RU2081122C1 - Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников - Google Patents
Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников Download PDFInfo
- Publication number
- RU2081122C1 RU2081122C1 RU94023134A RU94023134A RU2081122C1 RU 2081122 C1 RU2081122 C1 RU 2081122C1 RU 94023134 A RU94023134 A RU 94023134A RU 94023134 A RU94023134 A RU 94023134A RU 2081122 C1 RU2081122 C1 RU 2081122C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- cross
- copolymer
- agent
- biotechnological
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 141
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 71
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 23
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 22
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 14
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 12
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 8
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 abstract 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 abstract 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 9
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 4
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 4
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 4
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 108700022849 desamido- insulin Proteins 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- -1 phospho- Chemical class 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 125000001302 tertiary amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108010013359 miniproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 229940062190 pancreas extract Drugs 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, биохимия. Сущность изобретения: раствор, содержащий инсулин или его биотехнологический предшественник, хроматографируют на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом при pH 4,5 - 5,8, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли, фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают и хроматографируют на анионобменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющим четвертичные аминогруппы, при pH 9,0 - 10,5. Предпочтительно в качестве катионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный фосфогруппами, и обессоливание осуществляют с помощью ультрафильтрации. Способ позволяет получать инсулин или его биотехнологические предшественники высокой степени чистоты - более 97,5%. 3 з.п. ф-лы.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и касается усовершенствованного способа получения инсулина и его биотехнологических предшественников.
В настоящее время производят инсулин как животного, так и генно-инженерного происхождения. В первом случае инсулин выделяют из поджелудочной железы животных с последующей возможной его трансформацией в инсулин человека, а во втором получают в результате сложного технологического процесса из клеток рекомбинантных микроорганизмов. К биотехнологическим предшественникам относят белки, которые включают в свой состав аминокислотные последовательности А- и В-цепей инсулина и содержат три дисульфидные связи, аналогичные таковым в молекуле инсулина, а именно между А-6 и А-11, А-7 и В-7 и А-20 и В-19 цистеиновыми остатками.
Известен способ выделения и очистки инсулина животного происхождения, который заключается в том, что раствор инсулина, полученный в результате превращения свиного инсулина под действием карбоксипептидазы Y в инсулин человека, подвергают гель-хроматографии на колонке с "Сефадексом G-50 мелким" и лиофилизуют. Затем осуществляют анионообменную хроматографию на сорбенте "Сефадекс ДЕАЕ А-25" пи pH 7, 5, элюируют инсулин в градиенте концентрации соли, обессоливают на колонке с "Сефадексом G-25", лиофилизуют и получают инсулин человека с чистотой 90 96% Способ не обеспечивает достаточно высокую чистоту целевого продукта. Кроме того, используемая в способе гель-хроматография имеет хорошее разрешение только при невысоких нагрузках на сорбент.
Известен способ выделения и очистки инсулина, согласно которому раствор инсулина, полученный в результате ферментативной обработки его генно-инженерного предшественника (проинсулина), подвергают хроматографии на колонке с ионообменником, а затем обращенно-фазовой (C-8 или C-18) ВЭЖХ с последующей гель-хроматографией. Способ позволяет получать инсулин высокой степени чистоты более 97,5% Однако осуществление его в промышленном масштабе сопряжено со значительными трудностями, обусловленными применением ВЭЖХ (не на заключительной стадии) и гель-хроматографии, которая не позволяет использовать большие нагрузки на единицу объема сорбента. Кроме того, использование гель-хроматографии после ВЭЖХ свидетельствует о невозможности отделения всех высокомолекулярных примесей с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Известен способ выделения и очистки инсулина, в соответствии с которым раствор биотехнологического предшественника инсулина моно-аргинин-инсулина, полученного в результате ферментативной обработки мини-проинсулина (который в свою очередь получен из раствора, содержащего около 70% соответствующего 5-сульфонатного производного), хроматографируют на колонке с катионообменником "S-cефарозой" ("Фармация", Швеция) при pH 3,5, элюируют моно-аргинин-инсулин в градиенте соли и после осаждения, кристаллизации и лиофилизации получают моно-аргинин-инсулин с чистотой более 90% который затем ферментативно превращают в инсулин с чистотой 85% Инсулин подвергают хроматографической очистке на анионообменнике "TSK-DEAE-65OM" ("Tocox", Япония) при pH 8,3,осаждают в виде цинкового комплекса и кристаллизуют. В результате получают инсулин с чистотой более 95%
Наиболее близким к описываемому по технической сущности является способ выделения и очистки инсулина, в соответствии с которым раствор инсулина, полученный в результате соединения А- и В-цепей инсулина, пропускают через колонку с сорбентом "Сефадекс G-50 (Superfine)" для удаления высокомолекулярных примесей и обессоливания, затем проводят анионообменную хроматографию на "DEAE-целлюлозе" при pH 8,5 с последующим обессоливанием на "Сефадексе G-25". Активность целевого продукта составляет 26,3±1,8 ед/мг, что свидетельствует о недосаточно высокой чистоте целевого продукта. В этом способе также используется гель-хроматография, которая, как уже указывалось выше, осуществляется с небольшой нагрузкой на единицу объема сорбента.
