RU2468373C2 - Количественное определение белков с использованием сухого веса внутриклеточных телец - Google Patents
Количественное определение белков с использованием сухого веса внутриклеточных телец Download PDFInfo
- Publication number
- RU2468373C2 RU2468373C2 RU2010103451/15A RU2010103451A RU2468373C2 RU 2468373 C2 RU2468373 C2 RU 2468373C2 RU 2010103451/15 A RU2010103451/15 A RU 2010103451/15A RU 2010103451 A RU2010103451 A RU 2010103451A RU 2468373 C2 RU2468373 C2 RU 2468373C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- aliquot
- recombinant protein
- intracellular
- collection
- Prior art date
Links
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 113
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 84
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 32
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 17
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 9
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 34
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- -1 transcription factor Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N (3alpha,5alpha,7alpha,12alpha)-3,7,12-trihydroxy-cholan-24-oic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 BHQCQFFYRZLCQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 1-decane-sulfonic-acid Chemical compound CCCCCCCCCCS(O)(=O)=O KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 239000004380 Cholic acid Substances 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010007979 Glycocholic Acid Proteins 0.000 description 1
- 108010035713 Glycodeoxycholic Acid Proteins 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N Glycodeoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WVULKSPCQVQLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- RFDAIACWWDREDC-UHFFFAOYSA-N Na salt-Glycocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 RFDAIACWWDREDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000000739 chaotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 235000019416 cholic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960002471 cholic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N glycocholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 RFDAIACWWDREDC-FRVQLJSFSA-N 0.000 description 1
- 229940099347 glycocholic acid Drugs 0.000 description 1
- WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N glycodeoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 WVULKSPCQVQLCU-BUXLTGKBSA-N 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000011093 media selection Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M sodium;hexadecyl sulfate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O GGHPAKFFUZUEKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Drying Of Solid Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии. Сущность способа измерения концентрации рекомбинантного белка в сборах внутриклеточных телец заключается в том, что измеряют концентрацию сухих веществ в аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец и умножают суммарную концентрацию сухих веществ в аликвоте взвеси сбора IB с использованием коэффициента пересчета продуктивности белка (PPCF) по формуле. Результат формулы дает суммарную концентрацию рекомбинантного белка в указанной аликвоте указанной взвеси сбора IB, и где PPCF для указанного рекомбинантного белка определяют из аликвоты взвеси сбора IB умножением отношения рекомбинантного белка в указанной аликвоте к суммарному содержанию сухих веществ в указанной аликвоте на 1000. PPCF для одной аликвоты сбора внутриклеточных телец используют для расчета концентрации рекомбинантного белка от различных ферментационных сборов внутриклеточных телец, проведенных по одной и той же методике. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность измерения концентрации рекомбинантного белка в сборах бактериальных внутриклеточных телец. 4 з.п. ф-лы, 3 пр., 5 табл.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам количественного определения белковых продуктов от рекомбинантного продуцирования белков с использованием сухого веса сбора внутриклеточных телец.
Предпосылки создания изобретения
Высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, продуцированных в бактериях, таких как E.coli, часто приводит к образованию нерастворимых агрегатов внутри бактериальной клетки, известных как внутриклеточные тельца (Shein et al., Bio/Technology 7:1141-49, 1989). Белок внутриклеточного тельца является белком, который, вообще говоря, является сверхэкспрессированным в реципиенте, который на последних стадиях экспрессии или очистки является видимым методом фазовоконтрастной микроскопии как преципитат. Внутриклеточные тельца являются электроноплотными аморфными частицами, которые имеют прерывистую границу с цитоплазмой, но не окружены мембраной (Schoemaker et al., EMBO J 4: 775-780, 1985). Во время получения внутриклеточных телец различные типы взаимодействия могут привести к вторичной адсорбции других загрязняющих веществ, таких как эндотоксины, остатки стенок клеток и липиды (Marston FAO, Biochem. J. 240: 1-12, 1986). Средний размер частиц внутриклеточных телец зависит от экспрессированного конкретного целевого белка, штамма-реципиента, экспрессионной системы и используемой культуральной среды и может быть в интервале от 0,07 мкм для гормона роста человека (Blum P. et al., Bio/Technology 10: 301-304, 1992) до 1,5 мкм для β-лактамазы (Bowden et al., Bio/Technology 9: 725-730, 1991). Дополнительное описание можно найти в патенте США № 4512922, который говорит о внутриклеточных тельцах как о "преломляющих тельцах".
Внутриклеточные тельца обычно собирают из клеточного лизата путем нескольких стадий центрифугирования и промывки после того, как клетки лизированы (например, путем лизиса лизоцимом, обработки ультразвуком или гомогенизацией под высоким давлением, см., например, патенты США №№ 4511503, 4518526, 5605691 и 6936699). Очищенные внутриклеточные тельца затем растворяют или денатурируют, например, детергентом или другим раствором (мочевиной, SDS, гидрохлоридом гуанидина), что заставляет нерастворимые молекулы белка развернуться и стать растворимыми. Денатурант может быть затем удален, например, диализом, молекулярным ситом или центрифугированием при высокой скорости для удаления компонентов более высокого молекулярного веса и декантирования денатуранта. Рекомбинантный белок отделяют и подвергают повторной укладке, чтобы образовать правильные структуры высокого порядка, которые являются биологически активными.
Для того чтобы гарантировать эффективную реакцию рефолдинга важно контролировать количество и концентрацию белков в реакции рефолдинга. Белки, извлеченные из внутриклеточных телец, обычно определяют анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) аликвоты сбора внутриклеточных телец. Однако современные методы анализа ВЭЖХ являются сложными и отнимающими много времени из-за природы процесса.
Таким образом, в данной области сохраняется потребность в более эффективных и точных способах определения концентраций рекомбинантного белка, продуцированного во время рекомбинантного получения белков.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные методы количественного определения белка, продуцированного и перенесенного во внутриклеточные тельца в рекомбинантных белковых (бактериальных) культурах.
