RU2302882C2 - Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками - Google Patents

Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками Download PDF

Info

Publication number
RU2302882C2
RU2302882C2 RU2002126598/15A RU2002126598A RU2302882C2 RU 2302882 C2 RU2302882 C2 RU 2302882C2 RU 2002126598/15 A RU2002126598/15 A RU 2002126598/15A RU 2002126598 A RU2002126598 A RU 2002126598A RU 2302882 C2 RU2302882 C2 RU 2302882C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
amino acid
insulin
arg
cysteine
residue
Prior art date
Application number
RU2002126598/15A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2002126598A (ru
Inventor
Франц-Йозеф РУБРЕДЕР (DE)
Франц-Йозеф РУБРЕДЕР
Райнхольд КЕЛЛЕР (DE)
Райнхольд КЕЛЛЕР
Original Assignee
Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх filed Critical Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх
Publication of RU2002126598A publication Critical patent/RU2002126598A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2302882C2 publication Critical patent/RU2302882C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения инсулинов или производного инсулина из предшественника инсулина или производного инсулина, причем предшественник в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества подвергают процессу образования складчатой структуры, затем проводят ферментативное расщепление предшественника с помощью трипсина или трипсиноподобного фермента и, в случае необходимости, дополнительно с помощью карбоксипептидазы В и путем последующей очистки на адсорбирующей смоле. Техническим результатом является получение инсулина или его производного с правильно соединенными цистиновыми мостиками. 17 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения инсулина или производных инсулинов с правильно соединенными цистиновыми мостиками из предшественника инсулина или производного инсулина, полученного в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества.
Человеческий инсулин представляет собой белок с двумя аминокислотными цепями, содержащими в общей сложности 51 аминокислотный остаток. В обеих аминокислотных цепях встречается шесть цистеиновых остатков, причем каждые два цистеиновых остатка соединены друг с другом дисульфидным мостиком (= дисульфидной мостиковой связью). В биологически активном человеческом инсулине цепи А и В соединены друг с другом двумя цистиновыми мостиками, и другой цистиновый мостик существует в цепи А. Таким образом, внутри молекулы человеческого инсулина имеется, с точки зрения статистики, 15 возможностей для образования дисульфидных мостиков. В биологически активном человеческом инсулине реализована лишь одна из 15 возможностей. Соединены друг с другом следующие цистеиновые остатки:
А6-А11
А7-В7
А20-В19.
Буквы А и В обозначают соответствующую аминокислотную цепь инсулина, число обозначает положение аминокислотного остатка, занимаемое им в соответствующей аминокислотной цепи, считая в направлении от аминного к карбоксильному концу. Дисульфидные мостики могут быть образованы также между двумя молекулами человеческого инсулина, так что легко может образоваться необозримо большое количество различных дисульфидных мостиков.
Известный способ получения человеческого инсулина основан на применении человеческого проинсулина. Человеческий проинсулин является белком с линейной аминокислотной цепью, состоящей из 86 аминокислотных остатков, причем цепи А и В человеческого инсулина соединены друг с другом через С-пептид с 35 аминокислотными остатками. Образование встречающихся в человеческом инсулине дисульфидных мостиков происходит через промежуточный продукт, причем цистеиновые остатки человеческого инсулина содержат серозащитную группу, например, S-сульфонатную группу (-S-SO3) (см. Европейский патент ЕР 0037255). Далее, известен способ получения проинсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками (Biochemistry, 60, (1968), стр.622-629), который исходит из проинсулина, полученного из поджелудочной железы свиньи, в котором цистеиновые остатки присутствуют в виде тиольных остатков (-SH). Под понятием "правильно соединенные цистиновые мостики" подразумевают дисульфидные мостики, которые существуют в биологически активном инсулине из млекопитающих.
Генно-инженерные способы позволяют получать предшественники инсулина и инсулиновые производные, в частности, человеческий проинсулин или проинсулин, имеющий аминокислотную последовательность и/или длину аминокислотной цепи, отличные от таковых человеческого инсулина, в микроорганизмах. Проинсулины, произведенные клетками Escherichia coli, модифицированными с помощью генной инженерии, не имеют правильно соединенных цистиновых мостиков. Способ получения человеческого инсулина с помощью Е.coli (EP 0055945) основывается на стадиях ферментации микроорганизмов - растворение клетки - выделение слитого белка - галогенциановое расщепление слитого белка - выделение продукта расщепления с проинсулиновой последовательностью -защита цистеиновых остатков проинсулина с помощью S-сульфонатных групп - хроматографическая очистка S-сульфоната - образование правильно соединенных цистиновых мостиков обессоливание проинсулина - хроматографическая очистка проинсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками - концентрирование раствора проинсулина - хроматографическая очистка концентрированного раствора проинсулина ферментативное расщепление проинсулина для получения человеческого инсулина - хроматографическая очистка полученного человеческого инсулина.
Недостатками этого способа являются большое число стадий и потери на стадиях очистки, которые приводят к невысокому выходу инсулина. Из-за многостадийности способа приходится мириться со значительными потерями. Начиная со стадии выделения слитого белка и далее на стадиях галогенцианового расщепления, сульфитолиза и очистки проинсулина потери проинсулина составляют до 40% (EP 0055945). Такие же высокие потери могут происходить в ходе последующих стадий очистки вплоть до получения конечного продукта.
Повышение выхода продукта при генно-инженерном получении человеческого инсулина или инсулиновых производных может быть достигнуто в том случае, если количество необходимых стадий процесса будет существенно уменьшено.
