、本発明の目的は、主たる２糖単
位がＬ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコ
サミンよりなり、かつ８−１８糖で構成される、線維芽
細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法
を提供することにある。本発明の他の目的は、コンドロ
イチン硫酸の存在下で、ヘパラン硫酸を酸性又は塩基性
線維芽細胞増殖因子結合担体に接触させて線維芽細胞増
殖因子に結合性を有するヘパラン硫酸画分を分離し、分
離したヘパラン硫酸画分をヘパリチナーゼＩにより消化
させ、得られる消化物をコンドロイチン硫酸の存在下
で、酸性又は塩基性線維芽細胞増殖因子結合担体に結合
させ、次いで脱着させることを特徴とする、線維芽細胞
増殖因子に結合性を有するオリゴ糖の製造法を提供する
ことにある。本発明の、主たる２糖単位とは、該２糖単
位がオリゴ糖鎖の大半を占めるという意味ではなく、必
須かつ比較的多く含むとの意味である。
位がＬ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコ
サミンよりなり、かつ８−１８糖で構成される、線維芽
細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法
を提供することにある。本発明の他の目的は、コンドロ
イチン硫酸の存在下で、ヘパラン硫酸を酸性又は塩基性
線維芽細胞増殖因子結合担体に接触させて線維芽細胞増
殖因子に結合性を有するヘパラン硫酸画分を分離し、分
離したヘパラン硫酸画分をヘパリチナーゼＩにより消化
させ、得られる消化物をコンドロイチン硫酸の存在下
で、酸性又は塩基性線維芽細胞増殖因子結合担体に結合
させ、次いで脱着させることを特徴とする、線維芽細胞
増殖因子に結合性を有するオリゴ糖の製造法を提供する
ことにある。本発明の、主たる２糖単位とは、該２糖単
位がオリゴ糖鎖の大半を占めるという意味ではなく、必
須かつ比較的多く含むとの意味である。
【００２４】本発明の線維芽細胞増殖因子に結合性を有
するオリゴ糖の製造方法を以下に説明する。
するオリゴ糖の製造方法を以下に説明する。
【００２５】出発原料のヘパラン硫酸としては、魚類
（サケ、サバ等）の内臓、鳥類（ニワトリ、ウズラ等）
の各種組織、臓器等、哺乳動物（ウシ、ブタ、ヒツジ
等）の各種組織、臓器等、実験動物（ラツト、マウス、
モルモツト等）の移植腫瘍組織等を原料として、一般に
知られているヘパラン硫酸調製法により製造すれば良
い。好ましい原料としては、収量、活性、製造コストの
有利性からみて、特にウシ、ブタ、ヒツジの小腸又は大
動脈、ニワトリ鶏冠、ヘパリン大量製造時に副生物とし
て得られる粗ヘパラン硫酸画分（アンチトロンビン低親
和性画分）等を挙げることができる。
（サケ、サバ等）の内臓、鳥類（ニワトリ、ウズラ等）
の各種組織、臓器等、哺乳動物（ウシ、ブタ、ヒツジ
等）の各種組織、臓器等、実験動物（ラツト、マウス、
モルモツト等）の移植腫瘍組織等を原料として、一般に
知られているヘパラン硫酸調製法により製造すれば良
い。好ましい原料としては、収量、活性、製造コストの
有利性からみて、特にウシ、ブタ、ヒツジの小腸又は大
動脈、ニワトリ鶏冠、ヘパリン大量製造時に副生物とし
て得られる粗ヘパラン硫酸画分（アンチトロンビン低親
和性画分）等を挙げることができる。
【００２６】上記ヘパラン硫酸調製法として注意すべき
点としては、組織の脱脂、水酸化ナトリウムによるヘパ
ラン硫酸とコア蛋白のβ−脱離、タンパク分解酵素によ
る除蛋白、エタノール沈殿分画、セチルピリジニウム沈
殿分画、ベネデイクト試薬によるデルマタン硫酸成分の
沈殿除去、ＤＥＡＥ−セルロースなど陰イオン交換体カ
ラムを用いるクロマトグラフイーなどを組み合わせて、
ヘパリンの除去を十分に行うこと、さらにデルマタン硫
酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸
等の類似の多糖成分の混入をできるだけ少なくすること
を挙げることができる。また、そのためには、必要に応
じて本発明の線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリ
ゴ糖に影響を与えない範囲で、該多糖に特異的な分解酵
素による消化・低分子化の操作を挿入してもよい。
点としては、組織の脱脂、水酸化ナトリウムによるヘパ
ラン硫酸とコア蛋白のβ−脱離、タンパク分解酵素によ
る除蛋白、エタノール沈殿分画、セチルピリジニウム沈
殿分画、ベネデイクト試薬によるデルマタン硫酸成分の
沈殿除去、ＤＥＡＥ−セルロースなど陰イオン交換体カ
ラムを用いるクロマトグラフイーなどを組み合わせて、
ヘパリンの除去を十分に行うこと、さらにデルマタン硫
酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸
等の類似の多糖成分の混入をできるだけ少なくすること
を挙げることができる。また、そのためには、必要に応
じて本発明の線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリ
ゴ糖に影響を与えない範囲で、該多糖に特異的な分解酵
素による消化・低分子化の操作を挿入してもよい。
【００２７】この様にして調製されたヘパラン硫酸は、
白色粉末となり、水に良く溶解し、［α］Dが＋３０〜
＋８０（原料によつて変化）を示し、全ヘキソサミン
（すべてＤ−グルコサミン）と全ヘキスロン酸（Ｄ−グ
ルクロン酸３０〜９０％＋Ｌ−イズロン酸１０〜７０
％、原料によつて可変）とのモル比がほぼ１のものが得
られる。また、これらのヘパラン硫酸は、Ｎ−アセチル
基、Ｎ−硫酸基、Ｏ−硫酸基のモル比は、かなり幅広く
変化する。
白色粉末となり、水に良く溶解し、［α］Dが＋３０〜
＋８０（原料によつて変化）を示し、全ヘキソサミン
（すべてＤ−グルコサミン）と全ヘキスロン酸（Ｄ−グ
ルクロン酸３０〜９０％＋Ｌ−イズロン酸１０〜７０
％、原料によつて可変）とのモル比がほぼ１のものが得
られる。また、これらのヘパラン硫酸は、Ｎ−アセチル
基、Ｎ−硫酸基、Ｏ−硫酸基のモル比は、かなり幅広く
変化する。
【００２８】［本発明の原料として好適なヘパラン硫酸
の調製］上記のようにして調製したヘパラン硫酸は、通
常、次いでこれをコンドロイチン硫酸含有緩衝液に溶解
し、ａＦＧＦ又はｂＦＧＦ結合担体に接触させ、本発明
の原料として好適なヘパラン硫酸を該担体に結合させ、
かつ、結合しなかつたヘパラン硫酸や不純物を除去し、
次いで食塩を含有する上記緩衝液により、本発明の原料
として好適なヘパラン硫酸を該担体から脱着させる。
