CN112794915A - 抗猪IgG单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗猪IgG单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗猪IgG单克隆抗体，包括SEQ ID NO：1和／或SEQ ID NO：2。所述单克隆抗体在抗体效价、交叉反应性和特异性等方面均有上佳表现，适合作为猪免疫诊断和抗体检测试剂。

Description

抗猪IgG单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物领域，涉及抗猪IgG单克隆抗体，以及分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及所述单克隆抗体的应用。
背景技术
IgG是动物血清中浓度最高的一类免疫球蛋白，约占免疫球蛋白含量的70％-80％，在抗体介导的反应中起主要作用，同时血清中特异性IgG水平也是临床免疫检验和体液免疫研究的常用指标，因此免疫学检测是疾病诊断和抗体检测最基本的方法。研制和开发的猪病免疫诊断和抗体检测试剂中(ELISA、WB、免疫荧光法、胶体金试纸等)，第二抗体是最重要的材料，第二抗体质量的好坏直接影响检测方法的敏感性、特异性和稳定性。
目前，市面上供应的用于猪病检测试剂中的抗猪IgG重链、轻链抗体基本是多克隆抗体，多克隆抗体能够在一定程度上检验猪病，但由于多克隆抗体血清成分复杂，批间抗体质量和酶标效率差异很大，难以实现标准化生产。单克隆抗体具有纯度高、专一性强、效价好等优点，可以克服多克隆抗体的缺陷。市面上的单克隆抗体多通过猪IgG蛋白作为抗原免疫获得，但由于猪与人、鼠等物种的IgG Fc片段的同源性较高，此类单克隆抗体的特异性不强，易与其它物种IgG发生交叉反应。因此，研制出抗猪免疫球蛋白重链、轻链的单克隆抗体作为模式猪的开发及猪病免疫诊断检测工具具有广泛应用。
发明内容
本发明目的是提供一种抗猪IgG单克隆抗体。所述抗体在抗体效价、交叉反应性和特异性等方面均有上佳表现，适合作为猪病免疫诊断和抗体检测试剂。
一种抗猪IgG单克隆抗体，包括SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2。所述SEQ ID NO：1为IgG重链抗体，SEQ ID NO：2为Igκ轻链抗体。所述单克隆抗体能够与猪IgG重链、轻链特异性结合，而不与人IgG、狗IgG、兔IgG、羊IgG、牛IgG和马IgG结合。
本发明第二目的在于提供了上述单克隆抗体的应用。
上述单克隆抗体在制备猪病免疫诊断和/或抗体检测试剂中的应用。
优选的，所述抗体检测试剂是指抗体检测试剂中的第二抗体。
本发明第三目的在于提供了上述抗体的杂交瘤细胞株。
一种杂交瘤细胞株，分泌上述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
本发明另一目的在于提供了上述杂交瘤细胞株的制备方法。
上述单克隆抗体的制备方法，包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2作为抗原免疫Balb/c小鼠，利用杂交瘤电融合、半固体筛选，从得到的众多克隆中筛选到能稳定分泌抗猪IgG重链、轻链单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中，分泌抗猪IgG重链单克隆抗体(SEQ ID NO：1)的杂交瘤细胞株记作5-H8-1，分泌抗猪IgG轻链单克隆抗体(SEQ ID NO：2)的杂交瘤细胞株记作13-B2-1D3。
有益效果
首先，本发明提供的单克隆抗体，能够分别与猪IgG重链、轻链结合，具有较高的效价；其次，本发明的单克隆抗体与人IgG、狗IgG、兔IgG、羊IgG、牛IgG和马IgG无交叉反应，具有很好的特异性结合能力；最后，在蛋白质免疫印迹实验中表明本发明的单克隆抗体可用抗体检测试剂中的第二抗体。也就是说，本发明的单克隆抗体在抗体效价和交叉反应性方面展现出了很好的性能，从而本发明提供了能够用于猪病免疫诊断和抗体检测试剂的抗猪IgG重链、轻链的单克隆抗体。
附图说明
图1示出了本发明真核表达纯化后的抗猪轻链单克隆抗体SDS-PAGE电泳图
图2示出了本发明真核表达纯化后的抗猪轻链单克隆抗体WB结果示意图
图3示出了本发明真核表达纯化后的抗猪轻链单克隆抗体与各物种IgG交叉反应情况ELISA结果示意图
图4示出了本发明真核表达纯化后的抗猪轻链单克隆抗体与各物种IgG交叉反应情况SDS-PAGE及WB结果示意图
具体实施方法
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术人员的一本理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
下面将结合实施例对本发明的实施方式进行详细描述，实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，为可以通过商购获得的常规产品。