Наиболее близким к описываемому по технической сущности является способ выделения и очистки инсулина, в соответствии с которым раствор инсулина, полученный в результате соединения А- и В-цепей инсулина, пропускают через колонку с сорбентом "Сефадекс G-50 (Superfine)" для удаления высокомолекулярных примесей и обессоливания, затем проводят анионообменную хроматографию на "DEAE-целлюлозе" при pH 8,5 с последующим обессоливанием на "Сефадексе G-25". Активность целевого продукта составляет 26,3±1,8 ед/мг, что свидетельствует о недосаточно высокой чистоте целевого продукта. В этом способе также используется гель-хроматография, которая, как уже указывалось выше, осуществляется с небольшой нагрузкой на единицу объема сорбента.
Предлагаемый способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников заключается в том, что раствор, содержащий инсулин или его биотехнологический предшественник, хроматографируют на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом при pH 4,5 -5,8, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли, фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают и хроматографируют на анионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющим четвертичные аминогруппы, при pH 9,0 10,5.
Предлагаемый способ отличается от известного тем, что вместо гель-хроматографии осуществляют катионообменную хроматографию с использованием сорбента на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом при pH 4,5-5,8, элюирование белков, сввязавшихся с катионообменником, осуществляют в градиенте соли, фракции, содержащие целевой продукт обессоливают, а анионообменную хроматографию осуществляют, используя сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющим четвертичные аминогруппы, при pH 9,0-10,5. Эти отличия позволяют получать инсулин или его биотехнологические предшественники высокой степени чистоты более 97,5%
Предпочтительным вариантом осуществления способа является использование в качестве катионообменника сорбента на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированного фосфогруппами, а также осуществление обессоливания с помощью ультрафильтрации.
Предпочтительным вариантом осуществления способа является использование в качестве катионообменника сорбента на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированного фосфогруппами, а также осуществление обессоливания с помощью ультрафильтрации.
Обессоливание алюата можно осуществлять и с помощью ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами. Это приводит к дополнительной очистке элюата.
Предлагаемый способ может быть использован для выделения и очистки как инсулина, полученного в результате ферментативной обработки его биотехнологического предшественника, так и инсулина, полученного из его А- и В-цепей, инсулина, выделенного из поджелудочной железы животных, инсулина человека, полученного в результате ферментативной трансформации животного инсулина, а также биотехнологических предшественников инсулина.
В описываемом способе как катионнообменная, так и анионообменная хроматография и используемая для обессоливания гидрофобная хроматография осуществляются с использованием сорбентов на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами. К таковым относятся, в частности, сорбенты на основе синтетического полимерного носителя "Биохром". Носители типа "Биохром" получают суспезионной сополимеризацией метакриловых мономеров с кросс-агентами метакрилатной природы в присутствии инициатора полимеризации с последующим приданием носителю гидрофильных свойств. Ионообменники и сорбенты для гидрофобной хроматографии получают путем модификации носителей типа "Биохром" соответствующими функциональными группами. Так, катионообменники получают при модификации носителей типа "Биохром" фосфо-, сульфо-, карбокси-и другими подходящими функциональными группами. Анионообменники получают модификацией носителя типа "Биохром" четвертичными аминогруппами, а сорбенты для гидрофобной хроматографии алкильными группами. Модификацию полимерных носителей на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами проводят по гидроксильным группам нейтральной матрицы с помощью функциональных химических модификаторов стандартными методами. Все сорбенты на основе носителей типа "Биохром" являются жесткими, что сообщает им дополнительные преимущества при использовании способа в промышленном масштабе.