の調製］上記のようにして調製したヘパラン硫酸は、通
常、次いでこれをコンドロイチン硫酸含有緩衝液に溶解
し、ａＦＧＦ又はｂＦＧＦ結合担体に接触させ、本発明
の原料として好適なヘパラン硫酸を該担体に結合させ、
かつ、結合しなかつたヘパラン硫酸や不純物を除去し、
次いで食塩を含有する上記緩衝液により、本発明の原料
として好適なヘパラン硫酸を該担体から脱着させる。
【００２９】ＦＧＦを結合させる担体としては、アガロ
ースゲル等を挙げることができる。好ましい担体として
は、セフアデツクス（フアルマシア社販売）、バイオゲ
ル（バイオラド社販売）、セフアローズ（フアルマシア
社販売）等を挙げることができる。
ースゲル等を挙げることができる。好ましい担体として
は、セフアデツクス（フアルマシア社販売）、バイオゲ
ル（バイオラド社販売）、セフアローズ（フアルマシア
社販売）等を挙げることができる。
【００３０】担体に結合させるＦＧＦとしては、ａＦＧ
Ｆであつても、また、ｂＦＧＦであつても良い（以下、
ａＦＧＦ又はｂＦＧＦを単にＦＧＦと記すことがあ
る）。
Ｆであつても、また、ｂＦＧＦであつても良い（以下、
ａＦＧＦ又はｂＦＧＦを単にＦＧＦと記すことがあ
る）。
【００３１】ａＦＧＦ、ｂＦＧＦとも商業的に入手可能
であり、例えばウシ脳下垂体から分離された天然ａＦＧ
Ｆ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社販売）、ひと組み替えａＦＧＦ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社販売）及びウシ組み替えｂＦＧＦ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社販売）等が使用できる。
であり、例えばウシ脳下垂体から分離された天然ａＦＧ
Ｆ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社販売）、ひと組み替えａＦＧＦ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社販売）及びウシ組み替えｂＦＧＦ
（Ａｍｅｒｓｈａｍ社販売）等が使用できる。
【００３２】ＦＧＦ担体の調製法としては、以下の方法
を挙げることができる。
を挙げることができる。
【００３３】例えば、適当量のＦＧＦを適当量のカツプ
リング緩衝液に溶解し、予め無水酢酸処理したヘパラン
硫酸を加え、次いで臭化シアンで活性化したアガロース
ゲル、例えばセフアロースをカツプリング緩衝液に懸濁
させた溶液を加え、低温にて反応を行わせ、該緩衝液を
使用して十分洗浄することにより、ＦＧＦ担体を調製す
る。
リング緩衝液に溶解し、予め無水酢酸処理したヘパラン
硫酸を加え、次いで臭化シアンで活性化したアガロース
ゲル、例えばセフアロースをカツプリング緩衝液に懸濁
させた溶液を加え、低温にて反応を行わせ、該緩衝液を
使用して十分洗浄することにより、ＦＧＦ担体を調製す
る。
【００３４】上記のようにして調製したヘパラン硫酸
を、ＦＧＦ担体に結合させ、次いで脱着させる方法とし
ては、特定の溶液により平衡化したＦＧＦ担体と特定の
溶液に溶解したヘパラン硫酸とを接触させ、ヘパラン硫
酸結合ＦＧＦ担体を分離後特定の溶離液によりヘパラン
硫酸を脱着させる、所謂、バツチ法を挙げることができ
る。
を、ＦＧＦ担体に結合させ、次いで脱着させる方法とし
ては、特定の溶液により平衡化したＦＧＦ担体と特定の
溶液に溶解したヘパラン硫酸とを接触させ、ヘパラン硫
酸結合ＦＧＦ担体を分離後特定の溶離液によりヘパラン
硫酸を脱着させる、所謂、バツチ法を挙げることができ
る。
【００３５】また、ＦＧＦ担体を円筒（カラム）に充填
し、特定の溶液により平衡化し、そして特定の溶液に溶
解したヘパラン硫酸を、このカラムに流通させることに
よりＦＧＦ担体にヘパラン硫酸を結合させ、次いで該担
体から特定の溶離液により溶離させ、予め基準物質＊で
計測（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）した位置（例えば、3Ｈ標
識検体使用、あるいはウロン酸定量）のヘパラン硫酸を
採取する、所謂、カラムクロマトグラフ法を挙げること
ができる。
し、特定の溶液により平衡化し、そして特定の溶液に溶
解したヘパラン硫酸を、このカラムに流通させることに
よりＦＧＦ担体にヘパラン硫酸を結合させ、次いで該担
体から特定の溶離液により溶離させ、予め基準物質＊で
計測（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）した位置（例えば、3Ｈ標
識検体使用、あるいはウロン酸定量）のヘパラン硫酸を
採取する、所謂、カラムクロマトグラフ法を挙げること
ができる。
【００３６】＊ヘパラン硫酸画分は、カルバゾール法及
びオルシノール法による構成糖の化学分析により確認
し、そのうちＦＧＦ担体カラムに吸着するヘパラン硫酸
画分をあらかじめ調製して、この画分を基準物質として
用いた。
びオルシノール法による構成糖の化学分析により確認
し、そのうちＦＧＦ担体カラムに吸着するヘパラン硫酸
画分をあらかじめ調製して、この画分を基準物質として
用いた。
【００３７】ＦＧＦ担体の平衡化及びヘパラン硫酸の溶
解に用いられる特定の溶液としては、例えばコンドロイ
チン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫
酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ及びコンドロイチン硫酸Ｅ
から選ばれるコンドロイチン硫酸の少なくとも１つを含
有する燐酸緩衝液が好ましい。このようなコンドロイチ
ン硫酸は商業的に入手可能であり、例えばサメ軟骨由来
のコンドロイチン６−硫酸（生化学工業株式会社製）が
あげられる。コンドロイチン硫酸の濃度は約２００μｇ
／ｍｌに調整される。また、燐酸緩衝液としては、０．
１５Ｍ ＮａＣｌを含む燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
（＋）（ｐＨ７．２）が用いられる。
解に用いられる特定の溶液としては、例えばコンドロイ
チン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫
酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ及びコンドロイチン硫酸Ｅ
から選ばれるコンドロイチン硫酸の少なくとも１つを含
有する燐酸緩衝液が好ましい。このようなコンドロイチ
ン硫酸は商業的に入手可能であり、例えばサメ軟骨由来