Из Европейской заявки ЕР 0600372 А1 (соответственно из патента США US 5473049) и Европейской заявки ЕР 0668292 А2 известен усовершенствованный соответствующим образом способ получения инсулинов или инсулиновых производных, в котором инсулиновый предшественник или предшественник инсулинового производного, имеющий неправильно соединенные цистиновые мостики, подвергают взаимодействию в присутствии меркаптана, например цистеина, и по меньшей мере одного хаотропного вспомогательного вещества, например мочевины или гуанидингидрохлорида, с получением инсулинового предшественника, соответственно предшественника инсулинового производного, с правильно соединенными цистиновыми мостиками. В известном способе эти белки вначале растворяют в водных растворах хаотропного вспомогательного вещества или смесей различных хаотропных вспомогательных веществ в очень низкой концентрации. Затем смесь белков смешивают с водным раствором меркаптана.
Неожиданно было установлено, что выход правильно уложенных предшественников инсулина или инсулиновых производных может быть повышен, и время реакции для процесса укладки может быть сокращено тем, что предшественник растворяют с помощью хаотропного вспомогательного вещества не на первой стадии, но, что прежде всего в водную суспензию предшественника вводят меркаптан, а именно цистеин или цистеингидрохлорид, и лишь на следующей стадии растворяют предшественник, внося его в водный раствор хаотропного вспомогательного вещества, и, наконец, осуществляют правильную укладку предшественника путем разбавления смеси до предпочтительной концентрации цистеина, соответственно цистеингидрохлорида, внося смесь в соответствующее количество воды.
В соответствии с этим настоящее изобретение относится к способу получения инсулинов или инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества, отличающемуся тем, что следующие стадии проводят друг за другом:
(а) смешивание водной суспензии предшественника инсулинов или инсулиновых производных с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое дает до 15 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника,
(б) внесение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при значении рН приблизительно от 8 до приблизительно 11,5 и температуре приблизительно от 15 до 55°С, выдерживание полученной смеси в течение приблизительно 10-60 минут при этой температуре и
(в) внесение смеси при значении рН приблизительно от 8 до приблизительно 11,5 и температуре приблизительно от 5 до 30°С в количество воды, обеспечивающее разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси на приблизительно 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества на 0,2-1,0 М.
Предпочтительно способ отличается тем, что
на стадии (а) количество цистеина или цистеингидрохлорида соответствует количеству, которое дает 1-6 SH-остатков цистеина или цистеингидрохлорида на один цистеиновый остаток предшественника,
на стадии (б) цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащую суспензию предшественника вносят в 4-9-молярный раствор хаотропного вспомогательного вещества при рН от 8 до 11 и температуре от 30 до 45°С, полученную смесь выдерживают при этой температуре в течение приблизительно 20-40 минут и
на стадии (в) смесь вносят при pH от 8 до 11 и температуре от 15 до 20°С в количество воды, обеспечивающее разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до приблизительно 1-5 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,2-1,0 М.
Хаотропные вспомогательные вещества представляют собой соединения, которые в водном растворе разрушают водородные мостиковые связи, например, сульфат аммония, гуанидингидрохлорид, этиленкарбонат, тиоцианат, диметилсульфоксид и мочевина.
В способе согласно изобретению в качестве хаотропного вспомогательного вещества предпочтительно применяется гуанидин, гуанидингидрохлорид или, особенно предпочтительно, мочевина.
В способе согласно изобретению концентрация хаотропного вспомогательного вещества составляет на стадии (б) предпочтительно от 7,0 до 9 М, температура на стадии (б) равна предпочтительно 40°С и рН на стадии (б) предпочтительно находится в пределах 10-11.
В способе согласно изобретению рН на стадии (в) предпочтительно находится в пределах 10-11. Количество воды, в которое вносят смесь, на стадии (в) способа согласно настоящему изобретению предпочтительно выбирают так, чтобы обеспечить разбавление концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до приблизительно 2,5-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.
Особенно предпочтительно способ согласно изобретению отличается тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества составляет на стадии (б) 8 М, температура на стадии (б) равна 40°С и рН на стадии (б) равен 10,6, рН на стадии (в) равен 10,6 и количество воды на стадии (в) обеспечивает разбавление концентрации цистеина и цистеингидрохлорида в смеси до 2-3 мМ и концентрацию хаотропного вспомогательного вещества 0,5 М.
Результатом способа согласно настоящему изобретению является инсулин или инсулиновые производные, в частности, инсулин, цистиновые мостики которого соединены правильно.
Инсулиновые производные представляют собой производные встречающихся в природе инсулинов, а именно человеческого инсулина (см. Последовательность SEQ ID NO 1=A цепь человеческих инсулинов; см. Последовательность SEQ ID NO 2=B цепь человеческих инсулинов, протокол последовательностей) или животных инсулинов, которые отличаются от соответствующих, в остальном таких же встречающихся в природе инсулинов, замещением по меньшей мере одного встречающегося в природе аминокислотного остатка и/или присоединением по меньшей мере одного аминокислотного остатка и/или органического остатка.
Из полученного по способу согласно настоящему изобретению предшественника инсулинов, соответственно инсулиновых производных с правильно соединенными цистиновыми мостиками в конечном итоге согласно способу, описанному в ЕР 0600372 А1 (соответственно US 5473049), путем ферментативного расщепления с помощью трипсина или аналогичного трипсину фермента и, при необходимости, дополнительно с помощью карбоксипептидазы В с последующей очисткой на адсорбирующей смоле, могут быть получены инсулин или инсулиновое производное с правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Инсулин или инсулиновое производное, получаемые из предшественника, могут быть описаны предпочтительно формулой I:
Figure 00000001
где обозначают:
Y генетически кодируемый аминокислотный остаток,
Z а) аминокислотный остаток из группы His, Arg или Lys,
б) пептид с 2 или 3 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток Arg или Lys на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистадиновых остатков, или
г) ОН,
R1 фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
R3 генетически кодируемый аминокислотный остаток, причем не указанные в целях упрощения формулы I остатки А2-А20 соответствуют аминокислотной последовательности цепи А человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного и не указанные в целях упрощения формулы I остатки В2-В29 соответствуют аминокислотной последовательности цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или инсулинового производного.