Первой стадией является хроматография на катионообменике. Разделение наиболее эффективно при pH, близком к изоэлектрической точке. Катионообменники на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами обладают хорошими емкостными характеристиками, в том числе при хроматографии инсулина и его биотехнологических предшественников в интервале pH 4,5 5,8. Наилучшие результаты достигнуты при использовании катионообменников на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных фосфогруппами, например, сорбента "Фосфо-Биохром К", получаемого при модификации нейтральной матрицы носителя "Биохром" фосфорилирующим реагентом. Кроме того, такие катионообменники позволяют получить на этой стадии С-пептид более высокой степени чистоты (90 95% чем в известных способах.
В способе на первой стадии также используется катионообменная хроматография. Однако ее осуществляют при pH 3,5, т.е. при значении pH, далеком от изо-точки. В результате на этой стадии получают продукт с чистотой 90% После стадии катионообменной хроматографии получают инсулин или его предшественники с чистотой около 95%
Поскольку элюцию белков, связавшихся с катионообменником, осуществляют в градиенте концентрации соли, то после элюирования проводят обессоливание фракций, содержащих целевой продукт. Для этого используют ультрафильтрационный процесс на мембранах, не пропускающих инсулин или его предшественники, или ступенчатую гидрофобную хроматографию. Ультрафильтрацию можно осуществлять на мембранах "PTGC ("Миллипор", США) или "Биопор Т-10" ("Пластек, РФ). Гидрофобную хроматографию проводят, используя сорбенты на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных алкильными группами, например "Алкил-Биохром".
Поскольку элюцию белков, связавшихся с катионообменником, осуществляют в градиенте концентрации соли, то после элюирования проводят обессоливание фракций, содержащих целевой продукт. Для этого используют ультрафильтрационный процесс на мембранах, не пропускающих инсулин или его предшественники, или ступенчатую гидрофобную хроматографию. Ультрафильтрацию можно осуществлять на мембранах "PTGC ("Миллипор", США) или "Биопор Т-10" ("Пластек, РФ). Гидрофобную хроматографию проводят, используя сорбенты на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных алкильными группами, например "Алкил-Биохром".
После обессоливания элюат подвергают анионообменной хроматографии. Оказалось, что высокая степень очистки инсулина и его предшественников, в том числе отделение дезамидоинсулина и проинсулина от инсулина достигается при проведении анионообменной хроматографии в буферах со значением pH более 9,0. Используемые в известных способах на стадии анионообменной хроматографии сорбенты "TSK-DEAE-65OM", "Сефадекс DEAE A-25" [2] или "DEAE-целлюлоза", имеющие третичные аминогруппы, эффективно работают при pH ниже 8,5. Поэтому они недостаточно эффективны для получения высокоочищенного инсулина. Используемые в предлагаемом способе сорбенты на основе сополимеров метакрилатных мономеров с кросс-агентами, модифицированных четвертичными аминогруппами, позволяют осуществлять хроматографию при pH 9,0 10,5. Содержание целевого продукта во фракциях, полученных после анионообменной хроматографии, составляет (по данным обращенно-фазовой ВЭЖХ) более 97,5% содержание дезамидоинсулина (в инсулине) не превышает 0,5% При этом содержание высокомолекулярных примесей (по данным эксклюзионной ВЭЖХ) не превышает 0,5%
Способ осуществляется следующим образом. Инсулин, полученный в результате ферментативной обработки своего генно-инженерного предшественника или из экстракта поджелудочной железы животных, или любым способом, или его биотехнологические предшественники растворяют в буфере с pH 4,2 5,0, содержащем мочевину, и наносят на колонну с катионнообменником на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, например, с "Фосфо-Биохромом К", уравновешенную 30 мМ ацетатным буфером (pH 5,0) с 6 М мочевиной. После того, как белок связался с катионитом, колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в линейном градиенте концентрации соли от 0 до 0,5 М в том же буфере. Если в растворе находится C-пептид, выщепленный ферментами из проинсулина, то он смывается с колонны первым. Далее элюируются основные примеси, а затем инсулин или его биотехнологический предшественник, чистота которых составляет 90-95%
Затем инсулин или его биотехнологический предшественник подвергают дальнейшей очистке. Для этого фракции, содержащие целевой продукт, полученные на предыдущей стадии, концентрируют и обессоливают или при помощи ультрафильтрации, например, на мембранах "PTGC" или "Биопор Т-10", или при помощи ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя в качестве сорбента сополимер метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами, например, "Алкил-Биохром".