のコンドロイチン６−硫酸（生化学工業株式会社製）が
あげられる。コンドロイチン硫酸の濃度は約２００μｇ
／ｍｌに調整される。また、燐酸緩衝液としては、０．
１５Ｍ ＮａＣｌを含む燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
（＋）（ｐＨ７．２）が用いられる。
【００３８】特定の溶離液としては、例えば食塩を含有
する燐酸緩衝液を挙げることができる。食塩の濃度は０
−３Ｍ、燐酸緩衝液としてはＰＢＳ（＋）が用いられ
る。特定の溶離液により溶離させる方法としては、例え
ば燐酸緩衝液として２Ｍ食塩を含むＰＢＳ（＋）（ｐＨ
７．２）を用いて溶出する方法、あるいは燐酸緩衝液、
例えばＰＢＳ（＋）（ｐＨ７．２）に漸次食塩溶液（０
−３Ｍ）を添加しつつカラムからヘパラン硫酸を溶離さ
せる、所謂、直線的濃度勾配法を挙げることができる。
する燐酸緩衝液を挙げることができる。食塩の濃度は０
−３Ｍ、燐酸緩衝液としてはＰＢＳ（＋）が用いられ
る。特定の溶離液により溶離させる方法としては、例え
ば燐酸緩衝液として２Ｍ食塩を含むＰＢＳ（＋）（ｐＨ
７．２）を用いて溶出する方法、あるいは燐酸緩衝液、
例えばＰＢＳ（＋）（ｐＨ７．２）に漸次食塩溶液（０
−３Ｍ）を添加しつつカラムからヘパラン硫酸を溶離さ
せる、所謂、直線的濃度勾配法を挙げることができる。
【００３９】ａＦＧＦ担体を用いる場合は、燐酸緩衝液
に安定剤として５ｍＭジチオスライトールが添加され
る。
に安定剤として５ｍＭジチオスライトールが添加され
る。
【００４０】上記に説明したヘパラン硫酸の調製法は、
例えばＦＧＦ担体に結合性を有するヘパラン硫酸の含有
量が中程度以下のヘパラン硫酸から高度のヘパラン硫酸
を採取する方法を示すものである。
例えばＦＧＦ担体に結合性を有するヘパラン硫酸の含有
量が中程度以下のヘパラン硫酸から高度のヘパラン硫酸
を採取する方法を示すものである。
【００４１】ＦＧＦ担体に結合性を有するヘパラン硫酸
の含有量が高度のものとしては、例えばブタ大動脈由来
のヘパラン硫酸（約９２％含有）等を挙げることがで
き、そして中程度以下のものとしては、例えばマウスＥ
ＨＳ−腫瘍ヘパラン硫酸（約４６％含有）等を挙げるこ
とができる。
の含有量が高度のものとしては、例えばブタ大動脈由来
のヘパラン硫酸（約９２％含有）等を挙げることがで
き、そして中程度以下のものとしては、例えばマウスＥ
ＨＳ−腫瘍ヘパラン硫酸（約４６％含有）等を挙げるこ
とができる。
【００４２】そして、例えばブタ大動脈由来のヘパラン
硫酸のようにＦＧＦ担体に結合性を有するヘパラン硫酸
の含有量が高度のものは、時として上記操作を省略する
ことができる。
硫酸のようにＦＧＦ担体に結合性を有するヘパラン硫酸
の含有量が高度のものは、時として上記操作を省略する
ことができる。
【００４３】［主たる２糖単位が、Ｌ−イズロン酸２硫
酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりなり、８−１
８糖で構成される、ＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の
調製］上記のようにして調製した、ＦＧＦ担体に結合性
を有するヘパラン硫酸を、通常の条件で、ヘパリチナー
ゼＩにより消化させて、本発明のオリゴ糖含有混合体を
調製する。
酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりなり、８−１
８糖で構成される、ＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の
調製］上記のようにして調製した、ＦＧＦ担体に結合性
を有するヘパラン硫酸を、通常の条件で、ヘパリチナー
ゼＩにより消化させて、本発明のオリゴ糖含有混合体を
調製する。
【００４４】本発明におけるヘパリチナーゼＩは、Ｌ−
イズロン酸２硫酸残基の関係する結合を切断しない酵
素、例えばＬ−イズロン酸とＮ−スルホ−Ｄ−グルコサ
ミンとの結合、Ｌ−イズロン酸とＮ−スルホ−Ｄ−グル
コサミン６硫酸との結合、Ｌ−イズロン酸２硫酸とＮ−
スルホ−Ｄ−グルコサミンとの結合、Ｌ−イズロン酸２
硫酸とＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６硫酸との結合等
を切断しない酵素であり、ＥＣ４．２．２．８に分類さ
れる酵素群の中で、生化学工業株式会社によりヘパリチ
ナーゼＩとして、シグマ社によりヘパリナーゼＩＩＩと
して販売されている酵素等を挙げることができる。
イズロン酸２硫酸残基の関係する結合を切断しない酵
素、例えばＬ−イズロン酸とＮ−スルホ−Ｄ−グルコサ
ミンとの結合、Ｌ−イズロン酸とＮ−スルホ−Ｄ−グル
コサミン６硫酸との結合、Ｌ−イズロン酸２硫酸とＮ−
スルホ−Ｄ−グルコサミンとの結合、Ｌ−イズロン酸２
硫酸とＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６硫酸との結合等
を切断しない酵素であり、ＥＣ４．２．２．８に分類さ
れる酵素群の中で、生化学工業株式会社によりヘパリチ
ナーゼＩとして、シグマ社によりヘパリナーゼＩＩＩと
して販売されている酵素等を挙げることができる。
【００４５】例えば、２５−２００ｍＵのヘパリチナー
ゼＩ（ＥＣ ４．２．２．８、生化学工業株式会社販
売）、約０．５μｍｏｌの塩化カルシウム及び約５０μ
ｇのウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩
衝液５００μｌに、ＦＧＦに親和性をもつヘパラン硫酸
約５ｍｇを加え３０−３７℃に約１時間保持して本発明
のオリゴ糖混合物を製造することができる。
ゼＩ（ＥＣ ４．２．２．８、生化学工業株式会社販
売）、約０．５μｍｏｌの塩化カルシウム及び約５０μ
ｇのウシ血清アルブミンを含む０．０５Ｍトリス塩酸緩
衝液５００μｌに、ＦＧＦに親和性をもつヘパラン硫酸
約５ｍｇを加え３０−３７℃に約１時間保持して本発明
のオリゴ糖混合物を製造することができる。
【００４６】上記消化により得られたオリゴ糖を、前述
のＦＧＦ担体を調製したときに使用した特定の溶液に溶
解し、ＦＧＦ担体にのせ、低温度で十分に結合させ、結
合しなかつたオリゴ糖を上記特定の溶液で洗浄すること
により除去し、次いで、該ＦＧＦ担体から前述の特定の
溶離液を用いて、ＦＧＦ担体に結合性を有するオリゴ糖
を分離する。この操作は上記と同様におこなわれる。
のＦＧＦ担体を調製したときに使用した特定の溶液に溶
解し、ＦＧＦ担体にのせ、低温度で十分に結合させ、結
合しなかつたオリゴ糖を上記特定の溶液で洗浄すること