实施例
1.小鼠的免疫
将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2用作抗原免疫，将以上两氨基酸序列合成KLH偶联多肽片段(南京金斯瑞生物科技公司)。
用1×PBS将以上抗原稀释到1.0mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂(Signa公司，货号F5506)混合(50μg/只BALB/c小鼠)，用注射器乳化后以200μL/只的剂量施给BALB/c小鼠(重庆市畜牧科学院实验动物中心，6周龄雌性)。以后每隔一周进行免疫，免疫4次后，采眼眶血，分离血清，用间接ELISA法测定效价。所有小鼠血清效价大于1:104，即可用于融合。融合前4天，取未偶联的裸肽用1×PBS稀释1.0mg/mL，再与1×PBS等体积混合(50μg/只BALB/c小鼠)腹腔追加免疫，剂量为100μL/只。
2.杂交瘤细胞系的制备
2-1骨髓瘤细胞的制备
融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功地得到杂交瘤细胞是至关重要的，冻存的细胞在复苏后要5天左右时间处于适合于融合的状态。在培养过程中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10％小牛血清的培养基中，接种在大皿中生长，待细胞长满至皿底70％左右传代。融合当天，用1mL移液枪将细胞从皿底轻轻吹下，收集于50mL离心管内1000r/min离心3分钟，弃去上清。加入10mLPBS同法离心洗涤一次后将细胞重悬浮于10mlPBS中混匀。细胞计数时，取细胞悬液10μL加入等体积0.4％胎酚蓝中，混匀，用细胞计数仪计数。
2-2免疫脾细胞的制备
取实施例1中免疫血清效价达到1:104的BALB/c小鼠摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，转入75％酒精浸泡5分钟，在超净台内，于无菌的平皿上掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换剪镊，用无菌剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有10ml RPMI1640培养液的平皿中，轻轻洗涤。将脾脏移入另一盛有RPMI1640培养液的平皿中，用弯头镊子或装在1mL注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏)，使脾细胞进入平皿中的RPMI1640培养液。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。收获脾细胞悬液，1000r/min离心5-10分钟，用RPMI1640培养液离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10m1RPMI1640培养液混匀。取细胞悬液10μL加入等体积0.4％胎酚蓝中，混匀，用细胞计数仪计数。
2-3细胞融合及杂交瘤细胞株的选择性培养
将脾细胞与骨髓瘤细胞混合于50mL离心管中，用RPMI1640不完全培养基洗涤细胞，1200r/min离心3min，去上清。将细胞沉淀用融合液重悬加入融合槽内，设定融合参数开始进行细胞融合。融合后静置数分钟，用1640完全培养基洗涤1次，再加入1640完全培养基重悬细胞，37℃，5％CO2培养16-18h。将融合细胞与半固体培养基混匀，平铺于平板中，37℃，5％CO2培养。当克隆生长至肉眼可见白色小点时，准备96孔板每孔预先加入200μL培养基，用10μL枪头挑单个克隆至96孔板，混匀培养。
2-4阳性杂交瘤细胞株的筛选
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释猪IgG至1μg/mL，96孔酶标板中每孔包被50μL，用于检测融合后细胞培养上清。放置于2-8℃冰箱中过夜，第二天弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干。用含2％小牛血清的0.01M pH7.2的PBS，200μL/孔，37℃封闭1h，弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，取细胞上清50μL于孔中，37℃孵育2h，ELISA洗液洗板三次后加入2000倍稀释的anti-mouse IgK-HRP(abcam，a99617)50μL/孔，37℃孵育90min，同上洗板后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15min，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，多功能读数仪检测450nm吸收值。以融合时小鼠血清稀释至100倍为阳性对照，RPMI1640完全培养液作为阴性对照，阴性对照OD值<0.2，阳性对照0D值>1.0为检测系统有效，样本0D值≥2X阴性对照OD值时，为阳性，反之为阴性。
