CN107892713B

CN107892713B - 抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒

Info

Publication number: CN107892713B
Application number: CN201710839199.0A
Authority: CN
Inventors: 胡菡; 李建科; 冯毛; 房宇; 韩宾
Original assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Apicultural Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107892713A

Abstract

本发明公开了抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒。本发明以SEQ ID No.1所示序列为抗原采用细胞融合得到阳性细胞株112株，通过交叉反应检测获得14株融合细胞株，经过三轮亚克隆挑选其中亲和力更高的7株进行抗体表位检测和配对实验，标曲绘制及样本测定结果发现，其中的3G4与2D2这两株有较好的线性关系且灵敏度高；本发明进一步将其构建双抗体夹心ELISA法检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒。本发明酶联免疫试剂盒特异性检测MRJP3且与其他相关蛋白无交叉反应，检测范围为0.78ng/mL‑50ng/mL，检测灵敏度为194pg/mL，精密度高，批间差小。

Description

抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及蜂王浆主蛋白单克隆抗体的制备及其应用，尤其涉及蜂王浆主蛋白3单克隆抗体的制备，本发明进一步涉及用所制备的蜂王浆主蛋白3单克隆抗体构建的双抗体夹心ELISA法检测蜂王浆主蛋白3(MRJP3)的酶联免疫试剂盒及其应用，属于蜂王浆主蛋白3的检测领域。

背景技术

蜂王浆是一种具有滋补保健和延年益寿功能的天然功能性蜂产品。蜂王浆成分复杂，营养丰富，其中蛋白质含量为12.0％～15.0％。由于蜂王浆不易保存，极易变质。因而，蜂王浆的品质和其新鲜度紧密相关。目前，国际上缺少一个公认的，可以广泛推广、能如实反映蜂王浆新鲜度的方法，着也是现行蜂王浆质量标准的一个缺陷。

中国是世界蜂王浆的第一生产国和第一出口国。因此，探求和建立蜂王浆新鲜度评价方法势在必行。研究表明，王浆主蛋白与蜂王浆的新鲜度呈正相关，即蜂王浆越新鲜其王浆主蛋白含量越高。

如果利用MRJP3单克隆抗体筛选出特异性好、灵敏度高的抗体对，进而开发双夹心ELISA试剂盒实现对MRJP3的绝对定量，将能够为蜂王浆新鲜度检测提供可靠和可实际应用的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供针对MRJP3蛋白的特异性好、灵敏度高的蜂王浆主蛋白3单克隆抗体对；

本发明的目的之二是将所制备的一对蜂王浆主蛋白3单克隆抗体应用于蜂王浆主蛋白3的定量；

本发明的目的之三提供一种双抗体夹心ELISA法检测蜂王浆主蛋白3(MRJP3)的酶联免疫试剂盒。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将MRJP3的全序列经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定SEQ ID No.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。本发明进一步将所制备的抗原纯化后免疫Balb/c小鼠，采用细胞融合技术制备融合细胞；进行半固体和液体融合共10板，一共获得阳性细胞株112株；其中，效价值为0.5-2.0区间的有58株，效价值大于2.0的有54株。经过与重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得14株MRJP3融合细胞株。挑选其中的17株进行一亚，一亚检测后筛选出14株二亚，经过三轮的亚克隆，最终定株杂交瘤细胞株14株，挑选了其中亲和力更高的7株进行后续抗体表位检测和配对实验。抗原表位配对检测与2D2具有不同表位的细胞株分别为11B7/3G4/4H2，进行下一步的配对初筛。抗体配对初筛结果表明，就灵敏度而言，11B7和3G4更高，下一步直接测样，再次检测。抗体配对测样及配对标准曲线摸索结果表明：三对配对测样均可，只是11B7和3G4作为包抗，结果更优。标准曲线摸索结果发现：第一次标准曲线摸索发现两组配对均可，且灵敏度较高，从测值来看，最高点以及检抗浓度都可以再下调一些；进行第二次调整后测定，认为两组配对均可，但3G4在同等条件下，灵敏度较高，确认标准曲线的最高点，再次绘制标准曲线；标准曲线绘制及样本测定结果发现，从配对标准曲线的各项参数来看，3G4和11B7均与2D2有较好的线性关系，但是3G4灵敏度相对更高，故最终确定3G4和2D2用于构建检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒。