により除去し、次いで、該ＦＧＦ担体から前述の特定の
溶離液を用いて、ＦＧＦ担体に結合性を有するオリゴ糖
を分離する。この操作は上記と同様におこなわれる。
【００４７】オリゴ糖の溶解に用いられる特定の溶液と
しては、例えばコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン
硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ
及びコンドロイチン硫酸Ｅから選ばれるコンドロイチン
硫酸の少なくとも１つを含有する燐酸緩衝液が好まし
い。
しては、例えばコンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン
硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ
及びコンドロイチン硫酸Ｅから選ばれるコンドロイチン
硫酸の少なくとも１つを含有する燐酸緩衝液が好まし
い。
【００４８】特定の溶離液としては、例えば、食塩を含
有する燐酸緩衝液を挙げることができる。
有する燐酸緩衝液を挙げることができる。
【００４９】オリゴ糖をＦＧＦ担体に結合させ、次いで
分離する方法としては、特定の溶液により平衡化したＦ
ＧＦ担体と特定の溶液に溶解したオリゴ糖とを接触さ
せ、オリゴ糖結合ＦＧＦ担体を分離後特定の溶離液によ
りオリゴ糖を脱着させる、所謂、バツチ法を挙げること
ができる。
分離する方法としては、特定の溶液により平衡化したＦ
ＧＦ担体と特定の溶液に溶解したオリゴ糖とを接触さ
せ、オリゴ糖結合ＦＧＦ担体を分離後特定の溶離液によ
りオリゴ糖を脱着させる、所謂、バツチ法を挙げること
ができる。
【００５０】また、ＦＧＦ担体を円筒（カラム）に充填
し、特定の溶液により平衡化し、そして特定の溶液に溶
解したオリゴ糖を、このカラムに流通させることにより
ＦＧＦ担体にオリゴ糖を結合させ、次いで該担体から特
定の溶離液により、溶離し、予め基準物質（例えば、3
Ｈ標識検体使用）で計測した位置のオリゴ糖を採取す
る、所謂、カラムクロマトグラフ法を挙げることができ
る。
し、特定の溶液により平衡化し、そして特定の溶液に溶
解したオリゴ糖を、このカラムに流通させることにより
ＦＧＦ担体にオリゴ糖を結合させ、次いで該担体から特
定の溶離液により、溶離し、予め基準物質（例えば、3
Ｈ標識検体使用）で計測した位置のオリゴ糖を採取す
る、所謂、カラムクロマトグラフ法を挙げることができ
る。
【００５１】特定の溶離液により溶離させる方法として
は、例えば燐酸緩衝液に漸次食塩溶液を添加しつつ、オ
リゴ糖を溶離させる、所謂、直線的濃度勾配法を挙げる
ことができる。
は、例えば燐酸緩衝液に漸次食塩溶液を添加しつつ、オ
リゴ糖を溶離させる、所謂、直線的濃度勾配法を挙げる
ことができる。
【００５２】上記の様にして分離された、オリゴ糖は、
本発明の目的物である、主たる２糖単位が、Ｌ−イズロ
ン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりな
り、８−１８糖で構成される、ＦＧＦに結合性を有する
オリゴ糖である。また、本発明のオリゴ糖は、上記８−
１８糖で構成されるオリゴ糖の２以上の混合物であって
もよい。
本発明の目的物である、主たる２糖単位が、Ｌ−イズロ
ン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりな
り、８−１８糖で構成される、ＦＧＦに結合性を有する
オリゴ糖である。また、本発明のオリゴ糖は、上記８−
１８糖で構成されるオリゴ糖の２以上の混合物であって
もよい。
【００５３】上記の方法により調製された８−１８糖で
構成される、本発明のオリゴ糖は、さらに特定の糖サイ
ズに分画することができる。
構成される、本発明のオリゴ糖は、さらに特定の糖サイ
ズに分画することができる。
【００５４】例えば、上記の方法により調製された８−
１８糖で構成されるオリゴ糖を、分子量により分画する
方法を挙げることができる。
１８糖で構成されるオリゴ糖を、分子量により分画する
方法を挙げることができる。
【００５５】分子量により分画する方法としては、所
謂、分子篩法により分画すれば良い。分子篩に使用する
充填剤としては、例えばアガロースゲル等を挙げること
ができる。好ましい担体としては、セフアデツクス（フ
アルマシア社販売）、バイオゲル（バイオラド社販
売）、セフアローズ（フアルマシア社販売）等を挙げる
ことができる。
謂、分子篩法により分画すれば良い。分子篩に使用する
充填剤としては、例えばアガロースゲル等を挙げること
ができる。好ましい担体としては、セフアデツクス（フ
アルマシア社販売）、バイオゲル（バイオラド社販
売）、セフアローズ（フアルマシア社販売）等を挙げる
ことができる。
【００５６】例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（フ
アルマシア社販売）を充填剤とするカラムクロマトグラ
フイーを行うことにより、２−１８糖の各オリゴ糖の範
囲で再分画ことができる。
アルマシア社販売）を充填剤とするカラムクロマトグラ
フイーを行うことにより、２−１８糖の各オリゴ糖の範
囲で再分画ことができる。
【００５７】［作用］本発明は、生体内の細胞外マトリ
ツクス中に貯蔵され、生理的ＦＧＦ−結合物質の結合相
手の構成成分として知られているヘパラン硫酸から、
（１）ＦＧＦ結合ドメインを残すようなヘパリチナーゼ
Ｉ消化、（２）ヘパラン硫酸結合ドメインを保護する条
件下でのｂＦＧＦ−固定化カラムの作成、（３）非特異
的イオン結合を防ぐアフイニテイークロマトグラフイー
という３つの工夫を柱にＦＧＦに結合性を有する本発明
のオリゴ糖を製造することができる。
ツクス中に貯蔵され、生理的ＦＧＦ−結合物質の結合相
手の構成成分として知られているヘパラン硫酸から、
（１）ＦＧＦ結合ドメインを残すようなヘパリチナーゼ
Ｉ消化、（２）ヘパラン硫酸結合ドメインを保護する条
件下でのｂＦＧＦ−固定化カラムの作成、（３）非特異
的イオン結合を防ぐアフイニテイークロマトグラフイー
という３つの工夫を柱にＦＧＦに結合性を有する本発明
のオリゴ糖を製造することができる。
【００５８】本発明は、主たる２糖単位が、Ｌ−イズロ
ン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりな
り、８−１８糖で構成され、アンチトロンビンＩＩＩ、
ヘパリンＣｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第１因子等に