3.杂交瘤上清抗体交叉反应检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释猪IgG、人IgG、狗IgG、兔IgG、羊IgG、牛IgG和马IgG至1μg/mL，96孔酶标板中每孔包被50μL，用于检测融合后细胞培养上清。放置于2-8℃冰箱中过夜，第二天弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干。用含2％小牛血清的0.01MpH7.2的PBS，200μL/孔，37℃封闭1h，弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，取5-H8-1、13-B2-1D3细胞株上清液50μL于孔中，37℃孵育2h，ELISA洗液洗板三次后加入2000倍稀释的anti-mouse IgK-HRP(abcam，a99617)50μL/孔，37℃孵育90min，同上洗板后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15min，每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，多功能读数仪检测450nm吸收值。
表1杂交瘤上清交叉反应检测
Figure BDA0002888039030000051
4.阳性细胞的克隆化
制备阳性杂交瘤细胞悬液，用含20％血清的HT培养基稀释至每毫升含1个细胞的稀释度，筛选阳性孔同同实施例4方法连续克隆4次及以上，直至达到100％单克隆。将单克隆孔传至新的24孔板，保留上清用于ELISA检测。
5.单克隆抗体可变区测序
培养单克隆化的杂交瘤细胞，待细胞长满96孔板后，弃上清，加入1mL Trizol试剂轻轻吹打为细胞悬浊液后，送至生物公司测取杂交瘤细胞表达单克隆抗体重链、轻链序列(江苏鸿讯生物公司)。
6.HEK293F细胞表达单克隆抗体
6-1质粒准备
测序合成的质粒载体通过试剂盒(北京全式金生物，EM101-02)提取，具体操作步骤参考说明书，提取的质粒用0.22μm滤膜过滤除菌备用。
6-2HEK293F悬浮细胞瞬时转染
转染前一天，取对数生长期的HEK293F细胞按0.8×106cells/mL密度进行传代。转染当天(距离前一天传代约24h)，对带转染的细胞进行计数并观察细胞活率，当细胞密度达到1.5×106cells/mL左右，并且细胞活率大于90％。准备2个无菌离心管，各加入200μLHEK293F基础培养基，分别加入20μg DNA和60μL NanogenTrans转染试剂，混匀室温孵育5min。将NanogenTrans转染试剂稀释液快速加入DNA稀释液中，用移液枪轻轻混匀，室温孵育15-20min。从培养箱中取出细胞至超净台中，将DNA与转染试剂混合液快速加入细胞悬液，摇匀。将125mL摇瓶置于二氧化碳培养箱中培养(37℃、5％二氧化碳浓度，振幅25cm，140r/min)。首次转染目的质粒需每日监测细胞活率，并取500μL细胞悬液，10000r/min离心5min，收集上清保存于-20℃用于检测蛋白表达情况。培养24h后可检测转染效率，分别在转染48h、96h、144h后加入HEK293F补料培养基1mL(初始转染体积的5％)。待细胞活率降至60％左右时，5000r/min，离心20min，收取细胞上清液。
7单克隆抗体的纯化
将收取的HEK293F细胞上清液12000r/min离心20min，去除沉淀，上清用MabLoadingBuffer稀释5-10倍，再用0.22μm滤膜过滤。将上述滤后液上样5mL-mabselectsure介质，使用AKTA纯化仪，收集穿透。上样完成后用平衡液平衡层析柱至基线平稳，使用洗脱液洗脱目的蛋白，收集大于100mAu的洗脱峰，洗脱完成后层析柱用0.1M氢氧化钠进行清洗，然后保存层析柱。对洗脱的目的蛋白进行中和，每mL洗脱液滴加0.1mL中和液。混匀中和后，将蛋白置于5L透析液中透析，每两个小时换一次液，换液3次。将透析好的目的蛋白12000r/min离心20min，上清即为最终成品。
8单克隆抗体的检测
8-1单克隆抗体的纯度检测
使用Nanodrop2000测定纯化后抗体的浓度，吸取10μg样品，加入NuPAGETM LDSSample Buffer(4X)10μl、还原剂NuPAGETM Sample Reducing Agent(10X)4μL。然后将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，12000r/min离心5min待用。向胶孔内依此加入样品、Mark，同时上样杂交瘤培养液做对照。调整电压至120V，电泳1.5h左右至loading线到达胶板底部，切胶染色。染色方法采用考马斯亮蓝染色，染色后用Odyssey扫描系统扫描，并用分析系统分析目标带的分子量，如图1所示，样品有的两条带分别为抗体的重链、轻链，可见纯化后样品纯度较高。
8-2单克隆抗体的验证
