CN109957005B - 一种代谢素多肽人工抗原及其制备方法、抗体以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及一种代谢素多肽人工抗原及其制备方法、抗体以及应用。一种代谢素多肽人工抗原的制备方法，包括以下步骤：如SEQ ID NO：1所示的代谢素多肽溶解，得到代谢素多肽浓度为6‑9mg/ml的多肽溶液；活化的载体蛋白溶解，得到所述活化的载体蛋白浓度为4‑6mg/ml的载体蛋白溶液；所述多肽溶液与所述载体蛋白溶液以体积比为1:2‑3混合，偶联；所述偶联的产物经分离纯化得到所述代谢素多肽人工抗原。本发明提供的代谢素多肽人工抗原的制备方法，简便易行，并且经该方法偶联效率高。
Description
技术领域
本发明涉及抗体领域，具体而言，涉及一种代谢素多肽人工抗原及其制备方法、抗体以及应用。
背景技术
代谢素是小鼠骨钙素蛋白质分子中的一段保守序列，经过序列分析此段多肽具有抗原性。骨钙素又称骨γ-羧谷氨酸包含蛋白(bone gamma-carboxyglutamic-acid-containing proteins,BGP)。该蛋白在骨矿化峰期之后才出现积聚。使用维生素K拮抗剂，可使此蛋白在骨中的含量减少，但并不影响其脯氨酸的含量，也不影响骨的机械强度。骨钙素是由成骨细胞分泌的，其含量随着年龄的变化而不同，通过血清骨钙素的含量可以了解成骨细胞的状态，对于骨质疏松的判定等具有重要的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种代谢素多肽人工抗原的制备方法，该方法制备简便，偶联效率高，在90％以上。
本发明的第二目的在于提供一种代谢素多肽人工抗原，该代谢素多肽含有半胱氨酸，经试验得到，该多肽与大分子蛋白质KLH偶联形成具有免疫原性的完全抗原，能够激发小鼠体内的免疫系统产生抗代谢素单克隆抗体。
本发明的第三目的在于提供上述的抗原制得的抗体，该抗体能够用于检测小鼠血清中的代谢素相关的多肽分子。
本发明的第四目的在于提供含有上述的抗体的试剂盒，为代谢素相关的多肽分子的检测提供便利。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种代谢素多肽人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
如SEQ ID NO：1所示的代谢素多肽溶解，得到代谢素多肽浓度为6-9mg/ml的多肽溶液；
活化的载体蛋白溶解，得到所述活化的载体蛋白浓度为4-6mg/ml的载体蛋白溶液；
所述多肽溶液与所述载体蛋白溶液以体积比为1:2-3混合，偶联；
所述偶联的产物经分离纯化得到所述代谢素多肽人工抗原。
本发明提供的代谢素多肽人工抗原的制备方法，简便易行，并且经该方法偶联效率高，在90％以上。
进一步地，所述活化的载体蛋白为马来酰亚胺活化的匙空血蓝蛋白。
进一步地，所述代谢素多肽溶解的溶剂为20±1mM磷酸钠缓冲液，其中还含有230±5mM NaCl，2±0.2mM EDTA，80±2mM蔗糖，pH6.5-6.7。
进一步地，所述活化的载体蛋白溶解的溶剂为20±1mM磷酸钠缓冲液，其中还含有100±5mM EDTA，80±2mM蔗糖，pH 6.5-6.7。
进一步地，进一步地，偶联条件为在搅拌下于室温持续2小时或者2-8℃过夜。
本发明还提供了上述的制备方法制得的代谢素多肽人工抗原。
其中的代谢素多肽含有半胱氨酸，制得的该人工抗原为完全抗原，经试验得到，该多肽与大分子蛋白质KLH偶联形成具有免疫原性的完全抗原，能够激发小鼠体内的免疫系统产生抗代谢素单克隆抗体。
本发明还提供了上述的代谢素多肽人工抗原制得的抗体。
进一步地，所述抗体为单克隆抗体。
进一步地，所述单克隆抗体的亚型为G2b。
进一步地，所述单克隆抗体与SEQ ID NO：2所示的多肽特异结合。
本发明制得的单克隆抗体不仅能够与SEQ ID NO：1所述的多肽具有优异的识别特异性，并且还可以与SEQ ID NO：2所示的多肽特异结合。
进一步地，所述单克隆抗体的效价为1:8000。
本发明还提供了所述的抗体在检测血清或组织中存在的代谢素多肽片段中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的一种代谢素多肽人工抗原的制备方法，该方法制备简便，偶联效率高，在90％以上。
(2)本发明还提供一种代谢素多肽人工抗原，该多肽含有半胱氨酸，该多肽与大分子蛋白质KLH偶联形成具有免疫原性的完全抗原，能够激发小鼠体内的免疫系统产生抗代谢素单克隆抗体。
(3)本发明提供的单克隆抗体，能够用于检测小鼠血清中的代谢素相关的多肽分子，特异性和灵敏度佳。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中马来酰亚胺活化的KLH结构示意图；
图2为本发明实施例3中编号为24单克隆抗体的效价结果线性图；
图3为本发明实施例4中单克隆抗体(24#)与代谢素多肽识别特异性的结果图；
图4为本发明实施例5中单克隆抗体(24#)与OCN多肽识别特异性的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