В одном аспекте изобретение предлагает способ расчета концентрации рекомбинантного белка в сборах бактериального внутриклеточного тельца (IB, inclusion body), включающий шаг умножения суммарной концентрации сухих веществ в аликвоте взвеси сбора IB и коэффициента пересчета продуктивности белка (PPCF, Protein Productivity Conversion Фактор) в формуле, где результат формулы дает суммарную концентрацию белка в указанной аликвоте указанной взвеси сбора IB, и где PPCF для указанного рекомбинантного белка определяют из аликвоты взвеси сбора IB умножением отношения рекомбинантного белка в указанной аликвоте к суммарному содержанию сухих веществ в указанной аликвоте на 1000. Суммарный рекомбинантный белок может быть рассчитан согласно формуле
[(суммарное количество сухих веществ, мг)/(аликвота взвеси сбора IB, г) × PPCF] × общий вес взвеси сбора IB, г = (суммарный рекомбинантный белок, мг).
Коэффициент пересчета продуктивности белка может быть рассчитан согласно формуле
(PPCF) = [рекомбинантный белок (мг) в указанной аликвоте/сумма сухих веществ в указанной аликвоте (мг)] × 1000.
В альтернативном осуществлении коэффициент пересчета продуктивности белка может быть рассчитан на основе альтернативных единиц, которые должны быть определены. Например, концентрации могут быть выражены как г/кг, г/л, мг/г, мг/мл и являются, вообще говоря, эквивалентными, поскольку плотности материала очень близки к единице. По существу концентрация в мг/мл эквивалентна концентрации в мг/г, допуская, что плотность близка к 1 г/мл.
В одном аспекте рекомбинантным белком может быть любой белок, который экспрессирован в бактериях в форме нерастворимого внутриклеточного тельца в трансформированных бактериях, т.е. бактериях, которые были трансформированы или трансфицированы векторами рекомбинантной ДНК, которые направляют экспрессию генов, кодированных для гетерологичных белков. Рекомбинантные белки, предполагаемые для использования в способе по изобретению, включают, но не ограничиваются этим, антитело (такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, фрагменты антител Fab, F(ab')2, Fv, Sc Fv или SCA, биспецифичное антитело, диатело, пептитело, химерное антитело и линейное антитело), фермент, гормон, цитокин, хемокин, фактор роста, транскрипционный фактор, трансмембранный белок, рецептор клеточной поверхности, белок неспецифической адгезии клеток, цитоскелетный белок, белок слияния или фрагмент или аналог любого из вышеназванных белков.
В одном осуществлении PPCF для одной аликвоты сбора внутриклеточных телец используют для расчета концентрации рекомбинантного белка от различных ферментационных сборов внутриклеточных телец, проведенных по одной и той же методике.
В другом аспекте изобретение предполагает, что суммарный рекомбинантный белок в указанной аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец вначале определяют анализом методом ВЭЖХ. В одном осуществлении титр белка определяют после солюбилизации внутриклеточных телец в аликвоте сбора внутриклеточных телец и рекомбинантный белок в образце определяют анализом ВЭЖХ.
В следующем аспекте внутриклеточные тельца в аликвоте сбора внутриклеточных телец не солюбилизируют до сушки.
Изобретение далее предполагает, что сухой вес аликвоты внутриклеточных телец рассчитывают путем сушки выделенной взвеси внутриклеточных телец микроволновым излучением. В одном осуществлении сушка дополнительно включает использование тепла. В следующем осуществлении сушку проводят в приборе CEM LabWave 9000. Дополнительно предполагается, что сухой вес рекомбинантного белка может быть определен с использованием общепринятого в практике метода, включающего нагрев, микроволновое излучение, сушку воздухом, лиофилизацию, сушку вымораживанием и вакуумную сушку. После того как образец высушен, сухой вес твердых веществ может быть определен количественно с использованием обычных весов.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные способы количественного определения белка, продуцированного и перенесенного во внутриклеточные тельца в культурах клеток-реципинтов рекомбинантного белка.
Как описано здесь, было обнаружено, что при одних и тех же или практически идентичных условиях ферментации образование внутриклеточных телец является в высокой степени упорядоченным процессом и состав рекомбинантного белка внутриклеточных телец является весьма консистентным. Опираясь на обнаружение этой консистентности образования и состава внутриклеточных телец, был предложен и верифицирован способ определения концентрации рекомбинантного белка во внутриклеточных тельцах путем количественного определения сухого веса или процента твердых веществ во взвеси сбора внутриклеточных телец и последующего умножения этой измеренной величины сухого веса на заранее определенный коэффициент пересчета. Полагаясь на консистентность состава внутриклеточных телец, способ определяет концентрацию рекомбинантного белка только в малой аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец, чтобы рассчитать коэффициент пересчета для конкретного белка, и устраняет необходимость количественного определения во всем сборе внутриклеточных телец с использованием отнимающих много времени и сложных методов, таких как ВЭЖХ. После того как процесс ферментации разработан и создан для продуцирования данного рекомбинантного белка в данной клетке-реципиенте, коэффициент пересчета для этого белка может быть использован для экстраполяции суммарного рекомбинантного белка для различных партий сборов внутриклеточных телец без необходимости проводить расчет для каждой партии до тех пор, пока процесс ферментации остается существенно неизменным. Это открытие предлагает быстрый, надежный и менее дорогой способ контроля количества/концентрации белков перед ключевыми стадиями процесса, такими как рефолдинг. Кроме того, предварительно определенный коэффициент пересчета может быть использован для мониторинга консистентности ферментации.
Термин "рекомбинантный белок" относится к молекуле гетерологичного белка, которая экспрессирована в клетки-реципиенты, трансфицированные молекулой гетерологичной ДНК.
Термин "внутриклеточное тельце" относится к нерастворимому агрегату внутри бактериальной клетки-реципиента, который содержит белок, экспрессированный в клетку-реципиент. В то время как белок во внутриклеточных тельцах в трансфицированных клетках-реципиентах является почти полностью рекомбинантным (гетерологичным) белком, эндогенные (или гомологичные) белки клеток-реципиентов могут составлять часть суммарного белка.