本发明将分泌2D2和3G4的杂交瘤细胞系分别提交提交专利认可的机构进行保藏；其中，分泌单克隆抗体2D2的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：CGMCC No.13847；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年5月26日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

分泌单克隆抗体3G4的杂交瘤细胞株的微生物保藏编号为：CGMCCNo.13848；分类命名为：小鼠杂交瘤细胞。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年5月26日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

由此，本发明进一步提供了一种采用双抗体夹心ELISA法检测MRJP3的酶联免疫试剂盒，包括：抗MRJP3的一抗，生物素标记的抗MRJP3的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其中，所述的抗MRJP3的一抗是本发明制备的单克隆抗体2D2，所述的生物素标记的抗MRJP3的二抗是本发明制备的单克隆抗体3G4；或者是所述的抗MRJP3的一抗是本发明制备的单克隆抗体3G4；所述的生物素标记的抗MRJP3的二抗是本发明制备的单克隆抗体2D2。

本发明试剂盒检测MRJP3含量的工作原理或使用方法如下：

用纯化的抗体包被微孔板制成固相载体，向包被抗MRJP3抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MRJP3抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的MRJP3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。

应用本发明酶联免疫试剂盒采用双抗体加心ELISA法定量测定样本中MRJP3含量的结果表明，本发明酶联免疫试剂盒检测范围：0.78ng/mL-50ng/mL，检测灵敏度为194pg/mL；精密度实验结果表明，批内差CV％<8％，批间差CV％<10％；特异性实验结果表明，本发明试剂盒特异性检测MRJP3且与其他相关蛋白无交叉反应。

附图说明

图1为抗原MRJP3在大肠杆菌中重组表达后放大纯化的SDS结果；

图2为3G4和11B7与2D2配对的标准曲线；

图3为细胞株3G4特异性验证结果；

图4为细胞株2D2特异性验证结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体制备

一、Major royal jelly protein 3基因的序列分析以及抗原序列的选择

Major royal jelly protein 3基因编码544个氨基酸，无跨膜区，1-20aa为信号肽序列，亲水性较好，且序列区别于MRJPs家族其他同源性较高蛋白。

经过跨膜区分析、信号肽分析、疏水性分析、无序序列分析、抗原性分析、同源性分析和结构域分析，最终选定SEQ ID No.1所述氨基酸序列为抗原序列在大肠杆菌中进行表达制备抗原。

二、抗原的制备和纯化

1.小量表达

1.1将测序鉴定正确的重组质粒转化表达宿主。

1.2挑取含重组质粒的单菌落至3mL LB(含抗生素)中37℃过夜培养。

1.3取30μL过夜培养菌液加入到含3mL LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6；剩余的过夜培养液添加甘油到20％置于-80℃，作为工作种子备用。

1.4取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM作为实验组，两组继续37℃震荡培养3h。

1.5取菌体1mL，离心12000g×30s收获沉淀，用100μL 1％SDS重悬，混匀，100℃10min。12000g离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测分析。

2.蛋白表达与破菌检测

2.1取保存于-80℃的菌种20μL转接入20mL液体LB培养基(含相应抗生素)。

2.2取2mL过夜培养菌液加入到含2000mL LB培养基中，37℃震荡培养至OD600约0.6，降低温度到30℃。

2.3加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM作为实验组，30℃继续震荡培养3h。

2.4收集发酵液，6000g离心10min收集菌体。将菌体悬浮于40mL预冷的NTA-0(Tris-HCl 20mmol/L(pH 7.9)，NaCl 0.5mol/L，甘油10％)缓冲液中。

2.5冰浴超声波破碎细菌，控制功率为300W，超声4s，暂停4s，超声90次。

2.6 20000g，4℃离心30min，收集上清以及沉淀。

2.7取少量样品进行SDS-PAGE检测；剩余上清及沉淀至于0-7℃备用。

抗原MRJP3在大肠杆菌中重组表达后，放大纯化的SDS结果。蛋白浓度为2mg/mL，分子量大小为38Kd，纯度为80％。

3.蛋白纯化

3.1将Ni-NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗。

3.2将样品加到层析柱中，流速控制在0.5mL/min左右，收集穿透部分。

3.3层析用10倍柱床体积的NTA-0Buffer冲洗，流速控制在1mL/min左右。

3.4分别用10倍柱床体积的NTA-20，NTA-60，NTA-200，NTA-500Buffer洗脱(注：NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500溶液分别为NTA-0溶液含咪唑20mmol/L、60mmol/L、200mmol/L、500mmol/L)，流速控制在1mL/min左右，收集各洗脱峰。