Аминокислотная последовательность пептидов и белков обозначается, начиная от N-терминального конца аминокислотной цепи. Сделанные в формуле I указания в скобках, например, А6, А20, B1, B7 или В19, соответствуют положению аминокислотных остатков в цепях А или В.
Понятие "генетически кодируемый аминокислотный остаток" включает в себя аминокислоты Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arq, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro и селеноцистеин.
Под понятиями "остатки А2-А20" и "остатки В2-В29" животного инсулина подразумеваются, например, аминокислотные последовательности инсулина из крупного рогатого скота, свиней или кур. Понятие "остатки А2-А20" и "В2-В29" инсулиновых производных охватывают соответствующие аминокислотные последовательности человеческого инсулина, которые образуются путем обмена аминокислот с другими генетически кодируемыми аминокислотами.
Цепь А человеческого инсулина имеет, например, следующую последовательность (SEQ ID NO.: 1):
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Gys Ser Leu Tyr Gln Leu
Glu Asn Tyr Cys Asn.
Цепь В человеческого инсулина имеет, например, следующую последовательность (SEQ ID NO.: 2):
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.
При этом в формуле I R3 обозначает аспарагин (Asn), R1 фенилаланин (Phe), Y треонин (Thr) и Z ОН.
В соответствии с вышеизложенным способ согласно настоящему изобретению особенно пригоден для получения предшественника инсулинов или инсулиновых производных общей формулы II, цистиновые мостики которого (в формуле I не показаны) уложены правильно,
Figure 00000002
где обозначают:
R2 а) атом водорода,
б) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Arg) или
в) пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида
R1 фенилаланиновый остаток (Phe) или ковалентную связь,
(B2-B29) аминокислотные остатки в положениях B2-B29 цепи В человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного,
Y генетически кодируемый аминокислотный остаток,
X а) аминокислотный остаток из группы лизин (Lys) или аргинин (Arg),
б) пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток лизин (Lys) или аргинин (Arg) на N-терминальном и на карбоксильном конце пептида,
в) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистидиновых остатков,
(А2-А20) аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи A человеческого инсулина, животного инсулина или необязательно модифицированного в одном или нескольких из этих положений инсулинового производного и
R3 генетически кодируемый аминокислотный остаток.
1. Предпочтительно в формуле II обозначают:
R2 а) атом водорода или
б) пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий аминокислотный остаток аргинин (Arg) на карбоксильном конце пептида,
R1 фенилаланиновый остаток (Phe), (В2-В29) аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи В человеческого инсулина,
Y аминокислотный остаток из группы аланин (Ala), треонин (Thr) или серин (Ser),
Х аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с аминокислотной последовательностью цепи С человеческого инсулина,
(А2-А20) аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи A человеческого инсулина и
R3 аминокислотный остаток из группы аспарагин
(Asn), серин (Ser)- или глицин (Gly).
Цепь С человеческого инсулина имеет следующую последовательность (SEQ ID NO.: 3):
Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
Gln Lys Arg.
2. Предпочтительно в формуле II обозначают:
R2 а) атом водорода или
б) пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится аргининовый остаток (Arg)
R1 фенилаланиновый остаток (Phe),
(В2-В29) аминокислотные остатки в положениях В2-В29 цепи
В человеческого инсулина,
Y треониновый остаток (Thr),
Х аминокислотный остаток аргинин (Arg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида стоят два основных аминокислотных остатка, в частности, аргинин (Arg) и/или лизин (Lys),
(А2-А20) аминокислотные остатки в положениях А2-А20 цепи В человеческого инсулина и
R3 аминокислотный остаток аспарагин (Asn) или глицин (Gly).
Остаток Z инсулина или инсулинового производного формулы I является, как правило, частью аминокислотной последовательности Х предшественника формулы II и образуется в результате деятельности протеаз, таких как трипсин, трипсиноподобный фермент или карбоксипептидаза В.
Остаток R3 является аминокислотным остатком, который находится в положении А21 цепи А инсулина. Остаток Y является аминокислотным остатком, который находится в положении В30 цепи В инсулина.
Трипсин или трипсиноподобные ферменты являются протеазами, которые расщепляют аминокислотные цепи аргининового или лизинового остатков.
Карбоксипептидаза В является экзопротеазой, которая отщепляет основные аминокислотные остатки, такие как Arg или Lys, находящиеся на карбокситерминальном конце аминокислотных цепей (Kemmler et al., J. Biol. Chem. 246, стр.6736-6791).
Из названного в параграфе 1 предшественника может быть, например, получен инсулин, соответственно инсулиновое производное формулы I с правильно соединенными цистиновыми мостиками, причем Y, R1, R2, R3, A2-A20 и В2-В29 имеют указанное в параграфе 1 значение и Z обозначает аргининовый остаток (Arg), пептидный остаток Arg-Arg или -ОН.
Из названного в параграфе 2 предшественника может быть, например, получен инсулин, соответственно ннсулиновое производное формулы I с правильно соединенными цистиновыми мостиками, причем Y, R1, R2, R3, A2-A20 и В2-B29 имеют указанное в параграфе 2 значение и Z обозначает аргининовый остаток (Arg), пептидный остаток Arg-Arg или Lys-Lys или -ОН.
Предшественник формулы II может быть образован с помощью множества генно-инженерных конструкций в микроорганизмах (ЕР 0489780, ЕР 0347781, ЕР 0453969). Генно-инженерные конструкции подвергают экспрессии в микроорганизмах, таких как Escherechia coli или Streptomyceten во время ферментации. Образовавшиеся белки откладывают внутри микроорганизмов (ЕР 0489780) или выделяют в ферментационный раствор.