Термин "сбор внутриклеточных телец" относится к собранным внутриклеточным тельцам, продуцированным во время процесса ферментации для получения рекомбинантного белка. Сбор внутриклеточных телец может иметь разную степень очистки. Образцы Post Kill ("после цитолиза") относятся к образцам бактериальной культуры перед лизисом, но после цитолиза бактерий методами, известными в практике. Термин "Cell Paste" ("клеточная паста") относится к образцу сбора выросших в культуре внутриклеточных телец, коллектированному обычно центрифугированием перед лизисом бактериальных клеток-реципиентов для высвобождения внутриклеточных телец. Промытая часть внутриклеточных телец (WIB) относится к сбору выросших в культуре внутриклеточных телец после промывки внутриклеточных телец по меньшей мере один раз или два раза (дважды промытые внутриклеточные тельца, DWIB).
Термин "взвесь внутриклеточных телец" или "взвесь сбора внутриклеточных телец" относится к сбору выросших в культуре внутриклеточных телец, который содержит объем осадка внутриклеточных телец и любой остаточный объем, остающийся после коллектирования внутриклеточных телец, например, центрифугированием и декантированием супернатанта. Взвесь внутриклеточных телец может включать повторно суспендированный или частично ресуспендированный в воде осадок внутриклеточных телец.
Термин "сухой вес" относится к весу аликвоты сбора внутриклеточных телец после того, как вся жидкость удалена из образца или микроволновым излучением, или нагревом, или другими известными в практике методами. Сухой вес может также относиться к суммарному твердому веществу внутриклеточных телец или к весу рекомбинантного белка в расчете на процент рекомбинантного белка в твердом веществе внутриклеточных телец.
Термин "процент твердых веществ" относится к количеству твердых веществ в аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец после сушки образца и удаления всей жидкости из образца.
Термин "коэффициент пересчета продуктивности белка (PPCF)" относится к числу, специфичному для рекомбинантного белка, очищенного из сбора внутриклеточных телец при конкретных условиях ферментации, и коэффициент пропорционален отношению веса рекомбинантного белка в образце к весу суммарных твердых веществ во внутриклеточных тельцах в этом же образце. Этот коэффициент пересчета продуктивности белка делает возможным определение суммарного рекомбинантного белка, извлеченного из сбора внутриклеточных телец. В одном аспекте коэффициент пересчета продуктивности белка определяют анализом методом ВЭЖХ. PPCF рассчитывают по формуле
(PPCF) = [суммарный рекомбинантный белок в аликвоте сбора IB, (мг)/сумма сухих веществ в той же аликвоте сбора IB, (мг)] × 1000.
Термин "концентрация суммарного рекомбинантного белка" относится к суммарному белку, извлеченному из процесса ферментации, рассчитанной как масса рекомбинантного белка во внутриклеточных тельцах от общей массы сухих твердых веществ в сборе внутриклеточных телец. Суммарный рекомбинантный белок может быть рассчитан, используя следующую формулу
[(суммарное количество сухих веществ, мг)/(аликвота взвеси сбора IB, г) × PPCF] × общий вес взвеси сбора IB, г = (суммарный рекомбинантный белок, мг).
Настоящее изобретение является полезным для определения коэффициента пересчета продуктивности белка для любого рекомбинантного белка, который получен в разработанном процессе ферментации. Рекомбинантные белки, предполагаемые для использования в способе по изобретению, включают, но не ограничиваются этим, антитело (такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, фрагменты антител Fab, F(ab')2, Fv, Sc Fv или SCA, биспецифичное антитело, диатело, пептитело, химерное антитело и линейное антитело), фермент, гормон, цитокин, хемокин, фактор роста, транскрипционный фактор, трансмембранный белок, рецептор клеточной поверхности, белок неспецифической адгезии клеток, цитоскелетный белок, белок слияния или фрагмент или аналог любого из вышеназванных белков.
Очистка и выделение внутриклеточных телец
Методы выделения внутриклеточных телец, очистки рекомбинантного белка из внутриклеточных телец и методы рефолдинга или ренатурации белка хорошо известны специалистам (см., например, Sambrook J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, pp. 17.37-17.41, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Rudolph R. et al., FASEB J. 10:49-56 (1995)).
Очистка внутриклеточных телец может быть проведена с использованием хорошо известных в практике методов (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, Ch., 1994). Клетки сперва центрифугируют, получая осадок клеток. Осадок затем ресуспендируют в подходящем буферном растворе и внутриклеточные тельца высвобождают, лизируя клетки под высоким давлением, обработкой ультразвуком или химическими средствами, такими как добавление лизоцима или денатурирующих агентов. В настоящем изобретении предполагается, что клетки лизируют при условиях, которые не приводят к солюбилизации внутриклеточных телец.
Для целей расчета PPCF для белка в процессе ферментации белки в аликвоте сбора внутриклеточных телец могут быть солюбилизированы с использованием обычно используемых в практике, включающих соли гуанидиния, мочевину, детергенты и другие органические растворители (см., например, патент США 5605691 и Bruggeman et al., Biotechniques 10:202-209, 1991). Отмечено, что эффективность солюбилизирующего агента варьируется с физическими свойствами белка. Типичные соли гуанидиния включают гуанидин-HCl. Типичные детергенты включают додецилсульфат натрия (SDS), тритон-Х, каприловую кислоту, холевую кислоту, 1-декансульфоновую кислоту, деоксихолевую кислоту, гликохолевую кислоту, гликодеоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродеоксихолевую кислоту и члены семейства натриевых солей сульфатных детергентов (например, тетрадецилсульфат натрия и гексадецилсульфат натрия (см., например, патент США 5605691)). Эти реагенты могут быть использованы по одному или в сочетании с каждым другим или другими реагентами, которые пригодны для очищаемого рекомбинантного белка.