Способ осуществляется следующим образом. Инсулин, полученный в результате ферментативной обработки своего генно-инженерного предшественника или из экстракта поджелудочной железы животных, или любым способом, или его биотехнологические предшественники растворяют в буфере с pH 4,2 5,0, содержащем мочевину, и наносят на колонну с катионнообменником на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, например, с "Фосфо-Биохромом К", уравновешенную 30 мМ ацетатным буфером (pH 5,0) с 6 М мочевиной. После того, как белок связался с катионитом, колонку промывают стартовым буфером и продукт элюируют в линейном градиенте концентрации соли от 0 до 0,5 М в том же буфере. Если в растворе находится C-пептид, выщепленный ферментами из проинсулина, то он смывается с колонны первым. Далее элюируются основные примеси, а затем инсулин или его биотехнологический предшественник, чистота которых составляет 90-95%
Затем инсулин или его биотехнологический предшественник подвергают дальнейшей очистке. Для этого фракции, содержащие целевой продукт, полученные на предыдущей стадии, концентрируют и обессоливают или при помощи ультрафильтрации, например, на мембранах "PTGC" или "Биопор Т-10", или при помощи ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя в качестве сорбента сополимер метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами, например, "Алкил-Биохром".
После этого инсулин или его биотехнологический предшественник в 10 мМ аммонийном буфере (pH 9,0-10,5) наносят на колонну с анионнообменником на основе сополимера метакрилатных мономеров с кросс-агентами, имеющего четвертичные аминогруппы, например, с сорбентом "Q-Бихром А", уравновешенную тем же буфером. После того, как белок связался с сорбентом, колонну отмывают, продукт элюируют в градиенте концентрации соли от 0 до 0,2 М в 10 мм аммонийном буфере (pH 9,5-10,0) и собирают фракции, содержащие высокоочищенный продукт с содержанием основного вещества 97-98% В случае инсулина его затем лиофилизируют или осаждают в виде цинкового комплекса.
В отношении предшественников инсулина, где может не требоваться столь тщательная очистка, можно использовать анионообменники с третичными аминогруппами, которые имеют более высокие емкостные характеристики, например, сорбент " ДЕАЕ-Биохром А2". Условия проведения хроматографии те же, за исключением pH буфера, который имеет значение ниже 8,0.
В случае, если не достигнута необходимая степень чистоты целевого продукта из-за низкого качества исходного материала (наличие большого количества родственных инсулину примесей), инсулин после анионообменной хроматографии наносят на колонну с сорбентом типа "Алкил-Биохром", предварительно уравновешенную раствором, содержащим 10%-ный этанол и 2,5 М хлористый натрий. После связывания белка с сорбентом и отмывки колонки инсулин элюируют в градиент концентраций этанола от 10 до 60% при обратном градиенте концентрации соли от 2,5 до 0 М.
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приводятся конкретные примеры его осуществления.