Для способа согласно изобретению могут применяться предшественники инсулина или инсулиновых производных формулы II, которые непосредственно после растворения клетки еще загрязнены большим количеством примесей белков, попавших в них из ферментационного раствора или из микроорганизмов. Однако предшественники формулы II могут быть применены также, например, и в предварительно очищенной форме после осаждения или хроматографической очистки.
Пример 1 (Сравнительный пример, уровень техники)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.
Последовательность 1 проинсулина (SEQ ID NO.: 4):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Gys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Gys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
Последовательность I проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO.: 3)
Y Thr (B30),
R1 Phe (B1),
R2 пептид с 10 аминокислотными остатками;
R3 Asn (A21) и
A2-A20 аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
В клетках Е.coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
20 кг выделенных телец-включений слитого белка (в пересчете на сухую массу после сушки вымораживанием; долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД); эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 1 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,6. После отделения небольших количеств взвешенных веществ с помощью центрифугирования прозрачный раствор (необязательно) замешивают в 9000 л водного раствора цистеина (5 кг гидрата цистеингидрохлорида) при рН 10/6 и температуре 4°С. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 часа определяют помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 3,0 кг, что соответствует степени конверсии 30%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. HCl на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 3 г трипсина. Образуется 1,25 кг инсулина с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками согласно анализу, произведенному с помощью ЖХВД. После расщепления карбоксипептидазой В образуется человеческий инсулин, который подвергается дальнейшей очистке хроматографическими методами.
Человеческий инсулин соответствует формуле I, при этом обозначают:
Y Thr (B30),
Z ОН,
R1 Phe (B1),
R3 Asn (A21) и
А2-А20 аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
Человеческий инсулин 2 состоит из SEQ ID NO.: 1 и 2, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Раствор концентрируют, как описано в ЕР 0668292, с помощью адсорбирующей смолы и очищают. Элюат, содержащий инсулин 2, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Анализ с помощью ЖХВД
0,5 г белка растворяют в 40 мл раствора, состоящего из 6 М гуанидингидрохлорида, 50 мМ Tris, pH 8,5, 5 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), 1% 2-меркаптоэтанола, 10 мМ дитиотреитола при 95°С в течение 2 минут и затем центрифугируют при 14000 g в течение 20 минут. 0,02 мл прозрачной надосадочной жидкости помещают в хроматографическую колонку высокого давления.
Колонка: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey & Nagel, Аахен, Германия)
Градиент: буфер А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ)
буфер Б: 0,09%-ная ТФУ в ацетонитриле
Температура: 55°С
Общее время процесса: 40 мин.
Градиент характеризуется следующими количествами буфера В после соответствующих времен процесса:
10 мин 25%, 12 мин 60%, 13 мин 90%, 15 мин 100%.
Поток: 1 мл/мин,
Детектирование: 215 нм,
Время удержания
инсулина: около 19 мин.
Пример 2 (Способ согласно настоящему изобретению).
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с показанной в примере 1 аминокислотной последовательностью (проинсулиновая последовательность 1 SEQ ID NO.:4). В клетках Е.coli накапливается экспрессированный белок с проинсулиновой последовательностью 1 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
К водной суспензии слитого белка, содержащей 40 кг слитого белка (определение производилось путем сушки вымораживанием аликвота), добавляют 5 кг гидрата цистеингидрохлорида.
Суспензию (долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД; эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 1 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,2 и 40°С. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л воды при рН 10,6 и температуре 15°С. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 часа определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 10,0 кг, что соответствует степени конверсии 50%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. HCl на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 10 г трипсина. Образуется 4 кг инсулина с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками. После расщепления карбоксипептидазой В образуется человеческий инсулин (SEQ ID NO.: 1 и 2 с правильно соединенными цистиновыми мостиками).
Раствор концентрируют с помощью адсорбирующей смолы и очищают.
Элюат, содержащий человеческий инсулин, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Пример 3 (Сравнительный пример, уровень техники).
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherechia coli (EP 0489780) получают слитой белок со следующей аминокислотной последовательностью.
Последовательность 2 проинсулина (SEQ ID NO.: 5):
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Последовательность 2 проинсулина соответствует формуле II, при этом обозначают:
Х С-пептид человеческого инсулина (SEQ ID NO.: 3)
Y Thr(B30),
R1 Phe (B1),
R2 пептид с 10 аминокислотными остатками,
R3 Gly (A21) и
А2-А20 аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29).
В клетках Е.coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 2 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
20 кг выделенных телец-включений слитого белка (в пересчете на сухую массу после сушки вымораживанием; долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД. Эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 2 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,6 и 20°С. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л водного раствора цистеина (5 кг гидрата цистеингидрохлорида) при рН 10,6 и температуре 4°С. По окончании реакции укладывания приблизительно через 24 часа определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 2 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 3,0 кг, что соответствует степени конверсии 30%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. HCl на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 3 г трипсина. Образуется 0,98 кг инсулинового производного с 2 карбокситермальными аргининовыми остатками согласно анализу, произведенному с помощью ЖХВД. Это инсулиновое производное соответствует формуле I, причем обозначают:
Y Thr (B30),
Z Arg-Arq,
R1 Phe (B1),
R3 Gly (A21) и
A2-A20 аминокислотную последовательность цепи А человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-20) и
В2-В29 аминокислотную последовательность цепи В человеческого инсулина (аминокислотные остатки 2-29),
и состоит из SEQ ID NO.: 6 и 7, связанных друг с другом правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Раствор концентрируют с помощью адсорбирующей смолы и очищают.