Экспрессия белка
Внутриклеточные тельца, представляющие интерес в настоящем изобретении, образуются экспрессией рекомбинантного белка в бактериальных реципиентных штаммах. Бактериальные реципиентные штаммы, предусмотренные для использования в изобретении, включают штаммы E.coli, включающие, но не ограниченные этим, BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS и BL21 (DE3) pLysE (F.W.Studier et al., Methods in Enzymology 185:60-89 (1990), MC1061, AG1, AB1157, BNN93, BW26434, CGSC Strain # 7658, C60, C600 hflA150 (Y 1073, BNN 102), D1210, DB3.1, DH1, DH5α, DH10B, DH12S, DM1, ER2566 (NEB), HB101, IJ1126, IJ1127, JM83, JM101, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, JM109(DE3), JM110, JM2.300, LE392, Mach1, MC4100, MG1655 Rosetta (DE3) pLysS, Rosetta-gami (DE3) pLysS, RR1, STBL2, STBL4, SURE, SURE2, TG2, TOP10, Top10F, W3110, XL1-Blue, XL2-Blue, XL2-Blue MRF, XL1-Red, XL10-Gold, XL10-Gold KanR. Другие бактериальные штаммы известные науке, пригодные для продуцирования рекомбинантного белка и которые образуют внутриклеточные тельца, могут быть использованы в способах по изобретению.
Рекомбинантные белки экспрессируют в выбранный штамм согласно стандартным методикам ферментации, известным в этой области. Методики приспособлены к используемому бактериальному штамму и к рекомбинантному белку, который должен быть экспрессирован. Например, бактериальные культуры могут быть выращены до выбранной плотности (OD600) культуры и при должном выборе среды до сбора с культуры внутриклеточных телец (см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, Ch., 1994). Способы продуцирования рекомбинантного белка описаны, например, в патентах США №№ 6759215 и 6632426.
Определение белка в сборах внутриклеточных телец
Концентрация рекомбинантного белка в аликвоте сбора внутриклеточных телец может быть определена с использованием методов, известных специалистам, включающих высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), ионообменную хроматографию, тест Брэдфорда, УФ поглощение, методы флюоресценции или вестерн-блоттингом. Из указанных выше методов методы ВЭЖХ позволяют рассчитать и концентрацию белка, и чистоту образца в одном и том же тестовом запуске. Следовательно, настоящее изобретение в одном аспекте предполагает, что определение концентрации белка в образце проводят, используя ВЭЖХ.
Для того чтобы определить количество белка в аликвоте ферментационной культуры и сбора с культуры внутриклеточных телец, проводят определение титра ВЭЖХ. При определении титра ВЭЖХ коллектируют пробную аликвоту сбора IB, внутриклеточные тельца солюбилизируют и белок денатурируют. Образец затем готовят для ВЭЖХ, чтобы определить чистоту/концентрацию белка в образце белка, используя способы и методики, хорошо известные специалистам (Current Protocols in Protein Chemistry, Wiley & Sons, NY, 1994), или описанные здесь. Независимо от того как определена концентрация рекомбинантного белка в аликвоте сбора IB, рассчитанную концентрацию используют затем для определения коэффициента пересчета продуктивности белка.
Методы определения сухого веса внутриклеточных телец или процента твердых веществ
Сухой вес внутриклеточных телец или процент твердых веществ в сборе внутриклеточных телец может быть определен с использованием любого метода практики, включая нагрев, микроволновое излучение, сушку воздухом, лиофилизацию, сушку вымораживанием и вакуумную сушку. После того как образец высушен, определяют сухой вес твердых веществ, используя стандартные механические весы.
Сочетание нагрева и микроволнового излучения является эффективным для сушки аликвоты образца и определения процента твердых веществ в ней. В одном аспекте сбор внутриклеточных телец может быть высушен с использованием микроволнового излучения и нагрева. Прибор CEM LabWave 9000 (CEM Corporation, Matthews, NC) предназначен для достижения интервала влага/твердые вещества от 0,01% до 99,99% в жидкостях, твердых веществах и взвесях с разрешением 0,01%. Прибор обеспечивает отсчет результата по белку по шкале до 0,1 мг и обеспечивает мощность микроволнового излучения от 0 до 10% полной мощности (630 Вт) с шагом приращения в 1%. В зависимых осуществлениях образец внутриклеточных телец может быть высушен с использованием другого оборудования для анализа влаги, известного в практике, включающего, но не ограниченного этим, CEM AVC-80 Microwave Moisture Analyzer, CEM Smart System, Denver Instrument M2 Microwave Analyzer (Denver Instruments, Denver, CO), Omnimark uWave (Sartorius-Omnimark, Goettingen, Germany) и Sartorius MMA30 (Sartorius, Goettingen, Germany).
Следующие примеры иллюстрируют различные неограничительные осуществления изобретения и/или предлагают их обоснование.
Пример 1
Рекомбинантный белок часто экспрессируется в E. Coli в виде нерастворимых внутриклеточных телец. В прошлом считали, что внутриклеточные тельца являются хаотичным осаждением сверхэкспрессированных рекомбинантных белков. В последнее время, однако, было выдвинуто предположение, что внутриклеточные тельца могут образовываться в процессе упорядоченного агрегирования и, если обнаружено, что эти внутриклеточные тельца имеют консистентный состав рекомбинантных белков, больше нет необходимости количественно определять концентрацию рекомбинантного белка в сборе внутриклеточных телец, используя сложные и требующие длительного времени методы ВЭЖХ для каждой ферментации и каждого сбора внутриклеточных телец. Таким образом, для того чтобы определить продуцированы ли внутриклеточные тельца упорядоченным образом, имея рекомбинантный белок консистентного состава, были запланированы начальные эксперименты для того, чтобы попытаться сформулировать математическую модель, которая могла бы позволить количественно определить содержание белка с минимальными экспериментальными усилиями.
К концу процесса ферментации клеток для изготовления рекомбинантного колониеобразующего фактора гранулоцитов человека (r-metHuG-CSF), клетки-реципиенты E. coli лизировали, используя высокое давление, и внутриклеточные тельца собирали с культуры многократными процессами центрифугирования перед солюбилизацией белка и рефолдингом. Этот бульон внутриклеточных телец затем сначала использовали для анализа концентрации белка.