Пример 1. 2,5 л раствора инсулина (50 г белка, содержание инсулина 50%) в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5), полученного в результате ферментативной обработки генно-инженерного предшественника инсулина, после доведения pH до 4,5 и добавления мочевины для растворения инсулина, наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х30 см), содержащую 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К", уравновешенную буфером, содержащим 30 мМ ацетат натрия (pH 5,5) и 6 М мочевину (буфера А). После нанесения образца колонну промывают в течение 30 мин 2,5 л буфера А, белок элюируют в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,5 М в буфере А в течение 4 ч, объем элюата равняется 20 л. Фракции, содержащие около 17 г инсулина, собирают в объеме 3 л. Чистота получаемого инсулина составляет 90% содержание высокомолекулярных примесей и проинсулина (по данным эксклюзионной ВЭЖХ) не превышает 1,0%
Полученный раствор инсулина концентрируют при помощи ультрафильтрации на мембранах "RTGC", диафильтруют 3 л 10 мМ аммоний ацетатного буфера (pH 9,5), содержащего 2,5 М мочевину (буфер Б), и подвергают анионообменной хроматографии. Для этого на колонну (11,3х30 см), с 3 л сорбента "Q-Биохром А", уравновешенную буфером Б со скоростью 5 л/ч наносят 7,5 г инсулина в 2 л буфера Б. Колонну промывают 2,5 л буфера Б в течение 30 мин. Инсулин элюируют в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,2 М в буфере Б в течение 3 ч, объем элюата равняется 15 л. Собирают фракции, содержащие 6 г инсулина 97,5% чистоты в объеме 2 л. Мочевину и соли удаляют посредством ультрафильтрации, как описано выше, после чего инсулин осаждают в виде цинкового комплекса добавлением хлористого цинка.
Полученный раствор инсулина концентрируют при помощи ультрафильтрации на мембранах "RTGC", диафильтруют 3 л 10 мМ аммоний ацетатного буфера (pH 9,5), содержащего 2,5 М мочевину (буфер Б), и подвергают анионообменной хроматографии. Для этого на колонну (11,3х30 см), с 3 л сорбента "Q-Биохром А", уравновешенную буфером Б со скоростью 5 л/ч наносят 7,5 г инсулина в 2 л буфера Б. Колонну промывают 2,5 л буфера Б в течение 30 мин. Инсулин элюируют в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,2 М в буфере Б в течение 3 ч, объем элюата равняется 15 л. Собирают фракции, содержащие 6 г инсулина 97,5% чистоты в объеме 2 л. Мочевину и соли удаляют посредством ультрафильтрации, как описано выше, после чего инсулин осаждают в виде цинкового комплекса добавлением хлористого цинка.
Пример 2. Очистка генно-инженерного проинсулина.
3 л раствора проинсулина (79 г белка, содержание проинсулина 71%) в 10 мM аммоний ацетатном буфере (pH 4,8), содержащего 3 М мочевину, наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3• 30 см), содержащую 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К", уравновешенную буфером, содержащим 30 мМ ацетат натрия (pH 5,0) и 6 М мочевину (буфер А). После нанесения образца колонну промывают в течение 30 мин 2,5 л буфера А, белок элюируют в линейном градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,5 М в буфере А в течение 4 ч, объем элюата равняется 20 л. Фракции, содержащие около 45 г проинсулина, собирают в объеме 3 л. Чистота получаемого проинсулина составляет 90% содержание высокомолекулярных примесей (по данным эксклюзионной ВЭЖХ) составляет 3%
Полученный раствор проинсулина диафильтруют 10 мМ аммоний ацетатным буфером (pH 7,5), содержащим 2,5 М мочевину (буфер Б), 25 г проинсулина в 2 л этого буфера наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х30 см), содержащую 3 л сорбента "ДЕАЛ-Биохром А2", уравновешенную буфером Б. После нанесения образца колонну промывают 2,5 л буфера Б в течение 30 мин. Проинсулин элюируют с колонны в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,2 М в буфере Б в течение 3 ч, объем элюата равняется 15 л. Фракции, содержащие 20 г проинсулина, собирают в объеме 2 л. Чистота проинсулина составляет 95%
При использовании вместо "ДЕАЕ-Биохрома А2" сорбента "Q-Биохрома А" условия проведения хроматографии те же, но pH буфера равняется 9,5, а нагрузка составляет 12 г на 3 л сорбента. Чистота проинсулина составляет 98%
Пример 3. 2,5 л раствора инсулина (30 г белка, содержание инсулина 78%) в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5), полученного из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, подвергают хроматографической очистке на колонке с 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К" аналогично описанному в примере 1. Получают фракции объемом 3 л, содержащие 16,5 г инсулина 90% чистоты.