为了更好的理解本发明，特将单克隆抗体的制备过程加以表述，如无特殊说明，均为常规方法。实施案例中所用试剂材料如无特殊说明，均为常规生化试剂。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的磷酸盐缓冲液均为pH 7.4、0.01M的PBS缓冲液。实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH 9.6、0.05M的碳酸钠缓冲液。牛血清白蛋白简称BSA，匙空血蓝蛋白简称为KLH。
实施例1
A、马来酰亚胺活化KLH与多肽偶联
1.打开一管马来酰亚胺活化的KLH(如图1所示)加入1ml 20mM磷酸钠缓冲液(230mM NaCl，2mM EDTA，80mM蔗糖，pH 6.6)，该过程是将马来酰亚胺活化的KLH进行重构，得到5mg/ml的溶液，现用现配；
2.制备20mM磷酸钠缓冲液(100mM EDTA，80mM蔗糖，pH 6.6)，作为偶联缓冲液；
3.将4mg多肽溶解在0.5ml偶联缓冲液，得到多肽溶液，留取50μl多肽溶液用于确定偶联效率(总cys)，保存至2-8℃。
4.立即将0.5ml多肽溶液和1ml马来酰胺活化的KLH溶液在反应管内混合，搅拌，室温(15-25℃)持续2小时或者2-8℃过夜(8-15小时)，得到偶联KLH后的多肽，以后命名为NH2-KLH；
5.保留100μl偶联反应液用于确定偶联效率(游离cys)。
B、KLH偶联物的分离
1.在1L PBS中，加入0.01％叠氮钠，长期保存；
2.将Sephadex G-25M凝胶柱固定在适宜的烧杯上；
3.取下凝胶柱的盖子，剪开凝胶柱的底端，让过量的液体流出，禁止柱内液体流干；
4.用30ml PBS平衡凝胶柱，如果不立即使用凝胶柱请盖好上下的盖子后，保存至2-8℃；
5.向凝胶柱加入反应后的液体，收集下端流出液体；
6.用总体积10ml PBS洗涤，收集洗出液，每一次收集0.5ml-1.0ml，在280nm下测量吸光度值；
7.收集含蛋白洗脱液，-20℃冻存。
C半胱氨酸标准曲线
1.DTNB分析溶液(0.1mM)：由1体积10mMDTNB标准液加99体积0.25M的Tris缓冲液配制而成，现用现配；
2.将32mg L-半胱氨酸盐酸盐一水物溶解于1ml双蒸水中，梯度稀释范围0.4-0.04mg/ml；
3.在测试管中加入预稀释的半胱氨酸标准液50μl，空白管加入50μl双蒸水；
4.所有管内加入0.1ml双蒸水，0.75ml pH8.0DTNB缓冲液，立即加入0.1ml DTNB试剂溶液，使总体积为1ml，混匀；
5.在412nm处测定吸光度值，制作标准曲线，重复三次。
D偶联效率的测定
1.将50μl多肽溶液(总cys)加入0.1ml双蒸水中；
2.将下列50μl溶液加入测试管中：DTNB缓冲液(空白)、稀释的多肽样品(总cys，KLH结合)、多肽-KLH(游离cys,KLH结合)、稀释的多肽样品(总cys,BSA结合)、多肽-BSA(游离cys,BSA结合)；
3.向所有试管内加入0.1ml双蒸水，0.75ml pH8.0的DTNB缓冲液，立即加入0.1mlDTNB试剂溶液，终体积为1ml，混匀；
4.在412nm处测量吸光度值，如果吸光度值大于1.4，稀释样品重复测试；
5.计算公式：偶联效率(％)＝(总cys-游离cys)/总cys╳100％
得到的偶联效率均为90％以上。
实施例2
多肽代谢素单克隆抗体的制备
BALB/c雌性小鼠购于广东省实验动物中心。
A动物免疫
将实施例1中制备的NH2-KLH免疫原用于BALB/c雌性小鼠的免疫，初次免疫按60μg蛋白/只小鼠的量，皮下免疫4只SPF Balb/c雌性小鼠，编号为1-4，每隔2周加强免疫一次，具体如下：
皮下第一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；
皮下第二次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；
皮下第三次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；
皮下第四次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只。
各个小鼠眼眶取血，测血清效价。
免疫效价检测：
步骤：用“NH2-BSA”，2μg/ml，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。效价为大于最大OD/2的最小OD读数所对应的稀释度。
效价结果如表1所示。
表1效价结果
从测定数据可以看出，编号4的小鼠效价优，因此，选取冲击4#小鼠做细胞融合实验。
B细胞融合实验
取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
1.实验器材
灭菌的手术器械：三把剪刀、三把镊子、一个细胞筛、一个注射器的内芯、一个平皿。湿盒，2个500ml烧杯，2个50ml离心管，3个15ml离心管。
2.实验试剂
IMDM培养基；IMDM完全培养基(含15％血清)；2.2％甲基纤维素，厂家SIGMA，货号：M0262-100G；新生牛血清：10ml；PEG1500，厂家Roche，货号：78364；HAT：厂家Sigma，货号：H0262-10VL。
3.融合实验步骤
a)将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。
b)用NH2-KLH免疫原50μg，腹腔冲击#4小鼠，断颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。