Для того чтобы определить количество r-metHuG-CSF белка по сравнению с белком реципиента и другими загрязняющими веществами в высушенном образце, определяли "продуктивность" белка. Продуктивность определена как отношение между белком образца и общим сухим весом образца внутриклеточных телец и это соотношение, когда оно умножено на 1000, дает коэффициент пересчета продуктивности белка (PPCF) для целевого рекомбинантного белка, экспрессированного в данном процессе ферментации.
PPCF = [(суммарный рекомбинантный белок, мг) / (сумма сухих веществ, мг)] × 1000.
При определении этого отношения обратно-фазную ВЭЖХ проводили, используя аликвоту взвеси сбора IB. Порцию взвеси сбора IB суспендировали взвихриванием в пробирке или перемешиванием в химическом стакане, и 1 мл суспендированного бульона добавляли к 30 мл инкубационного/денатурирующего буфера (8М гуанидин-HCl, 50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, 50 мМ DTT, pH 8,4±0,1). Смесь инкубировали в водяной бане при 65±3°С в течение приблизительно 30 минут, после чего 40 мкл денатурированного и восстановленного r-metHuG-CSF впрыскивали в колонку POROS R1/10 внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 100 мм (Applied Biosystems, Foster City, CA) на приборе Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA). Рекомбинантный белок элюировался на примерно 6,2 мин при ускоренном градиенте с использованием от 60% подвижной фазы А [0,1% об. TFA (сорт для секванала, Pierce, Rockford, IL), 7% об. IPA в воде] до 55% подвижной фазы В [0,1% об. TFA, 5% об. IPA в ацетонитриле (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)] за 9 мин при расходе 2 мл/мин. На всем протяжении анализа для количественного определения пика белка использовали включенный в непрерывную работу блок УФ-детектора на длине волны 214 нм. Содержание белка r-metHuG-CSF в каждом образце рассчитывали по стандартной калибровочной кривой, построенной линейной регрессией.
Образцы ферментации клеток, отобранные до разрушения клеток, такие как образцы Post Kill и образцы Cell Paste, т.е. образцы, отобранные из клеточного осадка после центрифугирования ферментационного бульона, содержат большое количество компонентов E. coli, включая белки клетки-реципиента. Анализ ВЭЖХ показал, что рекомбинантный белок r-metHuG-CSF в Cell Paste составляет в среднем приблизительно 29% от суммарного сухого веса клеточной пасты (таблицы 1 и 2). Далее, анализ также показал, что соотношение между белками клеток-реципиентов E. coli и белком образца в этой клеточной пасте является переменной величиной, что отражается в относительно большой вариабельности продуктивности Cell Paste (таблицы 1 и 2). Таблица 1 представляет сравнение продуктивности между образцами дважды промытых внутриклеточных телец (DWIB) и продуктивностью Cell Paste, из которой DWIB были получены. Продуктивность выражена как отношение белка образца к общему сухому весу, умноженное на 100, в %. Таблица 2 показывает сравнение продуктивности в промытых внутриклеточных тельцах (WIB) также в сравнении с Cell Paste, из которой WIB были получены.
| Таблица 1 | |||
| Образец 1 | Образец 2 | Разность | |
| Продуктивность Cell Paste | 26% | 30% | -14% |
| Продуктивность DWIB | 68,62% | 66,43% | -3% |
| Таблица 2 | |||
| Партия WIB, № | Продуктивность WIB | Партия Cell Paste, № | Продуктивность Cell Paste |
| xxx418 | 67,13% | xxx657 | 23,9% |
| xxx233 | 67,47% | xxx225 | 29,6% |
| xxx363 | 65,50% | xxx225 | 29,6% |
| xxx232 | 68,27% | xxx225 | 29 6% |
| xxx595 | 69,20% | xxx225 xxx394 |
29,6% 30,2% |
| xxxpp1 | 69,46% | xxxsd2 | 26% |
| xxxpp2 | 67,53% | Xxxsd0 | 30% |
| Xxxpp3 | 63,87% | xxxsd2 | 26% |
| Xxxpp5 | 63,17% | Xxxsd0 | 30% |
| Среднее | 66,84% | 28,5% | |
| RSD | 3,3% | 7,9% | |
Эти результаты и анализы ВЭЖХ показывают, что после того как клетки лизированы, большинство белков клетки-реципиента удаляется из фракции внутриклеточных телец во время стадий центрифугирования. Внутриклеточные тельца, промытые внутриклеточные тельца и дважды промытые внутриклеточные тельца элюируются с почти одинаковым профилем с рекомбинантным белком r-metHuG-CSF, демонстрируя плотный профиль элюирования. Анализ показал, что рекомбинантный белок составляет почти 93% от суммарного белка во внутриклеточных тельцах.
Средняя продуктивность по рекомбинантному белку возрастает с 29% в клеточной пасте до 67% во внутриклеточных тельцах. В дополнение, вариабельность (RSD) снижается от 8% в клеточной пасте до 3% во внутриклеточных тельцах (таблицы 1 и 2).
Используя настоящее изобретение, в случаях, когда рекомбинантные белки образуют внутриклеточные тельца упорядоченным и консистентным между ферментационными сборами образом, и ферментации проводят, следуя одинаковой или практически одинаковой процедуре, коэффициент пересчета продуктивности белка, определенный для аликвоты взвеси сбора IB, может быть использован для определения белка в других ферментационных сборах. Например, будучи однажды рассчитанным, как представлено здесь, суммарный белок в данном количестве взвеси сбора IB может быть легко определен умножением содержания сухого твердого вещества во взвеси на PPCF, определенный выше, без необходимости проводить ВЭЖХ на каждом сборе IB, полученном при одинаковых условиях ферментации.
Пример 2
Для того чтобы определить позволяет ли описанный выше анализ по сухому весу точно предсказать концентрацию рекомбинантного белка в сборе IB, предсказанную концентрацию рекомбинантного белка, полученную с образцами для определения сухого веса, как выше, сравнивали с концентрацией в образцах, полученной с использованием ВЭЖХ.