Полученный раствор проинсулина диафильтруют 10 мМ аммоний ацетатным буфером (pH 7,5), содержащим 2,5 М мочевину (буфер Б), 25 г проинсулина в 2 л этого буфера наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х30 см), содержащую 3 л сорбента "ДЕАЛ-Биохром А2", уравновешенную буфером Б. После нанесения образца колонну промывают 2,5 л буфера Б в течение 30 мин. Проинсулин элюируют с колонны в градиенте концентрации хлористого натрия от 0 до 0,2 М в буфере Б в течение 3 ч, объем элюата равняется 15 л. Фракции, содержащие 20 г проинсулина, собирают в объеме 2 л. Чистота проинсулина составляет 95%
При использовании вместо "ДЕАЕ-Биохрома А2" сорбента "Q-Биохрома А" условия проведения хроматографии те же, но pH буфера равняется 9,5, а нагрузка составляет 12 г на 3 л сорбента. Чистота проинсулина составляет 98%
Пример 3. 2,5 л раствора инсулина (30 г белка, содержание инсулина 78%) в 50 мМ трис-HCl буфере (pH 7,5), полученного из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота, подвергают хроматографической очистке на колонке с 3 л сорбента "Фосфо-Биохром К" аналогично описанному в примере 1. Получают фракции объемом 3 л, содержащие 16,5 г инсулина 90% чистоты.
Полученные фракции для обессоливания наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х15 см) с 1,5 л сорбента "Алкил-Биохром". Колонну промывают 4,5 л воды и белок элюируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в 50%-ном этаноле, объем элюата 1,5 л.
7,5 г инсулина в 3,0 л буфера Б подвергают хроматографии на колонне (11,3х30 см) с 3 л сорбента "Q-Биохром А" аналогично описанному в примере 1. Получают фракции объемом 2 л, содержащие 6 г инсулина 97% чистоты.
После хроматографической очистки на сорбенте "Q-Биохром А" содержание основного вещества составляет 95% Полученный элюат наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х15 см) с 1,5 л сорбента "Алкил-Биохрома", колонну промывают 4,5 л воды и белок элюируют 0,5%-ным раствором уксусной кислоты в 50% -ном этаноле; объем элюата 1,5 л. Этанол удаляют упариванием на роторном испарителе и инсулин лиофилизируют.
3 г инсулина в 1 л элюата наносят со скоростью 5 л/ч на колонну (11,3х15 см) с 1,5 л "Алкил-Биохрома", уравновешенную раствором, содержащим 10%-ный этанол и 2,5 М хлористый натрий. Белок элюируют этанолом в градиенте концентрации от 10 до 60% и обратном градиенте концентрации ацетата аммония от 2,5 до 0 М. Получают фракции объемом 2 л, содержащие 2,4 г инсулина 98% чистоты. Этанол удаляют упариванием в вакууме при 30oС и инсулин лиофилизируют.
Claims (4)
1. Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников, включающий получение раствора инсулина или его предшественника, анионообменную хроматографию, обессоливание, отличающийся тем, что до стадии анионообменной хроматографии раствор, содержащий инсулин или его предшественник, хроматографируют при рН 4,5 5,8 на катионообменнике на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, элюируют белки, связавшиеся с катионообменником, в градиенте соли и фракции, содержащие целевой продукт, обессоливают, а анионообменную хроматографию проводят при рН 9,0 10,5, при этом в качестве анионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, имеющего четвертичные аминогруппы.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве катионообменника используют сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный фосфогруппами.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят с помощью ультрафильтрации на мембранах.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят с помощью ступенчатой гидрофобной хроматографии, используя сорбент на основе сополимера метакрилатного мономера с кросс-агентом, модифицированный алкильными группами.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94023134A RU2081122C1 (ru) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU94023134A RU2081122C1 (ru) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU94023134A RU94023134A (ru) | 1996-02-20 |
| RU2081122C1 true RU2081122C1 (ru) | 1997-06-10 |
Family
ID=20157370
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU94023134A RU2081122C1 (ru) | 1994-06-16 | 1994-06-16 | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2081122C1 (ru) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2122549C1 (ru) * | 1997-12-29 | 1998-11-27 | Закрытое акционерное общество "Фосфосорб" | Способ хроматографического выделения и очистки белков, пептидов и их комплексов |