Элюат, содержащий инсулиновое производное, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Пример 4 (Способ согласно настоящему изобретению)
Путем ферментации генетически модифицированных клеток Escherichia coli (EP 0489780) получают слитой протеин с аминокислотной последовательностью согласно примеру 1 (SEQ ID NO.: 5).
В клетках Е.coli накапливается экспрессированный слитой белок с проинсулиновой последовательностью 2 и образует тельца-включения. По окончании ферментации клетки отделяют путем центрифугирования и растворяют путем обычной гомогенизации под высоким давлением. Высвободившиеся тельца-включения слитого белка выделяют с помощью центрифугирования.
К водной суспензии слитого белка, содержащей 40 кг слитого белка (определение производилось путем сушки вымораживанием аликвоты), добавляют 5 кг гидрата цистеингидрохлорида.
Суспензию (долю инсулинсодержащего слитого белка определяют с помощью ЖХВД; эта доля составляет 50%) с проинсулиновой последовательностью 2 растворяют в 550 л 8-молярного раствора мочевины при рН 10,2 и 40°С. Прозрачный раствор замешивают в 9000 л воды при рН 10,6 и температуре 15°С. По окончании реакции укладывания приблизительно через 5 часов определяют с помощью анализа ЖХВД содержание проинсулиновой последовательности 1 с правильно соединенными цистиновыми мостиками в реакционной смеси, которое находят равным 10,0 кг, что соответствует степени конверсии 50%.
рН 9500 л раствора устанавливают с помощью 1 н. HCl на значение 5,0 и раствор сепарируют. Затем рН доводят до 9, добавляя 1 н. раствор едкого натра. В раствор вводят 10 г трипсина. Образуется 2,8 кг инсулинового производного (анализ с помощью ЖХВД), состоящего из последовательностей SEQ ID NO.: 6 и 7, связанных между собой правильно соединенными цистиновыми мостиками.
Раствор концентрируют с помощью поглощающей смолы и очищают.
Элюат, содержащий инсулиновое производное, после разбавления водой и регулирования рН может быть подвергнут дальнейшей очистке непосредственно на хроматографической колонке.
Протокол последовательностей
(1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ:
(i) ЗАЯВИТЕЛЬ:
(A) ИМЯ: Хехст Марион Руссель Дойчланд ГмбХ
(Б) УЛИЦА:
(B) ГОРОД: Франкфурт на Майне
(Г) СТРАНА: Федеративная Республика Германия
(Е) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС: 65926
(Ж) ТЕЛЕФОН: 069-305-5307
(3) ТЕЛЕФАКС: 069-35-7175
(И) ТЕЛЕКС: 041234-700 hod
(ii) НАЗВАНИЕ ЗАЯВКИ: Усовершенствованный способ получения инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками
(iii) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 7
(iv) МАШИНОЧИТАЕМАЯ ФОРМА:
(A) НОСИТЕЛЬ ДАННЫХ: дискета
(Б) КОМПЬЮТЕР: ИБМ-совместимый ПК
(B) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS
(Г) ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ: Patentln Release #1.0,
Version # 1.25 (ЕРА).
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 1:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 21 аминокислота
(Б) ВИД: аминокислота
(Б) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(а) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
(ix) ПРИЗНАКИ:
(A) НАИМЕНОВАНИЕ /КОД: белок
(B)ПОЛОЖЕНИЕ: 1..21
(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 1:
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1       5         10       15  
Glu Asn Tyr Cys Asn                      
      20                        
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 2:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 30 аминокислот
(Б) ВИД: аминокислота
(B) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(а) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
(ix) ПРИЗНАКИ:
(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КОД: белок
(B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1..30
(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 2:
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1       5         10       15  
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr    
      20         25       30    
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 3:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(А) ДЛИНА: 35 аминокислот
(Б) ВИД: аминокислота
(В) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(а) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
(ix) ПРИЗНАКИ:
(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КОД: белок
(B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1..35
(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 3:
Alg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly
1       5         10         15  
Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu
      20         25         30    
Gln Lys Arg                          
    35                          
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 4
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 96 аминокислот
(Б) ВИД: аминокислота
(B) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(A) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
1       5         10         15  
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala-Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
      20       25         30    
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
    35         40         45      
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
  50         55         60        
Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
65         70         75       80
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
        85         90         95  
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 5:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 96 аминокислот
(Б) ВИД: аминокислота
(B) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(А) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
(ix) ПРИЗНАКИ:
(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КОД: белок
(Б) ПОЛОЖЕНИЕ: 1..96
(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 5:
Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gln His Leu
1       5         10         15  
Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
      20         25         30    
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln
    35         40         45      
Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly-Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln
  50         55         60        
Pro Leu-Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln
65         70         75       80
Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
        85         90         95  
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 6:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: 32 аминокислоты
(Б) ВИД: аминокислота
(B) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(А) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
(ix) ПРИЗНАКИ:
(A) НАИМЕНОВАНИЕ/КОД: белок
(B) ПОЛОЖЕНИЕ: 1..32
(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 6:
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1       5         10         15  
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
      20         25         30    