c)在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500r/min，5min。
d)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞放到15ml离心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中备用。
e)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心，1500r/min，5min。
f)将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000r/min，5min。
g)倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。
C挑克隆
挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100μl/孔)。
D单克隆细胞筛选
(1)实验试剂
包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6；
封闭液：2％牛奶in PBS洗液；
显色液：1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H2O2in柠檬酸缓冲液)；
终止液：2M硫酸；
二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP
(2)实验步骤
1)用包被液稀释“NH2-BSA”，终浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次。
2)2％牛奶封闭液封闭，200μl/孔，37℃孵箱，2h；后用洗液洗涤3次。
3)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS 200倍稀释)，均为100μl/孔，37℃孵箱，1h；后用洗液洗涤3次。
4)加入PBS(pH7.4)稀释20000倍的二抗，100μl/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次。
5)显色，显色液100μl/孔，显色时间为5min左右。
6)每孔加入50μl终止液终止。
7)双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据，如表2所示。表2中，不同的培养板标号NO1-10。
表2不同培养板测定的OD数值
用“NH2-BSA”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，除了阳性对照组，OD值大于0.15的共有36株阳性杂交瘤细胞株。
E单克隆细胞第二次筛选
将36株阳性的细胞株，用“NH2-BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到17株阳性杂交瘤细胞株。
F单克隆细胞亚类鉴定
步骤如下：
1.实验试剂
包被抗体：Southern Biotech；封闭液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；
显色液:0.2ml A液+10μl 30％H2O2in 10ml B液(A液：15mg/ml ABTS in H2O；B液：柠檬酸缓冲液，pH4.0)；各型亚类二抗。
2.实验步骤
a)用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5μg/ml，每孔加0.1ml，4℃，过夜。
b)PBS-T洗2次，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育2h。
c)PBS-T洗3次，每孔加入100μl杂交瘤上清，37℃孵育1h。
d)PBS-T洗3次，用封闭液1：1000(κ,λ)或1：2000(其它的)稀释的HRP标记的抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。
e)PBS-T洗3次；每孔加50μl底物溶液，10-20min内于双波长(450，630)测吸光值，记录保存数据。
筛选出来的17株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到14株IgG的阳性杂交瘤细胞株。具体如表3和表4所示。
表3 17株阳性细胞株测定的亚型数据
表4 14株IgG的阳性杂交瘤细胞株
实施例3
单克隆抗体效价测定-ELISA法
1.抗原包被：将多肽抗原稀释至浓度2μg/ml，加入96孔板，每孔100μl，4℃湿盒内包被过夜；
2.洗涤：用含有0.05％吐温-20的PBS缓冲液洗涤包被的酶标板，200μl/孔，洗涤3次，5min/次；
3.封闭：用1％BSA溶液对96孔板进行封闭，250μl/孔，37℃湿盒内封闭2h；
4.洗涤：同上洗涤方法；
5.一抗孵育：将兔血清多克隆抗体按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000用PBS缓冲液进行稀释，同时设置空白对照和阴性血清对照，100μl/孔，37℃湿盒内孵育1h；
6.洗涤：同上洗涤方法；