作用せず、かつ、ＦＧＦに結合性を有するものである。
本発明のオリゴ糖は、ＦＧＦと単に混合するのみで、容
易にＦＧＦとの複合体を形成する。ＦＧＦと本発明のオ
リゴ糖からなる組成物は医薬としての用途が期待され
る。
ン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりな
り、８−１８糖で構成され、アンチトロンビンＩＩＩ、
ヘパリンＣｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第１因子等に
作用せず、かつ、ＦＧＦに結合性を有するものである。
本発明のオリゴ糖は、ＦＧＦと単に混合するのみで、容
易にＦＧＦとの複合体を形成する。ＦＧＦと本発明のオ
リゴ糖からなる組成物は医薬としての用途が期待され
る。
【００５９】
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに説明する
が、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。
が、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。
【００６０】（ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの作成）
ｂＦＧＦ（ウシ、リコンビナント製品、アマーシヤム社
販売）２００μｇをカツプリング緩衝液（０．４Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．３）
０．５ｍｌに溶解し、前もつて無水酢酸処理したヘパラ
ン硫酸（ブタ大動脈から調製）２００μｇを加え、室温
に１０分間放置した。
ｂＦＧＦ（ウシ、リコンビナント製品、アマーシヤム社
販売）２００μｇをカツプリング緩衝液（０．４Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８．３）
０．５ｍｌに溶解し、前もつて無水酢酸処理したヘパラ
ン硫酸（ブタ大動脈から調製）２００μｇを加え、室温
に１０分間放置した。
【００６１】臭化シアン（ＣＮＢｒ）で活性化したＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ（フアルマシア社販売）０．５ｍｌを等
量のカツプリング緩衝液に懸濁し、上記により作成した
ｂＦＧＦ溶液を加え、４℃で一夜緩やかに振とうした。
ｐｈａｒｏｓｅ（フアルマシア社販売）０．５ｍｌを等
量のカツプリング緩衝液に懸濁し、上記により作成した
ｂＦＧＦ溶液を加え、４℃で一夜緩やかに振とうした。
【００６２】得られたゲルをカツプリング緩衝液で十分
に洗浄後、トリス塩酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）
９００μｌに懸濁し、４℃で一夜緩やかに振とうし、ｂ
ＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｂＦＧＦの結合量＝１２
０μｇ）を作成した。
に洗浄後、トリス塩酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）
９００μｌに懸濁し、４℃で一夜緩やかに振とうし、ｂ
ＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ｂＦＧＦの結合量＝１２
０μｇ）を作成した。
【００６３】（ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用す
る標準ヘパラン硫酸溶出曲線の作成） ヘパラン硫酸を
［3Ｈ］ＮａＢＨ4で処理してヘパラン硫酸の還元末端を
3Ｈ標識し、ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでク
ロマト展開し、溶出液を3Ｈの放射能測定によつてモニ
タリングし溶出曲線を作成した。
る標準ヘパラン硫酸溶出曲線の作成） ヘパラン硫酸を
［3Ｈ］ＮａＢＨ4で処理してヘパラン硫酸の還元末端を
3Ｈ標識し、ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでク
ロマト展開し、溶出液を3Ｈの放射能測定によつてモニ
タリングし溶出曲線を作成した。
【００６４】（ｂＦＧＦ−高親和性ヘパラン硫酸の分
画）ＣａＣｌ2 ０．９ｍＭ及びＭｇＣｌ2 ０．４８ｍＭ
を含む燐酸緩衝液（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に
０．０２重量％になるようにコンドロイチン硫酸（サメ
型、生化学工業株式会社販売）を溶解し、緩衝液Ａ＊と
した。
画）ＣａＣｌ2 ０．９ｍＭ及びＭｇＣｌ2 ０．４８ｍＭ
を含む燐酸緩衝液（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ７．２）に
０．０２重量％になるようにコンドロイチン硫酸（サメ
型、生化学工業株式会社販売）を溶解し、緩衝液Ａ＊と
した。
【００６５】ブタ大動脈ヘパラン硫酸１００μｇを３倍
量の緩衝液Ａ＊に溶解し、前もつて緩衝液Ａ＊で平衡化
したｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ｂＦＧＦが
１２０μｇ結合している）にのせて４℃で２時間穏やか
に振とうした。
量の緩衝液Ａ＊に溶解し、前もつて緩衝液Ａ＊で平衡化
したｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ｂＦＧＦが
１２０μｇ結合している）にのせて４℃で２時間穏やか
に振とうした。
【００６６】ゲルに結合しなかつたヘパラン硫酸を緩衝
液Ａ＊で洗浄・除去した後、カラムをＰＢＳ／３Ｍ Ｎ
ａＣｌの直線濃度勾配法によつて溶出し、コンドロイチ
ナーゼにより消化後、予め標準品による3Ｈの放射能を
モニタリングして作図した溶出曲線に従つて、溶出液の
コンドロイチナーゼ抵抗性物質のヘキスロン酸値を測定
し、図１に示す溶出曲線を作図するとともに、ｂＦＧＦ
−高親和性ヘパラン硫酸を分画した。
液Ａ＊で洗浄・除去した後、カラムをＰＢＳ／３Ｍ Ｎ
ａＣｌの直線濃度勾配法によつて溶出し、コンドロイチ
ナーゼにより消化後、予め標準品による3Ｈの放射能を
モニタリングして作図した溶出曲線に従つて、溶出液の
コンドロイチナーゼ抵抗性物質のヘキスロン酸値を測定
し、図１に示す溶出曲線を作図するとともに、ｂＦＧＦ
−高親和性ヘパラン硫酸を分画した。
【００６７】マウスＥＨＳ−腫瘍ヘパラン硫酸を上記と
同様に処理してｂＦＧＦ−高親和性ヘパラン硫酸を分画
し、同様に図１に示した。