| RU2203949C2 (ru) * | 1997-12-29 | 2003-05-10 | Чонг Кун Данг Корпорейшн | Способ получения проинсулина человека |
| RU2222546C2 (ru) * | 1998-08-24 | 2004-01-27 | Авентис Фарма Дойчланд Гмбх | Способ хроматографической очистки инсулинов |
| RU2232813C1 (ru) * | 2003-02-18 | 2004-07-20 | Открытое акционерное общество "Национальные биотехнологии" | Способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека |
| RU2251426C1 (ru) * | 2003-09-18 | 2005-05-10 | Цыганков Владимир Владимирович | Способ получения инсулина из природного источника и инсулин |
| RU2274471C2 (ru) * | 2001-07-06 | 2006-04-20 | Альфа Вассерманн С.П.А. | Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии |
| RU2302882C2 (ru) * | 1997-08-18 | 2007-07-20 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками |
-
1994
- 1994-06-16 RU RU94023134A patent/RU2081122C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Патент ЕР N 0037256, кл. C 07 C 103/52, 1981. * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2302882C2 (ru) * | 1997-08-18 | 2007-07-20 | Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх | Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками |
| RU2122549C1 (ru) * | 1997-12-29 | 1998-11-27 | Закрытое акционерное общество "Фосфосорб" | Способ хроматографического выделения и очистки белков, пептидов и их комплексов |
| RU2203949C2 (ru) * | 1997-12-29 | 2003-05-10 | Чонг Кун Данг Корпорейшн | Способ получения проинсулина человека |
| RU2222546C2 (ru) * | 1998-08-24 | 2004-01-27 | Авентис Фарма Дойчланд Гмбх | Способ хроматографической очистки инсулинов |
| RU2274471C2 (ru) * | 2001-07-06 | 2006-04-20 | Альфа Вассерманн С.П.А. | Способ очистки интерфероновых белков с помощью катионообменной хроматографии |
| RU2232813C1 (ru) * | 2003-02-18 | 2004-07-20 | Открытое акционерное общество "Национальные биотехнологии" | Способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека |
| RU2251426C1 (ru) * | 2003-09-18 | 2005-05-10 | Цыганков Владимир Владимирович | Способ получения инсулина из природного источника и инсулин |
| WO2005026315A3 (fr) * | 2003-09-18 | 2005-06-30 | Vladimir Vladimirovi Tsygankov | Procede de fabrication d'insuline a partir d'une source naturelle et insuline fabriquee par ce procede |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7803763B2 (en) | Method of purifying preproinsulin | |
| EP0460426B1 (en) | Protein purification method | |
| SU1268105A3 (ru) | Композиционный материал дл анионообменника и способ его получени | |
| JP4001604B2 (ja) | 新規蛋白質及びこれを使用した薬剤の製法 | |
| KR0169994B1 (ko) | 리포펩티드 탈아실효소 | |
| AU735480B2 (en) | A process for preparing human proinsulin | |
| US4359389A (en) | Method for the purification of interferon | |
| US5346992A (en) | Process for isolating human albumin from supernatant IV, in particular IV-4, or from COHN's fraction V or from an analogous supernatant or fraction | |
| KR930003665B1 (ko) | 에리스로포이에틴의 정제방법 | |
| JPH11503733A (ja) | Ｉｇｆ−ｉの精製方法 | |
| SU1523046A3 (ru) | Способ очистки человеческого @ -интерферона | |
| CN109929027B (zh) | 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法 | |
| EP0446582B1 (en) | Method for producing of recombinant human cysteineless gamma-interferon free of methionine at n-terminal | |
| RU2081122C1 (ru) | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников | |
| CN109929038B (zh) | Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法 | |
| JP2568151B2 (ja) | アンジオジェニンの単離方法 | |
| CN110240628B (zh) | 一种亲水性短肽的纯化方法 | |
| US4430264A (en) | Process for the preparation of a selective anorexogenic substance regulating food intake | |
| US3926730A (en) | Separation and purification of alpha-amylase | |
| KR19980703851A (ko) | 에리트로포이에틴과 같은 당단백질의 정제 방법 | |
| RU2045535C1 (ru) | Способ получения проинсулина человека | |
| CN119613535A (zh) | 一种基于生物工程的类弹性蛋白的纯化方法 | |
| RU2049793C1 (ru) | Способ выделения рекомбинантного проинсулина | |
| KR100229420B1 (ko) | 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬의 정제 방법 | |
| KR0137855B1 (ko) | 저분자량-우로가스트론의 정제방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080617 |