(2) ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ SEQ ID NO: 7:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(А) ДЛИНА: 21 аминокислота
(Б) ВИД: аминокислота
(В) ФОРМА НИТИ: одиночная
(Г) ТОПОЛОГИЯ: линейная
(ii) ТИП МОЛЕКУЛЫ: белок
(vi) ПЕРВОНАЧАЛЬНОЕ ПРОИСХОЖДЕНИЕ:
(А) ОРГАНИЗМ: Escherichia coli
(ix) ПРИЗНАКИ:
(А) НАИМЕНОВАНИЕ/КОД: белок
(В) ПОЛОЖЕНИЕ: 1..21
(xi) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 7:
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1       5         10       15  
Glu Asn Tyr Cys Gly                    
      20                      

Claims (18)

1. Способ получения инсулинов или производного инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками из предшественника инсулина или производного инсулина, причем предшественник в присутствии цистеина или цистеингидрохлорида и хаотропного вспомогательного вещества подвергают процессу образования складчатой структуры, после чего из предшественника путем ферментативного расщепления с помощью трипсина или трипсиноподобного фермента и, в случае необходимости, дополнительно с помощью карбоксипептидазы В и последующей очистки на адсорбирующей смоле получают инсулин или производное инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками, отличающийся тем, что для осуществления процесса образования складчатой структуры последовательно осуществляют следующие стадии:
(a) смешение водной суспензии предшественника инсулина или производного инсулина с количеством цистеина или цистеингидрохлорида, которое приводит к 1-15 SH-остаткам цистеина или цистеингидрохлорида на цистеиновый остаток предшественника;
(b) введение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-М раствор хаотропного вспомогательного вещества при значении рН от примерно 8 до примерно 11,5 и при температуре от примерно 15°С до примерно 55°С, выдерживание полученной смеси в течение примерно 10-60 минут при этой температуре и
(с) введение смеси, при значении рН от примерно 8 до примерно 11,5 и при температуре от примерно 5°С до примерно 30°С, в воду до разведения концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до примерно 1-5 мМ и хаотропного вспомогательного вещества от 0,2 до 1,0 М.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (а) количество цистеина или цистеингидрохлорида соответствует количеству, которое приводит к 1-6 SH-остаткам цистеина или цистеингидрохлорида на цистеиновый остаток предшественника; на стадии (b) введение цистеин- или цистеингидрохлоридсодержащей суспензии предшественника в 4-9-М раствор хаотропного вспомогательного вещества осуществляют при значении рН 8-11 и температуре 30-45°С, выдерживают полученную смесь в течение 20-40 мин при этой температуре; и на стадии (с) осуществляют введение смеси при значении рН 8-11 и при температуре 15-20°С в воду до разведения концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до примерно 1-5 мМ и концентрации хаотропного вспомогательного вещества от 0,2 до 1,0 М.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что хаотропным вспомогательным веществом является гуанидин или гуанидингидрохлорид.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что хаотропным вспомогательным веществом является мочевина.
5. Способ по одному или нескольким пп.1-4, отличающийся тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества на стадии (b) составляет 7,0-9,0 - М.
6. Способ по одному или нескольким пп.1-5, отличающийся тем, что температура на стадии (b) составляет 40°С.
7. Способ по одному или нескольким пп.1-6, отличающийся тем, что значение рН на стадии (b) составляет 10-11.
8. Способ по одному или нескольким пп.1-7, отличающийся тем, что значение рН на стадии (с) составляет 10-11.
9. Способ по одному или нескольким пп.1-8, отличающийся тем, что на стадии (с) количество воды приводит к разведению концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до 2,5-3 мМ и концентрации хаотропного вспомогательного вещества до 0,5 М.
10. Способ по одному или нескольким пп.2-9, отличающийся тем, что концентрация хаотропного вспомогательного вещества на стадии (b) составляет 8 М, температура на стадии (b) составляет 40°С, значение рН на стадии (b) составляет 10,6, значение рН на стадии (с) составляет 10,6 и количество воды на стадии (с) приводит к разведению концентрации цистеина или цистеингидрохлорида в смеси до 2,5-3 мМ и концентрации хаотропного вспомогательного вещества до 0,5 М.
11. Способ по одному или нескольким пп.1-10, отличающийся тем, что предшественник инсулинов или производных инсулина имеет последовательность согласно общей формуле (II)
Figure 00000003
где R2 означает а) атом водорода; b) остаток аминокислоты из группы лизина (Lys) или аргинина (Arg); или с) пептид с 2-45 аминокислотными остатками, содержащий остаток аминокислоты лизина (Lys) или аргинина (Arg) на карбоксильном конце пептида;
R1 означает остаток фенилаланина (Phe) или ковалентную связь;
(В2-В29) означает аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, измененного в одном или в нескольких из этих положений производного инсулина;
Y означает генетически кодируемый аминокислотный остаток; X означает а) остаток аминокислоты из группы лизина (Lys) или аргинина (Arg); или b) пептид с 2-35 аминокислотными остатками, содержащий остаток аминокислоты лизина (Lys) или аргинина (Arg) на N-конце и карбоксильном конце пептида; или с) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистидиновых остатков;
(А2-А20) означает аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или, в случае необходимости, измененного в одном или в нескольких из этих положений производного инсулина;
R3 означает генетически кодируемый аминокислотный остаток.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в формуле (II) R2 означает а) атом водорода или b) пептид с 2-25 аминокислотными остатками, содержащий остаток аминокислоты аргинина (Arg) на карбоксильном конце пептида;
R1 означает остаток фенилаланина (Phe);
(В2-В29) означает аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина;
Y означает остаток аминокислоты из группы аланина (Ala), треонина (Thr) или серина (Ser);
X означает остаток аминокислоты аргинина (Arg) или пептид с аминокислотной последовательностью С-цепи человеческого инсулина;
(А2-А20) означает аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина; и
R3 означает остаток аминокислоты из группы аспарагина (Asn), серина (Ser) или глицина (Gly).
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что в формуле (II) R2 означает а) атом водорода или b) пептид с 2-15 аминокислотными остатками, на карбоксильном конце которого находится остаток аргинина (Arg);
R1 означает остаток фенилаланина (Phe);
(В2-В29) означает аминокислотные остатки в положениях В2-В29 В-цепи человеческого инсулина;
Y означает остаток треонина (Thr);
X означает остаток аминокислоты аргинина (Arg) или пептид с 2-35 аминокислотными остатками, причем в начале и в конце пептида находятся два основных аминокислотных остатка, в особенности аргинина (Arg) и/или лизина (Lys);
(А2-А20) означает аминокислотные остатки в положениях А2-А20 А-цепи человеческого инсулина; и
R3 означает остаток аминокислоты аспарагина (Asn) или глицина (Gly).