3.5 SDS-PAGE检测各组分。

3.6纯度达到要求的组分，至于透析带中，4℃以1×PBS透析(换液2次)。

3.7 4℃超滤浓缩透析产物。

三、抗体的制备

(一)、小鼠免疫及血清效价评价

1.免疫Balb/c小鼠，8周左右成年雌性，抗原与等体积完全佐剂(首免)和不完全佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于PBS中，具体免疫程序见表1。

表1小鼠免疫程序

2.免疫后效价检测方法：间接法检测血清效价，具体方法如下：

1)包被：将抗原按1μg/mL浓度包被96孔板每孔50μL，37℃2h或4℃过夜；

2)封闭：2％BSA或者5％的脱脂牛奶封闭液200μL/孔，37℃1h或4℃过夜，TBST洗4遍；

3)一抗：将之前已经准备好的小鼠血清用样稀或者PBS按一定稀释倍数进行检测；

4)37℃温育1h后洗板4次，加二抗，用酶稀按1:10000稀释Jackson二抗，100μL/孔，37℃温育1h；

5)洗板4次后显色：加底物溶液100μL/孔，37℃恒温箱放置5～10min；

6)终止反应、比色：加30μL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm的吸光值。

3.血清效价结果

效价检测结果见表2。

表2血清效价检测结果

根据效价检测结果可见，免疫后小鼠血清效价好，灵敏度较高，完全满足后续实验要求。

(二)、细胞融合

末次冲击3天后，摘除眼球处死，并收集阳性对照血，取出脾脏，制备成单细胞悬液，然后取出处于对数期的SP2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)，50％PEG1450作用1min，以基础培养基DMEM稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的HAT培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×10⁷/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％CO₂，37℃下培养。具体步骤如下：

1)脾细胞：小鼠解剖取出免疫好的脾脏，并分离脾脏中的淋巴细胞；

A.在超净工作台中准备一个1.5mL离心管，加入1mL无血清培养基，两个3.5cm培养皿，加入2mL无血清培养基，两根15mL离心管，其中一根加入10mL无血清培养基，手术器械(高压湿热灭菌)，绢网，移液器(1mL)，枪头。

B.取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过断颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，放蜡盘上固定后剪开脾脏上皮肤，用镊子取出脾脏，放在1.5mL离心管中。

C.将脾脏转移到超净台里的其中一个3.5cm培养皿中，摘除脾脏上面的脂肪和结缔组织，洗一遍，铺开一张绢网放在培养皿盖子上，将脾脏轻轻挤破，放在绢网中间位置。将绢网两次对折，用移液器吸取无血清培养基轻轻吹散，用研磨棒研磨，使脾脏内淋巴细胞透过绢网制成单细胞悬液，收集单细胞悬液于15mL离心管中，1000rpm离心5min。

2)SP2/0准备：取瘤分离制备单细胞悬液后，1000rpm，离心5min后弃掉上清，10-20mL DMEM(根据瘤子大小而定)重悬并混匀，利用淋巴细胞分离液进行分离，其与DMEM体积比为1:1，缓慢滴加分离液于重悬的细胞中，然后2500rpm，离心15min，后小心放置到超净工作台上，用移液枪将中间一层乳白色的晕圈转移至新的离心管中(事先准备好30mL DMEM于管中)，1000rpm，离心5min，最后弃掉上清，收集细胞于10cm培养皿中，用10％的胎牛血清调整状态并扩大培养，通常一只小鼠的瘤子当天可制备3-5皿，第二天离心扩大到30皿，然后冻存30-35管。

准备融合时，按下列步骤进行：

A.第一天复苏；

B.第二天根据融合的数量传代，5皿/1个融合；

C.约两天后观察细胞状态，是否达到对数期，然后收集细胞准备融合；

3)饲养层细胞准备：将健康的Balb/c小鼠在无菌条件下取出其脾脏，并用含20％胎牛血清的HAT培养基制成单个脾细胞悬液，然后根据铺板数量，预先将其铺入到96孔板中。

