CN112679596B - 一种内收蛋白的抗原肽及其抗体与应用 - Google Patents
一种内收蛋白的抗原肽及其抗体与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种内收蛋白的抗原肽及其抗体与应用，属于生物技术领域。本发明的抗原肽为内收蛋白(1‑357)片段的抗原肽，其氨基酸序列为CAASGGGGVN。以该抗原肽为抗原制备的抗体能够特异性识别内收蛋白(1‑357)片段、而不识别内收蛋白全长，可以用于检测人脑标本及动物标本中内收蛋白被剪切的程度，用于阿尔兹海默病发病机制的研究，用于阿尔兹海默病的早期诊断等。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种内收蛋白的抗原肽及其抗体与应用。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)是临床上最常见的神经变性疾病，也是导致老年人痴呆最常见的原因。60岁以上老年人患病率高达5％，给社会和家庭带来沉重负担[1,2]。但迄今为止，AD发病的原因尚不清楚，因此也缺乏针对发病机制、延缓病程的治疗措施。
内收蛋白(γ-Adducin)是广泛表达于神经元的细胞骨架相关蛋白，主要的生理功能包括：参与细胞信号转导[3]、调节肌动蛋白的动力[4]、参与突触可塑性[5]，它还与突起生长和退变有关[6]。但AD发病过程中γ-Adducin的作用机制尚不清楚。申请人的研究发现，AD患者脑组织中的γ-adducin被剪切成片段，介导γ-adducin剪切的蛋白酶为天冬酰胺内肽酶(AEP)。在AD发病过程中脑内的AEP异常激活[7,8]，剪切γ-adducin的N357位点，形成γ-adducin(1-357)片段，进一步介导神经损伤和AD的发病。
鉴于AEP剪切γ-adducin形成的γ-adducin(1-357)片段在AD发病中起到重要作用，检测实验动物标本及人体液中的γ-adducin(1-357)片段对AD发病机制的理解具有重要的作用。但目前为止，尚无检测脑内被AEP剪切产生的γ-adducin(1-357)片段的抗体，给相关研究带来了极大的不便。
参考文献：
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发明内容
本发明的目的是开发针对γ-adducin(1-357)片段的抗体，提供一种γ-adducin(1-357)片段的抗原肽及其抗体与应用，用于AD及衰老相关疾病的发病机制研究和疾病早期诊断。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种γ-adducin(1-357)片段的抗原肽，其氨基酸序列为：CAASGGGGVN。
一种抗体，以上述抗原肽为抗原制备得到。进一步地，所述的抗体以Ac-CAASGGGGVN与载体蛋白交联后得到的交联多肽为抗原制备得到，所述的载体蛋白优选为KLH。所述的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。
进一步地，所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。
进一步地，所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以上述交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。所述的抗血清的分离纯化采用常规技术手段进行，即采用抗原亲和层析法对所述抗血清进行纯化，以得到纯化的兔多克隆抗体。
本发明γ-adducin(1-357)片段的抗原肽具有很好的免疫原性，以其为免疫原得到的兔多克隆抗体特异性好、效价高，只识别AEP剪切形成的γ-adducin(1-357)片段，而不识别全长的γ-adducin；效价可以达到1∶512000。基于所述抗体的特异性，其可用于检测人脑标本及动物标本中γ-adducin蛋白被剪切的程度，用于AD发病机制的研究，用于AD的早期诊断等。
一种检测γ-adducin蛋白被剪切程度的试剂，包括上述抗体。
一种AD早期诊断试剂，包括上述抗体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)现有的γ-adducin抗体都是无差异性地识别全长的γ-adducin蛋白，而我们发现γ-adducin被剪切后形成的γ-adducin(1-357)片段才是具有神经毒性作用的部分，因此检测该片段具有重要的意义。目前尚无特异性识别γ-adducin(1-357)片段的抗体，基于本发明抗原肽得到的特异性识别γ-adducin(1-357)片段的抗体解决了这一问题。
(2)本发明的抗γ-adducin(1-357)片段的抗体能够用于AD的早期诊断。
附图说明
图1为酶联免疫吸附实验检测抗γ-adducin N357抗体滴度的结果图。
图2为抗γ-adducin N357抗体的特异性检测结果图。AEP剪切γ-adducin形成γ-adducin(1-357)片段，抗γ-adducin N357抗体能够识别AEP剪切形成的γ-adducin(1-357)片段，而不识别全长的γ-adducin。
图3为使用抗γ-adducin N357抗体进行免疫印迹实验的结果图。抗γ-adducinN357抗体可检测到AD患者脑内和AD小鼠模型脑内的γ-adducin(1-357)片段。
图4为使用抗γ-adducin N357抗体进行免疫组织化学实验的结果图。抗γ-adducin N357抗体可检测到AD患者脑内的γ-adducin(1-357)片段。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1兔多克隆抗体(抗γ-adducin N357抗体)的制备