同様に処理してｂＦＧＦ−高親和性ヘパラン硫酸を分画
し、同様に図１に示した。
【００６８】ブタ大動脈ヘパラン硫酸は、約９２％がｂ
ＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したが、マウスＥＨ
Ｓ−腫瘍ヘパラン硫酸は、約４６％が結合するのみであ
つた。
ＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したが、マウスＥＨ
Ｓ−腫瘍ヘパラン硫酸は、約４６％が結合するのみであ
つた。
【００６９】（ｂＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の作
成）上記により分画したｂＦＧＦ−高親和性ヘパラン硫
酸を次の条件で処理し、オリゴ糖混合体を作成した。
成）上記により分画したｂＦＧＦ−高親和性ヘパラン硫
酸を次の条件で処理し、オリゴ糖混合体を作成した。
【００７０】
ヘパリチナーゼＩ（ＥＣ４．２．２．８、生化学工業株式会社販売）
５０ミリユニツト
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２） ２５μｍｏｌ
ＣａＣｌ2 ０．５μｍｏｌ
ウシ血清アルブミン ５０μｇ
を、全容積５００μｌとして、これにＦＧＦ−高親和性
ヘパラン硫酸５ｍｇを加え、３７℃に６０分間保持して
オリゴ糖混合体を作成した。反応は、１００℃、２分間
の加熱により停止させた。
ヘパラン硫酸５ｍｇを加え、３７℃に６０分間保持して
オリゴ糖混合体を作成した。反応は、１００℃、２分間
の加熱により停止させた。
【００７１】緩衝液Ａ＊３００μｌに、上記で得られた
オリゴ糖混合体５０μｇを溶解し、予め基準物質で計測
（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）したｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅカラムにのせ、４℃で２時間振とうした。結合しな
かつたオリゴ糖を５ｍｌの緩衝液Ａ＊で洗浄及び除去し
た後、カラムを３Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで溶出し、
3Ｈ標識検体を使用し、図２に示す溶出曲線を作成し
た。
オリゴ糖混合体５０μｇを溶解し、予め基準物質で計測
（ｃａｌｉｂｒａｔｅ）したｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅカラムにのせ、４℃で２時間振とうした。結合しな
かつたオリゴ糖を５ｍｌの緩衝液Ａ＊で洗浄及び除去し
た後、カラムを３Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで溶出し、
3Ｈ標識検体を使用し、図２に示す溶出曲線を作成し
た。
【００７２】ブタ大動脈ヘパラン硫酸由来のオリゴ糖の
うち約１３％が、本発明のＦＧＦに結合性を有するオリ
ゴ糖であつた。
うち約１３％が、本発明のＦＧＦに結合性を有するオリ
ゴ糖であつた。
【００７３】（ｂＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の精
製）上記により得られたオリゴ糖画分をＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−５０（フアルマシア社販売）カラム（１．２×
１２０ｃｍ）を使用し、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出して
さらに精製した。
製）上記により得られたオリゴ糖画分をＳｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ−５０（フアルマシア社販売）カラム（１．２×
１２０ｃｍ）を使用し、０．５Ｍ ＮａＣｌで溶出して
さらに精製した。
【００７４】図３は、3Ｈ標識検体を使用し予めカラム
を計測する方法により作図した１６−１８糖（分子量
３，７００〜４，０００）にピークをもつブロードな溶
出パターンを示している。
を計測する方法により作図した１６−１８糖（分子量
３，７００〜４，０００）にピークをもつブロードな溶
出パターンを示している。
【００７５】上記により得られた１６〜１８糖画分のう
ち、上記ピークの後半部分（平均糖として１６糖からな
る成分、以下１６糖成分と称する）を次の条件で処理し
て２糖に消化し、その組成を表１に示した。表１には、
同一原料から同様の操作を行いｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラムに結合しなかつたオリゴ糖の２糖組成を合
わせて記載した。
ち、上記ピークの後半部分（平均糖として１６糖からな
る成分、以下１６糖成分と称する）を次の条件で処理し
て２糖に消化し、その組成を表１に示した。表１には、
同一原料から同様の操作を行いｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラムに結合しなかつたオリゴ糖の２糖組成を合
わせて記載した。
【００７６】
ヘパリチナーゼＩ ４ ミリユニツト
ヘパリチナーゼＩＩ ２ ミリユニツト
ヘパリナーゼ
（ＥＣ４．２．２．７、生化学工業株式会社販売） ４ ミリユニツト
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．２） ５０ ｍＭ（最終濃度）
ＣａＣｌ2 １ ｍＭ（最終濃度）
ウシ血清アルブミン ２．５μｇ
を、水で最終容積２５μｌとして、これに上記により得
られた１６糖成分の１０μｇを加え、３７℃に２時間保
持して２糖に消化した。反応は、１００℃、２分間の加
熱により停止させた。
られた１６糖成分の１０μｇを加え、３７℃に２時間保
持して２糖に消化した。反応は、１００℃、２分間の加
熱により停止させた。
【００７７】
【表１】
【００７８】（ＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の生理
活性） （１）プロテアーゼ抵抗性賦与：ＦＧＦに結合性を有す
る本発明のオリゴ糖（１６−１８糖）２０μｇ、ａＦＧ
Ｆ１０、２０、３０又は４０ｎｇ、ウシ血清アルブミン
５０μｇ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＣａＣｌ2 ０．９ｍ
Ｍ及びＭｇＣｌ2 ０．４ｍＭを含む、９０μｌのトリス
塩酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ７．０）を、３７℃で