4)终止液：基础培养基DMEM 20mL预先放入37℃水浴锅中孵育。

(三)、细胞建株

1.融合板检测

待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测(检测方法为ELISA方法)在ELISA质控合格(即阴性对照<0..2，阳性对照>1.0)后挑选阳性孔(一般OD450≥0.5)作亚克隆。

1)检测方法：本效价检测-间接ELSIA

(1)抗原包被：用包被液稀释抗原到2μg/mL，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜。

(2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。

(3)封闭：加l50μL/孔封闭液，室温放置0.5h。

(4)洗涤：用洗涤液洗3次。

(5)加待测样品(一抗)：加入抗血清(取血4℃过夜后4000r/min离心10min得上清)，用样稀将血清按1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800依次进行倍比稀释(空白血清做阴性对照)，每孔100μL，温育1h。

(6)洗涤：用洗涤液洗3次。

(7)加酶标抗抗体：加入HRP标记羊抗鼠IgG(1:5000，酶稀稀释)，100μL/孔，37℃孵育40min。

(8)洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次。

(9)显色：加新鲜配制的底物溶液100μL/孔，室温暗处放置5-30min

(10)终止反应、比色：加50μL/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。

2)细胞融合检测结果

进行半固体和液体融合共10板，一共获得阳性细胞株112株；其中效价值为0.5-2.0区间的有58株；效价值大于2.0的有54株。

2.MRJP3特异性细胞株筛选

经过与重组蛋白和天然蛋白交叉反应检测，去除有交叉反应的细胞株，最终获得14株MRJP3融合细胞株。根据表3和表4的结果可见，MRJP3与其余四种重组蛋白共有四株交叉。

表3 MRJP3特异性细胞株筛选结果

表4 MRJP3特异性细胞株筛选结果

MRJP3与重组蛋白筛完交叉后，剩余24株与天然蛋白MRJP1、MRJP2测交叉，交叉测定结果见表5。

表5交叉测定结果

注：表3-表5中用※标注为有交叉反应结果。

由表5可见，MRJP3与天然蛋白MRJP1、MRJP2有10株交叉，故MRJP3现剩余14株。

3.亚克隆方法及检测

从上述结果中挑出融合板中检测阳性值高的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行ELISA检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。

A.第一次亚克隆检测

表6为第一次亚克隆结果。

表6第一次亚克隆结果

B.第二次亚克隆结果

表7第二次亚克隆结果

MRJP3阳性较多，融合检测后筛选出112株阳性，挑选其中的17株进行一亚，一亚检测后筛选出14株二亚，经过三轮的亚克隆，最终定株杂交瘤细胞株14株，挑选了其中亲和力更高的7株进行后续抗体表位检测和配对实验。

4. 14株细胞株定株及亚型鉴定

将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用ELISA梯度稀释及WB验证其稳定性，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出较高的1-3株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存。

表8

5.细胞株冻存鉴定

在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作ELISA，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western-boltting的鉴定。

6.腹水制备

制备腹水，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中。细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×10⁶-2×10⁶/mL时，800rpm离心，收集沉淀，并用PBS重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。

(四)、抗体表位检测及抗体配对筛选

1.抗原表位配对检测

具体步骤如下：

1)经过亲和力以及样本检测，选择2D2制备抗体，并标记生物素，摸索最佳的稀释比例；

2)包被：用CBS包被对应的抗原，浓度为1μg/mL，100μL/孔，37℃2小时或者4℃过夜；

3)封闭：5％PBS的脱脂奶粉或者2％PBS的BSA封闭，37℃1h或者4℃过夜；

4)一抗：将标记的抗体和检测的抗体均按照方阵摸索的稀释度(1:1000和1:2000)稀释；阴性对照：50μL标记抗体+50μL自身抗体；阳性对照：50μL标记抗体+50μL无关抗体；

5)二抗：羊抗或者兔抗均可，100μL/孔，37℃1h；

6)底物：根据标记的酶选择合适的底物，100μL/孔，10min；

7)显色，终止，读数。

表9抗体表位检测结果

2D2-bio标记	1∶1000	1∶2000
			2D2	0.0890	0.0464
11B7	1.5125	0.9460
			3G4	1.4999	0.9368
4H6	0.5923	0.2020
			4B7	0.3516	0.0923
4H2	1.1726	0.7309
			4H7	0.5943	0.1755
阳性对照	1.9288	1.1237