14. Способ по одному или нескольким пп.1-13, отличающийся тем, что получают инсулин или производное инсулина формулы (I)
Figure 00000004
где Y означает генетически кодируемый аминокислотный остаток;
Z означает а) остаток аминокислоты из группы His, Arg или Lys; b) пептид с 2 или 3 аминокислотными остатками, содержащий остаток аминокислоты Arg или Lys на карбоксильном конце пептида; с) пептид с 2-35 генетически кодируемыми аминокислотами, содержащий 1-5 гистидиновых остатков; или d) ОН; R1 означает остаток фенилаланина (Phe);
R3 означает генетически кодируемый аминокислотный остаток;
причем остатки А2-А20 соответствуют аминокислотной последовательности А-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или производного инсулина и остатки В2-В29 соответствуют аминокислотной последовательности В-цепи человеческого инсулина, животного инсулина или производного инсулина.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что в формуле (I) Y означает аланин (Ala), треонин (Thr) или серии (Ser);
Z означает а) аргинин (Arg); b) дипептид с 2 остатками аргинина (Arg-Arg); с) ОН;
R3 означает аспарагин (Asn), серин (Ser), глицин (Gly).
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что в формуле (I) Y означает треонин (Thr);
Z означает а) аргинин (Arg); b) дипептид с 2 остатками аргинина (Arg-Arg) или 2 остатками лизина (Lys-Lys); с) ОН; R3 означает аспарагин (Asn), глицин (Gly).
17. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что в формуле (I)
Y означает треонин (Thr); Z означает ОН; R3 означает аспарагин (Asn).
18. Способ по п.15 или 16, отличающийся тем, что в формуле (I)
Y означает треонин (Thr); Z означает дипептид с 2 остатками аргинина (Arg-Arg); R3 означает глицин (Gly).
RU2002126598/15A 1997-08-18 2002-10-07 Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками RU2302882C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19735711A DE19735711C2 (de) 1997-08-18 1997-08-18 Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
DE19735711.3 1997-08-18

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98116259/04A Division RU2205836C2 (ru) 1997-08-18 1998-08-17 Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2002126598A RU2002126598A (ru) 2004-04-20
RU2302882C2 true RU2302882C2 (ru) 2007-07-20

Family

ID=7839275

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98116259/04A RU2205836C2 (ru) 1997-08-18 1998-08-17 Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками
RU2002126598/15A RU2302882C2 (ru) 1997-08-18 2002-10-07 Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU98116259/04A RU2205836C2 (ru) 1997-08-18 1998-08-17 Усовершенствованный способ получения предшественника инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками

Country Status (21)

Country Link
US (3) US5986048A (ru)
EP (2) EP0980874B1 (ru)
JP (1) JP4291900B2 (ru)
KR (2) KR100537842B1 (ru)
CN (3) CN1483831B (ru)
AR (1) AR016821A1 (ru)
AT (2) ATE217012T1 (ru)
AU (1) AU744824B2 (ru)
BR (2) BR9803755A (ru)
CA (1) CA2245151C (ru)
CZ (1) CZ295679B6 (ru)
DE (3) DE19735711C2 (ru)
DK (2) DK0906918T3 (ru)
ES (2) ES2177178T3 (ru)
HK (3) HK1018464A1 (ru)
HU (2) HU228203B1 (ru)
ID (1) ID20717A (ru)
PL (1) PL191901B1 (ru)
PT (2) PT906918E (ru)
RU (2) RU2205836C2 (ru)
TR (1) TR199801587A3 (ru)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19735711C2 (de) 1997-08-18 2001-04-26 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
DE19930676B4 (de) 1999-07-02 2006-01-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Stabilisierung von Insulin, Insulinderivaten und/oder deren Vorläufer in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln
AU2151401A (en) * 1999-12-22 2001-07-03 Novo Nordisk A/S Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides
WO2002004481A2 (en) * 2000-07-12 2002-01-17 Eli Lilly And Company Process to increase protein stability
DE10235168A1 (de) * 2002-08-01 2004-02-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin
DE102004015965A1 (de) * 2004-04-01 2005-10-20 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Gewinnung von Insulinen durch verbesserte Luftbegasung der Faltung
US20080032343A1 (en) 2005-12-22 2008-02-07 Genentech, Inc. Recombinant Production of Heparin Binding Proteins
AU2007272412B2 (en) 2006-07-14 2013-11-07 Genentech, Inc. Refolding of recombinant proteins
RU2468373C2 (ru) * 2007-07-03 2012-11-27 Эмджен Инк. Количественное определение белков с использованием сухого веса внутриклеточных телец
RU2451750C2 (ru) * 2007-09-24 2012-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" Способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека
EP2229407B1 (de) 2008-01-09 2016-11-16 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Neue insulinderivate mit extrem verzögertem zeit- / wirkungsprofil
WO2009133529A2 (en) * 2008-04-30 2009-11-05 Wockhardt Research Centre Processes for refolding of insulin
HUE037449T2 (hu) 2008-10-17 2018-08-28 Sanofi Aventis Deutschland Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja
AR080669A1 (es) 2009-11-13 2012-05-02 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1, una insulina y metionina
WO2011058082A1 (de) 2009-11-13 2011-05-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin
ES2606554T3 (es) 2010-08-30 2017-03-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Uso de AVE0010 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
US20180282405A1 (en) * 2012-08-05 2018-10-04 Absci, Llc Cytoplasmic expression system
WO2014099577A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for purifying insulin and analogues thereof
WO2014133324A1 (ko) * 2013-02-26 2014-09-04 한미약품 주식회사 신규한 인슐린 아날로그 및 이의 용도
CN103694339B (zh) * 2013-12-04 2017-10-13 珠海联邦制药股份有限公司 一种甘精胰岛素前体的复性方法
WO2015138548A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Merck Sharp & Dohme Corp. Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature
PL3229828T3 (pl) 2014-12-12 2023-07-31 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Formulacja o ustalonym stosunku insuliny glargine/liksysenatydu
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
CN104911203A (zh) * 2015-06-30 2015-09-16 成都易胜科生物科技有限公司 一种重组人胰岛素的工业制备方法
EP3344651B1 (en) 2015-09-02 2022-03-02 Merck Sharp & Dohme Corp. A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds
US10689430B2 (en) 2016-05-25 2020-06-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
WO2018018613A1 (zh) 2016-07-29 2018-02-01 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
CN113773391B (zh) * 2020-06-09 2023-10-20 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种门冬胰岛素的制备方法
CN113773400B (zh) * 2020-06-09 2023-08-18 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种门冬胰岛素衍生物及其应用
CN113773396A (zh) * 2020-06-10 2021-12-10 宁波鲲鹏生物科技有限公司 一种地特胰岛素衍生物及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ199391A (en) * 1981-01-02 1985-12-13 Genentech Inc Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin
DE3501641A1 (de) * 1985-01-19 1986-07-24 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen
IL95495A (en) * 1989-08-29 1996-10-16 Hoechst Ag Fusion proteins their preparation and use
DK0600372T3 (da) * 1992-12-02 1997-08-11 Hoechst Ag Fremgangsmåde til fremstilling af proinsulin med korrekt forbundne cystinbroer.