５分間保温してから、１０μｌの０．６５ユニツトのト
リプシン−Ｓｅｐａｒｏｓｅ（シグマ社販売）を加え、
さらに３７℃で３時間保温した。遠心濾過してトリプシ
ン−Ｓｅｐａｒｏｓｅを沈殿除去し、濾液（上清）をウ
シ大動脈平滑組織培養系に加えて［3Ｈ］チミジンのＤ
ＮＡへのとりこみ活性に対する効果を測定し、図４に示
した。同様にして、前記ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラムに結合しなかつたオリゴ糖（１６−１８糖）の２
０μｇを添加した場合及びなにも添加しなかつた場合を
も合わせて図４に示した。図４から明らかなように、ａ
ＦＧＦが完全に分解し、失活する条件下でＦＧＦに結合
性を有する本発明のオリゴ糖はほぼ完全に失活を防御す
ることが理解される。さらに、ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラムに結合しなかつたオリゴ糖（１６−１８
糖）にはその様な防御活性は全く無いことが理解され
る。
活性） （１）プロテアーゼ抵抗性賦与：ＦＧＦに結合性を有す
る本発明のオリゴ糖（１６−１８糖）２０μｇ、ａＦＧ
Ｆ１０、２０、３０又は４０ｎｇ、ウシ血清アルブミン
５０μｇ、ＮａＣｌ ０．１５Ｍ、ＣａＣｌ2 ０．９ｍ
Ｍ及びＭｇＣｌ2 ０．４ｍＭを含む、９０μｌのトリス
塩酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ７．０）を、３７℃で
５分間保温してから、１０μｌの０．６５ユニツトのト
リプシン−Ｓｅｐａｒｏｓｅ（シグマ社販売）を加え、
さらに３７℃で３時間保温した。遠心濾過してトリプシ
ン−Ｓｅｐａｒｏｓｅを沈殿除去し、濾液（上清）をウ
シ大動脈平滑組織培養系に加えて［3Ｈ］チミジンのＤ
ＮＡへのとりこみ活性に対する効果を測定し、図４に示
した。同様にして、前記ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラムに結合しなかつたオリゴ糖（１６−１８糖）の２
０μｇを添加した場合及びなにも添加しなかつた場合を
も合わせて図４に示した。図４から明らかなように、ａ
ＦＧＦが完全に分解し、失活する条件下でＦＧＦに結合
性を有する本発明のオリゴ糖はほぼ完全に失活を防御す
ることが理解される。さらに、ｂＦＧＦ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラムに結合しなかつたオリゴ糖（１６−１８
糖）にはその様な防御活性は全く無いことが理解され
る。
【００７９】（２）マトリツクス内拡散性の増強：６０
ｍｍ組織培養皿上でウシ内皮細胞を培養して得られる単
層（集密期）細胞群の中央に１２ｍｍの底なしカツプを
置き、それに１５ｎｇのｂＦＧＦを含むＭＥＭ培地２０
０μｌ及び１５ｎｇのｂＦＧＦと２０μｇの本発明のオ
リゴ糖を含むＭＥＭ培地２００μｌをそれぞれ加えてか
ら、通常の細胞条件下に培養した。３６時間後に細胞層
をＰＢＳで洗浄し、メタノール固定下後ギムザ染色し、
光学顕微鏡で細胞形態の変化を観察した。
ｍｍ組織培養皿上でウシ内皮細胞を培養して得られる単
層（集密期）細胞群の中央に１２ｍｍの底なしカツプを
置き、それに１５ｎｇのｂＦＧＦを含むＭＥＭ培地２０
０μｌ及び１５ｎｇのｂＦＧＦと２０μｇの本発明のオ
リゴ糖を含むＭＥＭ培地２００μｌをそれぞれ加えてか
ら、通常の細胞条件下に培養した。３６時間後に細胞層
をＰＢＳで洗浄し、メタノール固定下後ギムザ染色し、
光学顕微鏡で細胞形態の変化を観察した。
【００８０】ｂＦＧＦの影響で増殖刺激を受けた細胞
は、そうでない細胞に比べてはげしく伸長し、明確に区
別することが可能であつた。この方法はｂＦＧＦの拡散
した距離を推定すると、ｂＦＧＦのみ単独に添加した場
合は、カツプから半径４−５ｍｍの円内にしか到達して
いないのに対し、ｂＦＧＦと本発明のオリゴ糖を同時に
加えた場合は、用いた６０ｍｍ培養皿の全領域に到達し
ていた。
は、そうでない細胞に比べてはげしく伸長し、明確に区
別することが可能であつた。この方法はｂＦＧＦの拡散
した距離を推定すると、ｂＦＧＦのみ単独に添加した場
合は、カツプから半径４−５ｍｍの円内にしか到達して
いないのに対し、ｂＦＧＦと本発明のオリゴ糖を同時に
加えた場合は、用いた６０ｍｍ培養皿の全領域に到達し
ていた。
【００８１】
【発明の効果】本発明は、主たる２糖単位が、Ｌ−イズ
ロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンからな
り、８−１８糖で構成され、アンチトロンビンＩＩＩ、
ヘパリンＣｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第４因子等に
作用せず、かつ、ＦＧＦに結合性を有する。そして、本
発明のオリゴ糖とＦＧＦを同時に用いた場合は、ａＦＧ
ＦやｂＦＧＦを単独で用いた場合と比較してプラスミ
ン、トリプシン等動物細胞や組織由来のタンパク分解酵
素に対して強い抵抗性を持ち、さらに細胞外マトリツク
ス中で高拡散性を示す。このことから、ＦＧＦと本発明
のオリゴ糖を含有する組成物は医薬としての有利性が高
いことが示唆される。
ロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンからな
り、８−１８糖で構成され、アンチトロンビンＩＩＩ、
ヘパリンＣｏ−ｆａｃｔｏｒＩＩ、血小板第４因子等に
作用せず、かつ、ＦＧＦに結合性を有する。そして、本
発明のオリゴ糖とＦＧＦを同時に用いた場合は、ａＦＧ
ＦやｂＦＧＦを単独で用いた場合と比較してプラスミ
ン、トリプシン等動物細胞や組織由来のタンパク分解酵
素に対して強い抵抗性を持ち、さらに細胞外マトリツク
ス中で高拡散性を示す。このことから、ＦＧＦと本発明
のオリゴ糖を含有する組成物は医薬としての有利性が高
いことが示唆される。
【図１】ｂＦＧＦ−高親和性ヘパラン硫酸の溶出曲線で
ある。（ｂＦＧＦ−セファローズカラム）
ある。（ｂＦＧＦ−セファローズカラム）
【図２】ｂＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の溶出曲線
である。（ｂＦＧＦ−セファローズカラム）
である。（ｂＦＧＦ−セファローズカラム）
【図３】ＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の溶出曲線で
ある。（セファデックスＧ−５０）
ある。（セファデックスＧ−５０）
【図４】ＦＧＦに結合性を有するオリゴ糖の［3Ｈ］チ
ミジンのＤＮＡへのとりこみ活性に対する効果を示す図
である。