从表9的抗体表位检测结果可见，与2D2具有不同表位的细胞株分别为11B7/3G4/4H2，下一步进行配对初筛。

2.抗体配对初筛

具体步骤如下：

1.包被：将待测的抗体2μg/mL包被，37℃2h或者4℃过夜；

2.封闭：2％BSA或者5％的脱脂牛奶封闭液200μL/孔，37℃1h或4℃过夜，TBST洗4遍；

3.标品及样本：标准品及样本按照图中备注信息添加到96孔中，50μL/孔，37℃2h；

4.二抗：生物素标记的抗体按照推荐的稀释比例加入96孔中，90μL/孔，37℃1h；

5.二二抗：HRP-avidin，目前使用浓度1∶4000，90μL/孔，37℃1h；

6.底物：90μL/孔，37℃放置5-15min；

7.终止反应、比色：加30μL/孔终止液，颜色变黄；用酶标仪测定450nm的吸光值。

表10配对筛选结果

根据表10的配对筛选结果可见，就灵敏度而言，11B7和3G4更高，下一步直接测样，再次检测。

3.抗体配对测样及配对标准曲线摸索

1)配对测样方法

参考上面步骤2中的配对测样方法。

表11配对测样结果

根据表11的配对测样结果可见，三对配对测样均可，只是11B7和3G4作为包抗，结果更优，下一步进行试剂盒研发阶段，首先定标曲线。

2)标曲摸索

具体步骤如下：

1.包被：将待测的抗体按照图中标注的1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL分别包被，37℃2h或者4℃过夜；

3.重组蛋白为标准品：标准品设置S7和S0添加到96孔中，50μL/孔，37℃2h；

5.二二抗：HRP-avidin，目前使用浓度1：4000，90μL/孔，37℃1h；

6.底物：90μL/孔，37℃放置5-15min；

表12第一次标准曲线摸索

表13第二次标准曲线摸索

根据表12的第一次标曲摸索发现两组配对均可，且灵敏度较高，从测值来看，最高点以及检抗浓度都可以再下调一些；进行第二次调整后测定，认为两组配对均可，但3G4在同等条件下，灵敏度较高，确认标曲的最高点，再次绘制标准曲线。

3)标曲绘制及样本测定

表14第三次标准曲线摸索

表15 MRJP3测样本

从配对标曲的各项参数来看，3G4和11B7均与2D2有较好的线性关系，但是3G4灵敏度相对更高，故选择3G4和2D2进行下一步的ELISA试剂盒研发。

细胞株特异性检测

细胞株3G4以及2D2特异性验证结果见图3和图4。从验证结果可见，3G4和2D2均不与MRJP1，MRJP2，MRJP4和MRJP5发生反应。

(五)、抗体纯化

表16抗体纯化步骤

实施例2双抗体夹心ELISA法的酶联免疫试剂盒的制备

1.实验原理

用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗MRJP3抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗MRJP3抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样本中的MRJP3呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样本浓度。

1.标准曲线图及标准曲线线性范围

1)标准曲线设置

标准曲线的设置原则以样本检出浓度为基准，即此曲线需包含各样本的检出浓度范围。固定标准品的浓度，选取不同的包检、检抗及二抗的浓度进行棋盘滴定实验，以此选取各个参数合适的浓度条件。

2)具体操作步骤

A.加入标准品或含待测抗原的样本，100μL/孔，37℃温育2h；

B.甩掉板内液体，拍干，加入生物素标记的抗体100μL/孔；37℃温育1h；

C.洗板3次；

D.加入辣根过氧化物酶标记的亲和素(a HRP-avidin)100μL/孔，37℃温育1h；

E.洗板5次；

F.洗板后每孔加入TMB 90μL，盖上覆膜，放入37℃恒温箱温育显色15～20min；

G.显色完成后，每孔依次加入50μL终止液，终止后尽快读数。

3)标准曲线调整

适当调整包抗、检抗及HRP的浓度来优化标准曲线，确保标曲R2≥0.99视为合格。

3.样品的检测及评价方法的建立

1)样本前处理

A.根据样本类型提前处理样本；

B.测试中均设置复孔；

C.对于个别含量较高的项目，需要稀释后梯度测试样本。

4.ELISA方法的考核评估

1)稳定性

A.稳定性测试

含4天及7天的稳定性，测试方法如下：分别将包被板(已包被抗体)、标准品(冻干粉)、中间浓度检抗各2套放置于37℃培养箱，于4天后取出一套，7天后取出一套；7天后将放热破的2套原料与4℃放置的原料一起做标曲的比较，计算OD值的下降率。