7.二抗孵育：将HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体用PBS缓冲液按照1:5000稀释，100μl/孔，37℃湿盒内孵育1h；
8.洗涤：同上洗涤方法；
9.加底物：将TMB按照100μl/孔加入96孔板，37℃湿盒内避光反应20min；
10.终止反应：用2M H2SO4按照50μl/孔加入96孔板终止反应，用酶标仪在450nm波长时测定吸光度值，OD阳性/OD阴性＞2.1为血清效价判定标准。
11.筛选得到的编号为24单克隆抗体的效价结果如图2所示。
得到该抗体效价为1：8000。
实施例4
单克隆抗体识别特异性-Western blot法
1.蛋白样品的制备：
将硅烷化的管子高压灭菌后加入0.1％BSA和0.9％NaCl的混合溶液后浸泡过夜，第二天将溶液吸出并使管子自然风干，在风干的管子中加入多肽冻存。将枪头同样用0.1％BSA和0.9％NaCl的混合溶液浸泡过夜，第二天用ddH2O冲洗干净(3次)后高压灭菌并烘干备用。
2.SDS-PAGE
选择合适的玻璃板擦拭干净后待用。先用1.5％琼脂封边后加入配制好的分离胶，留出浓缩胶所需空间，加入1ml去离子水覆盖胶上，使之与空气隔绝，以利于分离胶的凝聚。分离胶聚合完成后，倾出覆盖层水，用去离子水冲洗胶的顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺，用滤纸吸去胶顶部残存液体。配制浓缩胶，小心迅速注入分离胶上层，立刻插入干净的梳子，不能产生气泡，放置待凝。
待浓缩胶聚合完全后，加入电泳缓冲液，小心拔出梳子。将制备好的细胞总蛋白样品按次序上样。未加样的样品孔中加入1×上样缓冲液。以恒压由负极向正极电泳，溴酚蓝在浓缩胶中电压为80V，当溴酚蓝进入分离胶后电压增至120V，继续电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源，卸下凝胶。
3.Western-blot
1)剪取与凝胶大小相同的一张PVDF膜和数张滤纸，用电转液浸泡滤纸和电泳结束后的凝胶，PVDF膜先用甲醇浸泡10秒，去离子水冲洗，然后再浸泡于电转液中；
2)将蛋白电泳仪的塑料支架打开，两侧各放置一块海绵，按照从负极到正极依次为滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸的次序放置，除去气泡，将塑料支架夹紧放入电转槽，接通电源，于冰浴恒流400mA电转1h；
3)电转好的样品膜置于含有5％脱脂奶粉的TBST中室温封闭1h；
4)将膜置于适当稀释倍数的一抗中室温轻摇2-3h，或于4℃反应过夜；
5)用TBST洗膜两次；
6)将膜置于二抗中室温轻摇1-2h，或于4℃反应过夜；
7)用TBST洗膜两次；
4.显影
吸去膜上多余水分，将膜于ECL反应液中反应1min后，吸去膜上水份，将样品膜于暗室用X光片压片进行显影。
即上述代谢素多肽采用Western blot法验证单克隆抗体(24#)识别特异性的结果如图3所示。
实施例5
与实施例4相同的方法，不同的是，抗原采用OCN，OCN的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。得到的结果如图4所示。
可见，本发明制得的单克隆抗体(24#)具有与如SEQ ID NO：1所示的多肽和OCN优异的结合特异性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Tyr Leu Gly Ala Ser Val Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro Thr Arg
1 5 10 15
Glu Gln Cys Glu Leu Asn Pro Ala Cys Asp Glu Leu Ser Asp Gln Tyr
20 25 30
Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Lys Arg Ile Tyr Gly Ile Thr Ile
35 40 45
Claims (5)
1.一种代谢素多肽人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
如SEQ ID NO：1所示的代谢素多肽溶解，得到代谢素多肽浓度为6-9mg/ml的多肽溶液；
活化的载体蛋白溶解，得到所述活化的载体蛋白浓度为4-6mg/ml的载体蛋白溶液；
所述多肽溶液与所述载体蛋白溶液以体积比为1:2-3混合，偶联；
所述偶联的产物经分离纯化得到所述代谢素多肽人工抗原。
2.根据权利要求1所述的代谢素多肽人工抗原的制备方法，其特征在于，所述活化的载体蛋白为马来酰亚胺活化的匙空血蓝蛋白。
3.根据权利要求1所述的代谢素多肽人工抗原的制备方法，其特征在于，所述代谢素多肽溶解的溶剂为20±1mM磷酸钠缓冲液，其中还含有230±5mM NaCl，2±0.2mM EDTA，80±2mM蔗糖，pH 6.5-6.7。
4.根据权利要求1所述的代谢素多肽人工抗原的制备方法，其特征在于，所述活化的载体蛋白溶解的溶剂为20±1mM磷酸钠缓冲液，其中还含有100±5mM EDTA，80±2mM蔗糖，pH6.5-6.7。
5.权利要求1-4任一项所述的代谢素多肽人工抗原的制备方法制得的代谢素多肽人工抗原。
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