ミジンのＤＮＡへのとりこみ活性に対する効果を示す図
である。
図１：
●−● ウシ大動脈由来ヘパラン硫酸
○−○ マウス腫瘍由来ヘパラン硫酸
図４：
○…○ ａＦＧＦ
●…● ａＦＧＦ＋トリプシン処理
△−△ ａＦＧＦ＋ＦＧＦに結合性のオリゴ糖＋トリプ
シン処理 ▲−▲ ａＦＧＦ＋ＦＧＦに非結合性のオリゴ糖＋トリ
プシン処理
シン処理 ▲−▲ ａＦＧＦ＋ＦＧＦに非結合性のオリゴ糖＋トリ
プシン処理
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 19/26 Ａ６１Ｋ 37/02
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C08B 37/10
A61K 31/715
A61K 38/00
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (8)
- 【請求項１】 主たる２糖単位がＬ−イズロン酸２硫酸
及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりなり、かつ８−
１８糖で構成されることを特徴とする線維芽細胞増殖因
子に結合性を有するオリゴ糖。 - 【請求項２】 Ｌ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−
Ｄ−グルコサミンからなる２糖単位と、Ｌ−イズロン酸
２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン６−硫酸から
なる２糖単位のモル比が３：１である請求項１記載の線
維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖。 - 【請求項３】 酸性又は塩基性線維芽細胞増殖因子結合
担体に結合性を有するヘパラン硫酸をヘパリチナーゼＩ
により消化させることを特徴とする、主たる２糖単位が
Ｌ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミ
ンよりなり、かつ８−１８糖で構成される線維芽細胞増
殖因子に結合性を有するオリゴ糖の製造法。 - 【請求項４】 請求項３記載の方法において、ヘパラン
硫酸を酸性又は塩基性線維芽細胞増殖因子結合担体に接
触させ、該担体に結合したヘパラン硫酸画分を分離し、
分離したヘパラン硫酸画分をヘパリチナーゼＩにより消
化させることを特徴とする、線維芽細胞増殖因子に結合
性を有するオリゴ糖の製造法。 - 【請求項５】 請求項４記載の方法において、コンドロ
イチン硫酸の存在下で、ヘパラン硫酸を酸性又は塩基性
線維芽細胞増殖因子結合担体に接触させることを特徴と
する、線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖の
製造法。 - 【請求項６】 請求項３記載の方法において、得られる
消化物をコンドロイチン硫酸の存在下で酸性又は塩基性
線維芽細胞増殖因子結合担体に結合させ、次いで脱着さ
せることを特徴とする、線維芽細胞増殖因子に結合性を
有するオリゴ糖の製造法。 - 【請求項７】 主たる２糖単位がＬ−イズロン酸２硫酸
及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンよりなり、かつ８−
１８糖で構成される線維芽細胞増殖因子に結合性を有す
るオリゴ糖の２又はそれ以上を含有することを特徴とす
る線維芽細胞増殖因子を安定化するための組成物。 - 【請求項８】 線維芽細胞増殖因子と、主たる２糖単位
がＬ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサ
ミンよりなり、かつ８−１８糖で構成される線維芽細胞
増殖因子に結合性を有するオリゴ糖の少なくとも１つを
含有することを特徴とする線維芽細胞増殖因子安定化製
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12110892A JP3390836B2 (ja) | 1991-04-16 | 1992-04-16 | 線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-110905 | 1991-04-16 | ||
| JP11090591 | 1991-04-16 | ||
| JP12110892A JP3390836B2 (ja) | 1991-04-16 | 1992-04-16 | 線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05148305A JPH05148305A (ja) | 1993-06-15 |
| JP3390836B2 true JP3390836B2 (ja) | 2003-03-31 |
Family
ID=26450422
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12110892A Expired - Lifetime JP3390836B2 (ja) | 1991-04-16 | 1992-04-16 | 線維芽細胞増殖因子に結合性を有するオリゴ糖及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3390836B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4633232B2 (ja) * | 2000-06-22 | 2011-02-16 | 生化学工業株式会社 | 成長因子誘導剤 |
| JP4768936B2 (ja) * | 2000-08-07 | 2011-09-07 | 生化学工業株式会社 | 硫酸基を有するオリゴ糖 |
| JP4942681B2 (ja) * | 2008-02-18 | 2012-05-30 | 生化学工業株式会社 | 角膜障害症治癒促進剤 |
| JP6321786B2 (ja) * | 2013-05-16 | 2018-05-09 | エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ | ヘパラン硫酸 |
-
1992
- 1992-04-16 JP JP12110892A patent/JP3390836B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05148305A (ja) | 1993-06-15 |
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