B.评判标准

37℃培养箱热破7天后，下降率≤30％即视为稳定性合格。

2)批内批间差

A.批内变异系数：要求≤8％，方法：测试高、中、低浓度各24份，用其标准差/平均值×100％，即为其变异系数值。

B.批间变异系数：要求≤10％，方法：测试高、中、低浓度各24份，用其标准差/平均值×100％，即为其变异系数值。

3)最低检测限

一般满足在标曲最低端浓度的二分之一。公式：20份空白样品测定均值加上2倍标准差。

5.ELISA法定量测定样本中MRJP3含量

1)产品性能指标

1.检测范围：0.78ng/mL-50ng/mL。

2.灵敏度：194pg/mL。

3.精密度：批内差CV％<8％，批间差CV％<10％。

4.特异性：本试剂盒特异性检测MRJP3，且与其他相关蛋白无交叉反应(见图3和图4，3G4和2D2抗体均不与MRJP1，MRJP2，MRJP4和MRJP5发生反应，王浆主蛋白家族有蛋白1-9，其中1-5含量最高，占王浆主蛋白含量的82％～90％)。

5.稳定性结果：稳定性测试合格。

6.热破坏稳定性测试

测定结果：样本测试及下降率：样本(-80℃保存)浓度测值为1260ng/mL；4℃/-20℃/室温破坏后样本下降率较接近，下降率在30～50％之间。

2)试剂盒组成成分

表17试剂盒组成成分

4)样本采集及保存

1.血清：全血标本请于室温放置2h或4℃过夜后于2℃-8℃1000×g离心15min，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融；解冻后的样品应再次离心，然后检测。

2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30min内于2℃-8℃1000×g离心15min，取上清即可立即检测或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融；解冻后的样品应再次离心，然后检测。

3.细胞培养物上清：标本于2-8℃1000×g离心15min取上清，上清立即用于实验或分装后于-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

4.尿液：用无菌管收集尿液于2℃-8℃，1000×g离心15min取上清，上清立即用于实验或分装后于-20℃或-80℃保存；避免反复冻融。试验前再次离心，以去除在样本保存期间可能出现的一些沉淀。

5.组织裂解液：取100mg组织，用1×PBS洗去血污。剪成小块放入组织研磨器(匀浆管)中，加入1mL 1×PBS，制成匀浆，然后置于-20℃过夜。经过反复冻融2次处理破坏细胞膜后，将组织匀浆于2-8℃5000×g离心5min取上清。取适量上清液立即进行实验，或将上清分装保存于-20℃或-80℃。解冻后的样品应再次离心，然后检测；避免反复冻融。

6.蜂王浆原液处理办法：样本加入3倍体积PBS稀释，充分震荡后，超声20次，于10,000×g离心15min，取上清。因样本粘稠度较高，推荐1:200倍稀释，混匀后立即用于实验或分装后于-20℃或-80℃保存。避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

6)试剂配制

【标准品】

(1)从试剂盒中取出一支标准品，于6000-10000rpm离心30s。用1mL样本稀释液溶解，并用枪头对准冻存管底部反复吸打5次以助溶解，充分混匀得到标准品S7，放置备用。

(2)取7个1.5mL离心管(S0-S6)依次排列，各加入250μL样本稀释液，吸取250μL标准品S7到第一个离心管中(S6)，轻轻吹打混匀。从S6中吸取250μL到第二个EP管中(S5)，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释，S0为样本稀释液。

表18标准品浓度

编号	S7	S6	S5	S4	S3	S2	S1	S0
									ng/mL	50	25	12.5	6.25	3.13	1.56	0.78	0

洗液工作液

浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取240mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。