Приготовление образца для ВЭЖХ было идентично описанному выше определению титра, где 40 мкл денатурированного и восстановленного образца взвеси сбора IB впрыскивали в колонку внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 150 мм с силикагелем с диаметром частиц 5 мкм и размером пор 300Å с нанесенной фазой С4 (YMC, Shimogyo-ku, Kyoto, Japan) на приборе Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA). Смесь восстановленных белков разделялась при полном градиенте c использованием от 20% подвижной фазы А [0,1% об. TFA в воде] до 85% подвижной фазы В [0,1% об. TFA в 90% ацетонитриле] за 80 мин при расходе 0,8 мл/мин. На всем протяжении опыта для мониторинга пиков белка использовали включенный в непрерывную работу блок УФ-детектора на длине волны 214 нм.
При сравнении с традиционным анализом ВЭЖХ анализ по сухому весу сопоставляли с результатами анализа ВЭЖХ (таблица 3). Для сопоставления между анализом ВЭЖХ и анализом по сухому весу число 670 использовали в качестве коэффициента пересчета.
| Таблица 3 | |||
| Партия | Результат по сухому весу (мг/мл) | Результат по ВЭЖХ (мг/мл) | % разницы (сухой вес против ВЭЖХ) |
| xxx001 | 104,16 | 104,56 | -0,4% |
| xxxpp3 | 25,25 | 25,85 | -2,3% |
| xxxpp5 | 16,24 | 16,10 | 0,9% |
| xxxpp6 | 15,82 | 16,45 | -3,8% |
| xxxpp7 | 17,38 | 17,92 | -3,0% |
| xxx776 | 10,50 | 10,09 | 4,1% |
| xxx779 | 10,74 | 10,10 | 6,3% |
| xxx454 | 9,68 | 9,29 | 4,2% |
| xxx780 | 9,83 | 9,96 | -1,3% |
| xxx781 | 9,63 | 9,40 | 2,5% |
| xxx782 | 10,17 | 10,49 | -3,1% |
| xxx458 | 9,95 | 9,79 | 1,6% |
| xxx793 | 10,39 | 9,98 | 4,0% |
| xxx783 | 9,63 | 9,61 | 0,2% |
| xxx784 | 9,70 | 9,78 | -0,9% |
| xxx785 | 8,66 | 9,00 | -3,7% |
| Среднее | 0,3% | ||
Разница между двумя анализами являлась комбинацией свойственных каждому методу вариабельностей и была обусловлена, главным образом, анализом по ВЭЖХ, поскольку он был единичным определением и, как правило, имеет большую вариабельность. Средняя разница между двумя анализами была настолько мала, как 0,3%. Точность анализа по сухому весу, возможно, входит в интервал ±3%.
Эти результаты показывают, что способ определения сухого веса белка путем расчета концентрации белка на основе содержания белка внутриклеточных телец является точным и быстрым способом определения концентрации белка перед поступлением на стадии рефолдинга белка. Определение концентрации белка с использованием этого способа экономит время, требующееся для подготовки образца для ВЭЖХ, а также средства на подготовку этих образцов. Дополнительно, использование определения сухого веса является точным способом определения концентрации белка перед расчетом количеств реагентов, необходимых для стадии рефолдинга белка. Поэтому настоящий способ предлагает более быстрый, более дешевый способ определения концентрации белка при крупномасштабном получении белка.
Пример 3
Для того чтобы выявить факторы, которые могут влиять на описанный выше анализ по сухому весу, анализ был проведен с образцами IB, прошедшими разные подготовительные стадии.
Для определения степени вариабельности в образцах внутриклеточных телец, концентрации metHuG-CSF белка, полученные новым методом измерения сухого веса, сравнивали с концентрациями, полученными обычным измерением методом ВЭЖХ. Второстепенным фактором вариабельности являлась концентрация образца. Когда образцы взвеси сбора IB были очень разбавленными, вариабельность взвешивания возрастала. Анализ по сухому весу обычно проводили дважды на двух приборах, суммарно четыре определения на образец. Анализ ВЭЖХ обычно был единичным определением вследствие его сложности.
Для измерений сухого веса и процента твердых веществ бульон внутриклеточных телец суспендировали взвихриванием в пробирке или перемешиванием в лабораторном стакане. Приблизительно 2 мл суспендированного бульона загружали в предварительно тарированный планшет для образца в приборах CEM Smart System Solids and Moisture Analyzer, CEM LabWave 9000 (CEM Corporation, Matthews, NC, USA). Образец r-metHuG-CSF нагревали и сушили при 100% уровне мощности в течение 5 минут. Процент твердых веществ автоматически рассчитывался прибором.
Результаты сравнения измерений сухого веса показаны в таблицах 4 и 5. Таблица 4 показывает точность анализа по сухому весу при использовании замороженных образцов.
| Таблица 4 | |||||
| Определение | Прибор | % твердых веществ | Определение | Прибор | % твердых веществ |
| 1 | 2 | 3,707% | 2 | 1 | 3,850% |
| 3 | 2 | 3,749% | 4 | 1 | 3,827% |
| 5 | 2 | 3,679% | 6 | 1 | 3,832% |
| 7 | 2 | 3,762% | 8 | 1 | 3,731% |
| Среднее для прибора 2 | 3,724% (n=4) | Среднее для прибора 1 | 3,812% (n=4) | ||
| RSD для прибора 2 | 1,0% (n=4) | RSD для прибора 1 | 1,3% (n=4) | ||
| Общее среднее | 3,768% (n=8) | ||||
| Общая RSD | 1,7% (n=8) | ||||
Точность анализа по сухому весу проверяли также, используя свежие образцы. Проводили два измерения на партию, используя два отдельных прибора, суммарно четыре измерения на партию. Средние для измерений свежих образцов показаны в таблице 5.
| Таблица 5 | ||
| xxxpp6 | xxxpp7 | |
| Среднее | 2,361% (n=4) | 2,594% (n=4) |
| RSD | 0,6 (n=4) | 0,9% (n=4) |
В целом было найдено, что на точность анализа по сухому весу воздействуют два фактора. Главным фактором является свежесть образца: внутриклеточные тельца склонны агрегировать при замораживании-оттаивании или при длительном хранении при 4°С, что приводит к гетерогенности образца и более высокой вариабельности анализа.