本实施例所用抗原肽(Ac-CAASGGGGVN)由人工化学合成得到(南京金斯瑞生物科技有限公司)。合成的抗原肽进行质谱鉴定，鉴定正确后利用HPLC进行纯化和纯度鉴定。
将上述抗原肽偶联到载体蛋白KLH上得到抗原肽-KLH偶联物，以其作为免疫原免疫新西兰兔制备多克隆抗体。具体步骤如下：
(1)实验前采集动物血液，并制备免疫前血清。采集的血液离心后收集上清即得到血清。
(2)初次免疫：每只兔子皮下多点注射乳化的1mL抗原肽-KLH偶联物和弗氏完全佐剂的混合液(体积比1:1)，其中，抗原肽含量为0.5mg。
(3)初次免疫一周后，按照初次免疫的方法进行第二次加强免疫。
(4)第二次加强免疫一周后，按照初次免疫的方法进行第三次加强免疫。
(5)第三次加强免疫一周后，采集血液制备抗血清。
采用抗原亲和层析法对抗血清进行纯化，得到纯化的抗γ-adducin N357抗体(1mg/mL)用于下述实验。
实施例2检测抗体滴度
(1)将未交联的抗原肽4μg/mL溶解于包被液(0.05M碳酸盐缓冲液pH 9.6)中。
(2)在96孔酶标板中加入100μL(1)中溶解抗原肽的包被液4℃过夜。
(3)次日，倒空液体并拍干残留液体，洗涤液每隔5分钟加入，冲洗三次。
(4)每孔加入150μL封闭液，37℃孵育1h。
(5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次。
(6)每孔加入按梯度稀释的抗γ-adducin N357抗体100μL，37℃孵育1h。
(7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三次。
(8)每孔加入按1:10000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(1mg/mL)，37℃孵育1h。
(9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗三到四次。
(10)拍干孔中残留液体，每孔加入100μL混合的显色液A、B，37℃避光显色30min。
(11)每孔加入50～100μL 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值，检测结果见图1，抗γ-adducin N357抗体的滴度达到1∶512000。
实施例3抗γ-adducin N357抗体特异性的细胞学检测
(1)表达带GST标签的γ-adducin(GST-γ-adducin)的质粒的构建：以HEK293细胞cDNA文库为模板，使用引物FP和RP扩增得到γ-adducin基因序列，通过连接、转化DH5α将γ-adducin基因将γ-adducin基因连接到pcDNA3.1-N-GST载体上，构建得到表达带GST标签的γ-adducin的质粒。其中，引物FP、RP序列如下：
FP：ACGCGTCGACTATGAGCTCAGATGCCAGCCAAGGCG；
RP：AGCTGCGGCCGCTTAGGCCTCAACTTTCTCC。
(2)细胞转染：将表达带GST标签的γ-adducin(GST-γ-adducin)的质粒转染到HEK293细胞内。
(3)制样：细胞转染2d后，收集细胞，PBS洗一遍，加裂解液(50mM柠檬酸钠，5mMDTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝6.0)冰上裂解30min，取上清至新的EP管中，取两管，30μL/管，其中一管加入5μL重组AEP酶(北京义翘神州)，另外一管加入5μL pH 6.0的buffer(50mM柠檬酸钠，5mM DTT，0.1％CHAPS，0.5％TX-100，pH＝6.0)作为对照，37℃孵育30min，加入5×SDS loading buffer，混匀，100℃沸水煮10min。
(4)跑胶：将制好的样品按照图2的顺序进行点样，80V恒压跑胶20min后，120V恒压跑胶到Marker分开至合适的位置，为了同时检测两个不同的抗体，在两块不同的胶上点同样的样品。
(5)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷，按照负极-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-正极的顺序将胶和膜用转膜夹固定好，220mA恒流转膜75min。
(6)封闭：转膜完成后，将膜用TTBS溶液洗涤一次后，置于5％奶粉中，放置于摇床上室温封闭1h。
(7)孵育一抗：封闭完成后，孵育一抗，一抗采用3％的奶粉进行稀释(GST抗体(Proteintech，1mg/mL)：1:10000，抗γ-adducin N357抗体：1:2000)，4℃摇床孵育过夜。
(8)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜40min，每10min换一次洗膜液。
(9)孵育二抗：采用3％的奶粉将将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗(用于抗GST抗体)或辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(用于抗γ-adducin N357抗体)按照1:10000比例进行稀释，室温孵育1h。
(10)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜1h，每10min换一次洗膜液。
(11)显影：使用ECL显影液对膜进行曝光显影。
结果见图2，抗γ-adducin N357抗体能够识别AEP剪切形成的γ-adducin(1-357)片段，而不识别全长的γ-adducin。
实施例4抗γ-adducin N357抗体在人和AD模型小鼠脑组织样本中的特异性检测