将电泳后的胶板取出进行转膜。应用invitrogen设备转膜，转膜条件为30V，70min。将膜取出后PBST稍加漂洗，用镊子移至5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床室温摇动封闭1-2h。用封闭液将二抗Alexa Fluor 680donkey anti-mouse IgG(Invitrogen,2115681)稀释10000倍，将膜加入其中，室温下孵育1h。在摇床上室温洗三次，每次5min，再用TBS洗5min。将膜用Odyssey扫描系统扫描，并用分析系统分析目标带的分子量，如图2所示，纯化所得样品即为目的蛋白。
9单克隆抗体交叉反应检测
9-1单克隆抗体交叉反应的EILISA检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释猪IgG、人IgG、狗IgG、兔IgG、羊IgG、牛IgG和马IgG至1μg/mL，96孔酶标板中每孔包被50μL，用于检测融合后细胞培养上清。放置于2-8℃冰箱中过夜，第二天弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干。用含2％小牛血清的0.01MpH7.2的PBS，200μL/孔，37℃封闭1h，弃去孔中液体，ELISA洗液洗板三次，拍干，取纯化所得抗体50μL于孔中，37℃孵育2h，ELISA洗液洗板三次后加入2000倍稀释的anti-mouse IgK-HRP(abcam，a99617)50μL/孔，37℃孵育90min，同上洗板后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃孵育15min,每孔加入50μL 2M硫酸溶液终止反应，多功能读数仪检测450nm吸收值，如图3所示，该单克隆抗体与其它物种无交叉反应，特异性较高。
9-2单克隆抗体交叉反应的WB检测
将猪IgG、人IgG、狗IgG、兔IgG、羊IgG、牛IgG和马IgG用PBS分别稀释至1mg/mL，将以上样品各取10μL加入NuPAGETM LDS Sample Buffer(4X)10μL、还原剂NuPAGETM SampleReducing Agent(10X)4μL。然后将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，12000r/min离心5min待用。准备两块胶，一块用于考马斯亮蓝染色，一块用于WB转膜。向胶孔内依此加入以上样品、Mark，保证两块胶加样情况相同。调整电压至120V，电泳1.5h左右至loading线到达胶板底部，切胶染色。染色方法采用考马斯亮蓝染色，染色后用Odyssey扫描系统扫描，并用分析系统分析目标带的分子量。将第二块胶板取出应用invitrogen设备转膜，转膜条件为30V，70min。将膜取出后PBST稍加漂洗，用镊子移至5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床室温摇动封闭1-2h。用封闭液将纯化所得单克隆抗体稀释至1μg/ml，从封闭液中取出膜，去残留液后，置于其中，4℃过夜孵育。第二天用PBST在室温下摇床上洗三次，每次5min。同上方法用封闭液将二抗Alexa Fluor 680donkey anti-mouse IgG(Invitrogen，2115681)稀释10000倍后，将膜加入其中，室温下孵育1h。在摇床上室温洗三次，每次5min，再用TBS洗5min。将膜用Odyssey扫描系统扫描，并用分析系统分析目标带的分子量，如图4所示，该单克隆抗体仅与猪IgG轻链结合。
SEQUENCE LISTING
<110> 重庆市畜牧科学院
<120> 抗猪IgG单克隆抗体及其应用
<160>
<210> 1
<211> 26
<212> 猪IgG重链抗体
<213> protein
<400> 1
TRPKEEQFNS TYRVVSVLPI QHQDWL 26
<210> 2
<211> 28
<212> 猪Igκ轻链抗体
<213> Protein
<400> 2
LSSTLSLPTS QYLSHNLYSC EVTHKLAS 28

Claims (5)

1.一种抗猪IgG单克隆抗体，包括SEQ ID NO：1和／或SEQ ID NO：2。
2.如权利要求1所述单克隆抗体在制备猪免疫诊断和/或抗体检测试剂中的应用。
3.如权利要求2所述应用，所述抗体检测试剂是抗体检测试剂中的第二抗体。
4.一种杂交瘤细胞株，分泌SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
5.如权利要求1所述单克隆抗体的制备方法，包括：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2作为抗原免疫Balb/c小鼠，电融合、半固体筛选，筛选杂交瘤细胞株。
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