DE4405179A1 (de) * 1994-02-18 1995-08-24 Hoechst Ag Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken
PT871474E (pt) * 1994-12-29 2007-02-28 Ferring Int Ct Sa Produção de insulina humana
DE19735711C2 (de) * 1997-08-18 2001-04-26 Aventis Pharma Gmbh Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken

Also Published As

Publication number Publication date
CZ295679B6 (cs) 2005-09-14
CN101186940B (zh) 2012-02-08
ES2177178T3 (es) 2002-12-01
DK0980874T3 (da) 2002-08-19
JPH11130798A (ja) 1999-05-18
EP0980874B1 (de) 2002-05-02
CN1132845C (zh) 2003-12-31
AU8076398A (en) 1999-02-25
ATE217012T1 (de) 2002-05-15
DK0906918T3 (da) 2002-09-09
CN1483831B (zh) 2012-06-13
HU0600287D0 (en) 2006-05-29
TR199801587A2 (xx) 1999-03-22
HK1018464A1 (en) 1999-12-24
AU744824B2 (en) 2002-03-07
PT906918E (pt) 2002-10-31
KR19990023651A (ko) 1999-03-25
EP0980874A1 (de) 2000-02-23
CN1483831A (zh) 2004-03-24
BRPI9816233B8 (pt) 2021-05-25
CZ259898A3 (cs) 1999-03-17
ID20717A (id) 1999-02-18
PT980874E (pt) 2002-10-31
HUP9801886A2 (hu) 1999-01-28
ES2176870T3 (es) 2002-12-01
ATE217636T1 (de) 2002-06-15
US6727346B2 (en) 2004-04-27
HU9801886D0 (en) 1998-10-28
EP0906918A2 (de) 1999-04-07
EP0906918A3 (de) 1999-08-11
HUP9801886A3 (en) 1999-06-28
RU2205836C2 (ru) 2003-06-10
PL191901B1 (pl) 2006-07-31
DE59803985D1 (de) 2002-06-06
CA2245151A1 (en) 1999-02-18
HK1119449A1 (en) 2009-03-06
US5986048A (en) 1999-11-16
BRPI9816233B1 (pt) 2016-09-27
HU228203B1 (en) 2013-01-28
CA2245151C (en) 2009-10-06
DE19735711C2 (de) 2001-04-26
HU228161B1 (en) 2013-01-28
HK1061870A1 (en) 2004-10-08
TR199801587A3 (tr) 1999-03-22
EP0906918B1 (de) 2002-05-15
DE59804121D1 (de) 2002-06-20
DE19735711A1 (de) 1999-02-25
US20020156234A1 (en) 2002-10-24
CN1209437A (zh) 1999-03-03
CN101186940A (zh) 2008-05-28
AR016821A1 (es) 2001-08-01
JP4291900B2 (ja) 2009-07-08
KR100537842B1 (ko) 2006-03-23
PL328108A1 (en) 1999-03-01
US6380355B1 (en) 2002-04-30
BR9803755A (pt) 2000-03-28
KR20050067371A (ko) 2005-07-01
KR100574580B1 (ko) 2006-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2302882C2 (ru) Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками
CA2142780C (en) Process for obtaining insulin having correctly linked cystine bridges
EP0397420B1 (en) Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence
Gregory et al. The primary structure of human urogastrone
US5473049A (en) Process for obtaining proinsulin possessing correctly linked cystine bridges
US4649131A (en) Growth hormone releasing factor analogs
RU2002126598A (ru) Способ получения инсулина или производных инсулина с правильно соединенными цистиновыми мостиками
JPS6229997A (ja) Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法
US7659363B2 (en) Process for the preparation of insulin or an insulin derivative in the presence of oxygen
US4732972A (en) Polypeptides having growth hormone releasing activity
JP3187201B2 (ja) Ｃ末端にプロリンアミドを有するペプチドの製法
DANHO et al. Human Proinsulin, IV. Synthesis of a Protected Peptide Fragment Corresponding to the Sequence 1-23 of the Prohormone
MXPA98006666A (en) Improved procedure for the obtaining of insulin precursors with cistina bridges correctly uni
Bodenmuller Isolation and structural analysis of a new neuropeptide, the head activator