1、免疫印迹实验：
(1)制样：11例AD患者和3例非AD对照的脑组织标本来自于美国Emory老年痴呆研究中心。不同年龄阶段的P301S小鼠(AD模型鼠)麻醉灌注后取得脑组织标本。将脑组织样本加入NP40(碧云天，使用前加入Cocktail和磷酸酶抑制剂)裂解。冰上裂解30min。4℃15000g离心30min。取上清，加入5×loading buffer煮样。
(2)跑胶：将样本按照图3的顺序进行点样，80V恒压跑胶20min后，120V恒压跑胶到Marker分开至合适的位置，为了检测两个抗体(分别为抗γ-adducin N357和抗GAPDH)，在两块不同的胶上点同样的样品。
(3)转膜：提前配好转膜液，4℃预冷，按照负极-海绵-滤纸-胶-NC膜-滤纸-海绵-正极的顺序将胶和膜用转膜夹固定好，220mA恒流转膜75min。
(4)封闭：转膜完成后，将膜用TTBS溶液洗涤一次后，置于5％奶粉中，放置于摇床上室温封闭1h。
(5)孵育一抗：封闭完成后，孵育一抗，一抗采用3％的奶粉进行稀释(抗γ-adducin N357抗体：1:2000，GAPDH抗体：1:10000)，4℃摇床孵育过夜。
(6)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜40min，每10min换一次洗膜液。
(7)孵育二抗：采用3％的奶粉将辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Proteintech,1mg/mL)按照1:10000比例进行稀释，室温孵育1h。
(8)洗膜：室温采用TTBS溶液洗膜1h，每10min换一次洗膜液。
(9)显影：使用ECL显影液对膜进行曝光显影。
结果见图3，AD病人中存在γ-adducin 1-357片段(N357片段)，并且在AD小鼠模型脑内γ-adducin 1-357片段随着年龄增加。抗γ-adducin N357抗体可识别人和小鼠中γ-adducin 1-357片段。
2、免疫组织化学实验：
(1)脑片：AD患者和非AD脑组织石蜡切片来自于美国Emory大学痴呆研究中心。
(2)脱蜡，水化脑片：将脑组织石蜡切片放入二甲苯中，进行脱蜡，将蜡脱干净后，脑片依次放入95％、85％、75％的无水乙醇中，分别放置5min，然后放入ddH2O中。
(3)抗原修复：将脑片放入100mM柠檬酸钠(pH＝6.0)抗原修复液中，于92℃修复20min，待自然冷却后，PBS洗三遍，每次5min。
(4)3％双氧水孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色，PBS洗三遍，每次5min。
(5)封闭：3％BSA封闭30min。
(6)孵一抗：孵育抗γ-adducin N357抗体，抗体采用3％BSA溶液按照1:500的比例稀释，4℃孵育过夜。
(7)洗一抗：PBS洗三遍，每次5min。
后面步骤采用absin公司的免疫组化试剂盒进行实验：
(8)加入100μL一抗放大剂(试剂盒中的C液)，孵育10min，PBS洗三遍，每次5min。
(9)加入100μL二抗(试剂盒中的D液)，避光，孵育10min，PBS洗三遍，每次5min。
(10)配制新鲜显色液：将试剂盒中的E液和F液按照3:100的比例进行配制，混匀，待用。
(11)显色：在脑片上加入100μL新鲜显色液进行孵育，并在显微镜下观察，脑片被染上色后用去离子水进行冲洗，终止显色反应。
(12)苏木素染核。
(13)透明，将组织片子依次放入75％无水乙醇-85％无水乙醇-95％无水乙醇-二甲苯，分别放置5min。
(14)封片：中性树胶封片。
(15)显微镜观察，拍照。
结果见图4，使用抗γ-adducin片段抗体可以检测到AD患者脑内的γ-adducin(1-357)片段。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种内收蛋白的抗原肽及其抗体与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Ala Ala Ser Gly Gly Gly Gly Val Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcgtcgac tatgagctca gatgccagcc aaggcg 36
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agctgcggcc gcttaggcct caactttctc c 31
Claims (7)
1.一种内收蛋白1-357片段的抗原肽，其特征在于：氨基酸序列为：CAASGGGGVN。
2.一种抗体，其特征在于：以Ac-CAASGGGGVN与载体蛋白KLH交联后得到的交联多肽为抗原制备得到；所述的抗体为多克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于：所述的多克隆抗体为兔多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体，其特征在于：所述的兔多克隆抗体的制备方法包括以下步骤：以权利要求2中的交联多肽为免疫原免疫家兔，收集家兔血液制备抗血清，将抗血清分离纯化得到兔多克隆抗体。
5.权利要求2-4任一项所述的抗体在制备阿尔兹海默病发病机制研究的产品中的应用。
6.一种检测内收蛋白被剪切程度的试剂，其特征在于：包括权利要求2-4任一项所述的抗体。
7.一种阿尔兹海默病早期诊断试剂，其特征在于：包括权利要求2-4任一项所述的抗体。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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