生物素标记抗体工作液

生物素标记抗体液按1:100倍用生物素标记抗体稀释液进行稀释。如10μL生物素标记抗体加990μL生物素标记抗体稀释液，轻轻混匀，在临用前10分钟内配妥。

辣根过氧化物酶标记亲和素工作液

辣根过氧化物酶标记亲和素按1:100倍用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液进行稀释。如10μL辣根过氧化物酶标记亲和素加990μL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，轻轻混匀，在临用前10min内配妥。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院蜜蜂研究所

<120> 抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体及检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒

<130> BJ-2009-170112A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 300

<212> PRT

<213> artifical sequence

<400> 1

Val Ala Gly Glu Ser Phe Thr Val Lys Asn Gly Ile Tyr Gly Ile Ala

1 5 10 15

Leu Ser Pro Val Thr Asn Asn Leu Tyr Tyr Ser Pro Leu Leu Ser His

20 25 30

Gly Leu Tyr Tyr Val Asp Thr Glu Gln Phe Ser Asn Pro Gln Tyr Glu

35 40 45

Glu Asn Asn Val Gln Tyr Glu Gly Ser Gln Asp Ile Leu Asn Thr Gln

50 55 60

Ser Phe Gly Lys Val Val Ser Lys Asn Gly Val Leu Phe Leu Gly Leu

65 70 75 80

Val Gly Asn Ser Gly Ile Ala Cys Val Asn Glu His Gln Val Leu Gln

85 90 95

Arg Glu Ser Phe Asp Val Val Ala Gln Asn Glu Glu Thr Leu Gln Met

100 105 110

Ile Val Ser Met Lys Ile Met Glu Asn Leu Pro Gln Ser Gly Arg Ile

115 120 125

Asn Asp Pro Glu Gly Asn Glu Tyr Met Leu Ala Leu Ser Asn Arg Met

130 135 140

Gln Lys Ile Ile Asn Asn Asp Phe Asn Phe Asn Asp Val Asn Phe Arg

145 150 155 160

Ile Leu Gly Ala Asn Val Asp Asp Leu Met Arg Asn Thr Arg Cys Gly

165 170 175

Arg Tyr His Asn Gln Asn Ala Gly Asn Gln Asn Ala Asp Asn Gln Asn

180 185 190

Ala Asp Asn Gln Asn Ala Asn Asn Gln Asn Ala Asp Asn Gln Asn Ala

195 200 205

Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Arg Gln Asn Asp Asn

210 215 220

Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg

225 230 235 240

Gln Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Gly Asn Lys Gln

245 250 255

Asn Asp Asn Lys Gln Asn Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Lys Arg Asn

260 265 270

Gly Asn Arg Gln Asn Asp Asn Gln Asn Asn Gln Asn Asp Asn Asn Arg

275 280 285

Asn Asp Asn Gln Val His His Ser Ser Lys Leu His

290 295 300

Claims

1.一株稳定分泌抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2D2，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13847。

2.由权利要求1 所述杂交瘤细胞株2D2分泌的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体。

3.一株稳定分泌抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3G4，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13848。

4.由权利要求3所述杂交瘤细胞株3G4分泌的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体。

5.权利要求2或4所述的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体在检测蜂王浆主蛋白3或蜂王浆主蛋白3含量中的用途。

6.一种双抗体夹心ELISA法检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒，包括：抗蜂王浆主蛋白3的一抗，生物素标记的抗蜂王浆主蛋白3的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其特征在于：所述的一抗是权利要求2所述的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体，所述的二抗是权利要求4所述的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体。

7.一种双抗体夹心ELISA法检测蜂王浆主蛋白3的酶联免疫试剂盒，包括：抗蜂王浆主蛋白3的一抗，生物素标记的抗蜂王浆主蛋白3的二抗，标准品，辣根过氧化物酶标记亲和素，生物素标记抗体稀释液，辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液，样本稀释液，浓洗涤液，底物溶液和终止液；其特征在于：所述的一抗是权利要求4所述的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体，所述的二抗是权利要求2所述的抗蜂王浆主蛋白3的单克隆抗体。

8.权利要求6所述的酶联免疫试剂盒在检测样品中蜂王浆主蛋白3含量中的应用。

9.权利要求7所述的酶联免疫试剂盒在检测样品中蜂王浆主蛋白3含量中的应用。