Результаты, показанные выше, демонстрируют, что измерения сухого веса внутриклеточных телец сопоставимы с результатами, полученными с использованием типовых измерений методом ВЭЖХ, и все еще являются точными, будь то сбор IB сперва заморожен или хранился при 4оС. Хотя установленный процент твердых веществ может варьироваться вследствие подготовки образца перед измерениями, измерения сухого веса являются консистентными и одного ряда с результатами, полученными с использованием традиционных определений белка методом ВЭЖХ. Таким образом, настоящее изобретение предлагает точный эффективный способ определения концентрации белка в сборе внутриклеточных телец для того, чтобы снизить количество образца, который должен быть отобран перед реакцией рефолдинга, увеличив тем самым количество, которое доступно для реакции рефолдинга, а также предлагает более хороший контроль за поступлением белка на стадию рефолдинга при получении рекомбинантного белка и, наконец, улучшает выход и качество рекомбинантного белка.
Ожидается, что многочисленные модификации и вариации в изобретении, как оно представлено выше в иллюстративных примерах, возникнут у специалистов в данной области. Соответственно только те ограничения, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения, должны быть наложены на изобретение.
Claims (5)
1. Способ измерения концентрации рекомбинантного белка в сборах бактериальных внутриклеточных телец (IB), включающий стадии:
(i) измерения концентрации сухих веществ в аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец; и
(ii) умножения суммарной концентрации сухих веществ в аликвоте взвеси сбора IB с использованием коэффициента пересчета продуктивности белка (PPCF) в формуле, где результат формулы дает суммарную концентрацию рекомбинантного белка в указанной аликвоте указанной взвеси сбора IB, и где PPCF для указанного рекомбинантного белка определяют из аликвоты взвеси сбора IB умножением отношения рекомбинантного белка в указанной аликвоте к суммарному содержанию сухих веществ в указанной аликвоте на 1000,
где PPCF для одной аликвоты сбора внутриклеточных телец используют для расчета концентрации рекомбинантного белка от различных ферментационных сборов внутриклеточных телец, проведенных по одной и той же методике.
(i) измерения концентрации сухих веществ в аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец; и
(ii) умножения суммарной концентрации сухих веществ в аликвоте взвеси сбора IB с использованием коэффициента пересчета продуктивности белка (PPCF) в формуле, где результат формулы дает суммарную концентрацию рекомбинантного белка в указанной аликвоте указанной взвеси сбора IB, и где PPCF для указанного рекомбинантного белка определяют из аликвоты взвеси сбора IB умножением отношения рекомбинантного белка в указанной аликвоте к суммарному содержанию сухих веществ в указанной аликвоте на 1000,
где PPCF для одной аликвоты сбора внутриклеточных телец используют для расчета концентрации рекомбинантного белка от различных ферментационных сборов внутриклеточных телец, проведенных по одной и той же методике.
2. Способ по п.1, в котором суммарный рекомбинантный белок в указанной аликвоте взвеси сбора IB вначале определяют анализом по методу ВЭЖХ.
3. Способ по п.1, в котором сухой вес рассчитывают путем сушки выделенной взвеси внутриклеточных телец микроволновым излучением.
4. Способ по п.3, в котором сушка дополнительно включает использование тепла.
5. Способ по п.3, где сушку проводят в приборе СЕМ LabWave 9000.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US94780007P | 2007-07-03 | 2007-07-03 | |
| US60/947,800 | 2007-07-03 | ||
| PCT/US2008/069529 WO2009006643A2 (en) | 2007-07-03 | 2008-07-09 | Measurement of protein using inclusion body dry weight |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010103451A RU2010103451A (ru) | 2011-08-10 |
| RU2468373C2 true RU2468373C2 (ru) | 2012-11-27 |
Family
ID=40040158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010103451/15A RU2468373C2 (ru) | 2007-07-03 | 2008-07-09 | Количественное определение белков с использованием сухого веса внутриклеточных телец |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8492113B2 (ru) |
| EP (2) | EP2174140B1 (ru) |
| JP (1) | JP5244175B2 (ru) |
| KR (1) | KR20110016430A (ru) |
| CN (1) | CN101815944A (ru) |
| AU (1) | AU2008272762B2 (ru) |
| CA (1) | CA2692585A1 (ru) |
| EA (1) | EA018715B1 (ru) |
| MX (1) | MX2010000143A (ru) |
| RU (1) | RU2468373C2 (ru) |
| WO (1) | WO2009006643A2 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040235089A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-11-25 | Panda Amulya Kumar | Process for solubilization of recombinant proteins expressed as inclusion body |
| RU2278870C2 (ru) * | 2004-08-30 | 2006-06-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4511503A (en) | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4512922A (en) | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4518526A (en) | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| JPS6140794A (ja) * | 1984-07-09 | 1986-02-27 | ジエネツクス コ−ポレ−シヨン | λフア−ジ調節領域の制御下にインタ−ロイキン２活性を有するポリペプタイドをコ−ドする遺伝子の発現ベクタ− |
| US6759215B1 (en) | 1989-10-16 | 2004-07-06 | Amgen Inc. | Method of preparing human stem cell factor polypeptide |
| US5605691A (en) | 1992-09-17 | 1997-02-25 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Immunologically active proteins from inclusion bodies |
| US5581476A (en) | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| US20020052026A1 (en) * | 1997-10-08 | 2002-05-02 | Steven M. Vicik | Methods of refolding proteins |
| RU2163019C2 (ru) * | 1999-03-02 | 2001-02-10 | Таран Олег Иванович | Способ качественно-количественного определения содержания белка в биологических растворах |
| DE10022258A1 (de) | 2000-05-08 | 2001-11-15 | Bayer Ag | Reinigung von Proteineinschlusskörpern durch Querstrom-Mikrofiltration |
| EP1572953A4 (en) * | 2002-07-09 | 2008-05-21 | Bristol Myers Squibb Co | FOR A NEW TESTIS-SPECIFIC TUBULIN TYROSINE LIGASE-LIKE PROTEIN, BGS42, CODING POLYNUCLEOTIDE |
| US20060024660A1 (en) * | 2004-07-27 | 2006-02-02 | Patrick Jouin | Method for relative quantification of proteins |
| WO2006094185A2 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Dmi Biosciences Inc. | Quantification of proteins |
-
2008
- 2008-07-09 EA EA201070093A patent/EA018715B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-07-09 CA CA 2692585 patent/CA2692585A1/en not_active Abandoned
- 2008-07-09 US US12/667,665 patent/US8492113B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-09 RU RU2010103451/15A patent/RU2468373C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-07-09 WO PCT/US2008/069529 patent/WO2009006643A2/en not_active Ceased
- 2008-07-09 JP JP2010515289A patent/JP5244175B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-09 KR KR1020107002451A patent/KR20110016430A/ko not_active Ceased
- 2008-07-09 MX MX2010000143A patent/MX2010000143A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-07-09 CN CN200880105528A patent/CN101815944A/zh active Pending
- 2008-07-09 EP EP08772480.3A patent/EP2174140B1/en not_active Not-in-force
- 2008-07-09 AU AU2008272762A patent/AU2008272762B2/en not_active Ceased
- 2008-07-09 EP EP12177170A patent/EP2544008A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040235089A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-11-25 | Panda Amulya Kumar | Process for solubilization of recombinant proteins expressed as inclusion body |
| RU2278870C2 (ru) * | 2004-08-30 | 2006-06-27 | Закрытое Акционерное Общество "Биокад" | Способ получения, выделения, очистки и стабилизации рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека, пригодного для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GROSS-SELBECK S. et al Fast quantification of recombinant protein inclusion bodies within intact cells by FT-IR spectroscopy. Biotechnol Prog. 2007, v.23(3), p.762-6 (реферат). * |
| VENTURA SALVADOR et al Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends in Biotechnology. 2006. v.24, No.4. Найдено в PabMed, статья. * |
| VENTURA SALVADOR et al Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends in Biotechnology. 2006. v.24, №4. Найдено в PabMed, статья. GROSS-SELBECK S. et al Fast quantification of recombinant protein inclusion bodies within intact cells by FT-IR spectroscopy. Biotechnol Prog. 2007, v.23(3), p.762-6 (реферат). * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009006643A8 (en) | 2009-02-19 |
| AU2008272762A1 (en) | 2009-01-08 |
| CA2692585A1 (en) | 2010-01-04 |
| EA201070093A1 (ru) | 2010-10-29 |
| EP2174140B1 (en) | 2016-01-13 |
| US20110045527A1 (en) | 2011-02-24 |
| EA018715B1 (ru) | 2013-10-30 |
| RU2010103451A (ru) | 2011-08-10 |
| CN101815944A (zh) | 2010-08-25 |
| JP5244175B2 (ja) | 2013-07-24 |
| EP2544008A1 (en) | 2013-01-09 |
| US8492113B2 (en) | 2013-07-23 |
| KR20110016430A (ko) | 2011-02-17 |
| MX2010000143A (es) | 2012-09-19 |
| AU2008272762B2 (en) | 2014-06-19 |
| JP2011527744A (ja) | 2011-11-04 |
| WO2009006643A9 (en) | 2009-04-02 |
| WO2009006643A2 (en) | 2009-01-08 |
| EP2174140A2 (en) | 2010-04-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6571666B2 (ja) | ビタミンｄ結合タンパク質からビタミンｄを解離するための溶液、その関連検出法及び使用 | |
| Herget-Rosenthal et al. | Measurement of urinary cystatin C by particle-enhanced nephelometric immunoassay: precision, interferences, stability and reference range | |
| CN103777023A (zh) | 纳米胶乳增强免疫比浊法测定脂联素的试剂盒 | |
| CN103076456B (zh) | 一种用免疫透射比浊法检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒 | |
| CN104969067A (zh) | 维生素d的测定方法及测定用试剂盒 | |
| CN101893619A (zh) | 改进乳胶悬浊液稳定性的方法 | |
| CN101718779A (zh) | 检测人血清铜蓝蛋白的免疫纳米金同步散射光谱试剂盒及其使用方法 | |
| CN101846684A (zh) | 检测aib1的双抗体夹心酶联免疫吸附试剂盒及制备方法 | |
| RU2468373C2 (ru) | Количественное определение белков с использованием сухого веса внутриклеточных телец | |
| CN105753932A (zh) | 猪脂肪组织中总蛋白的提取及ChREBP蛋白的Western blot检测方法 | |
| CN108085365A (zh) | 一种脱落酸的免疫pcr测定方法 | |
| CN107892713B (zh) | 抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒 | |
| CN117607459B (zh) | 一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN105388285B (zh) | 一种检测h因子浓度的方法、设备及试剂盒 | |
| Peng et al. | A novel fluorescence internal filtration immunoassay for the detection of clenbuterol | |
| CN111007259A (zh) | 一种用于检测乙酰胆碱受体抗体（AchR-Ab）的电化学发光试剂盒的制备 | |
| Zhou et al. | A flow injection chemiluminescent immunosensor for ultrasensitive detection of brombuterol based on resin beads and enzymatic amplification | |
| CN110068687B (zh) | 血清中心肌肌钙蛋白i复合物的非诊断目的的定量测量方法 | |
| CN120349421B (zh) | 一种抗脱硫丙硫菌唑的重组全长抗体及其应用 | |
| Maeda et al. | Urinary carboxylesterase 5A fragment as an early diagnostic marker of cat chronic kidney disease | |
| US20150104811A1 (en) | Method for pretreating biological sample containing protein | |
| Kradtap Hartwell et al. | Sequential injection-immunoassay system with a plain glass capillary reactor for the assay of hyaluronan | |
| WO2016009971A1 (ja) | 抗ホスホリパーゼａ２レセプター抗体の簡易測定 | |
| WO2014122974A1 (ja) | カオトロピック剤を利用するビタミンｄの測定方法 | |
| Odegov et al. | Development of the Experimental Kit for Quantitative Measuring of TNF-alpha in Biological Liquids by IEA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150710 |