JPH01221399A

JPH01221399A - α−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体およびα−ＡＮＰの免疫学的測定法

Info

Publication number: JPH01221399A
Application number: JP63047280A
Authority: JP
Inventors: Hiroo Imura; 井村　裕夫; Ichikazu Nakao; 一和中尾
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1988-02-29
Filing date: 1988-02-29
Publication date: 1989-09-04
Anticipated expiration: 2013-03-09
Also published as: EP0331439B1; KR960008672B1; CA1334076C; EP0331439A2; DE68911713D1; JP2724315B2; DE68911713T2; ATE99360T1; US5124264A; ES2061973T3; KR890012669A; EP0331439A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】星呈上五五月至１本発明は、α−ＡＮＰのＮ末端を認識するモノクローナ
ル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドー
マおよび該モノクローナル抗体を用いたα−ＡＮＰの免
疫学的測定法に関する。さらに詳しくは、該モノクロー
ナル抗体はα−ＡＮＰのＮ末端の２〜３アミノ酸残基を
主に認識し、さらにそのエピトープにはα−ＡＮＰのリ
ング構造の一部が含まれる可能性がある。また、ヒトα
−ＡＮＰとラットα−ＡＮＰの違いは、Ｎ末端から１２
番目のアミノ酸残基のみであるから、該モノクローナル
抗体はヒトα−ＡＮＰとラットα−ＡＮＰを等しく認識
する。さらに、中枢神経系のα−ＡＮＰは、循環血中の
α−ＡＮＰと異なり、そのＮ末端が欠除しているため、
該モノクローナル抗体を用いれば循環血中のα−ＡＮＰ
、即ち、ホルモンとしてのＡＮＰのみを測定することが
できる。

従３ヱｌ支重心房性ナトリウム利ズボリペプチド（ａｔｒｉａｌｎａ
ｔｒｉｕｒｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、　ＡＮ
Ｐ）は、心房筋細胞により産生され顆粒中に含まれる、
強い利尿作用およびナトリウム排泄作用を有するポリペ
プチドである。このようなポリペプチドはヒトのみなら
ずラットにおいても見出されており、それぞれｈＡＮＰ
、ｒＡＮＰと呼ばれる。ｈＡＮＰおよびｒＡＮＰはさら
にα、β、７の３つのタイプに分類される。α−ｈＡＮ
Ｐは２８アミノ酸残基からなり、Ｎ端から７番目のＣｙ
　ｓ　［７］と２３番目のＣｙ　ｓ　［２３］がジスル
フィド結合しており、その間の配列がリング構造をなし
ている（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　（以下
ＢＢＲＣと略記する）１１８、１３１−１３９．１９ｇ
４）、　Ｃ１−Ａ　Ｎ　Ｐは、ａ−ｈＡＮＰではＮ端か
ら１２番目の残基がＭ　ｅ　ｔであるのに対し、α−ｒ
ＡＮＰではＩｌｅである点でのみ異なっている（ＢＢＲ
Ｃ工、８３９−８６５．１９８３ン。β−ｈＡＮＰは、
α−ｈＡＮＰの逆平行二量体である（特開昭６０−１８
４０９８＞。７−ｈＡＮＰは１２６アミノ酸残基からな
り、そのＣ端の９９〜１２６アミノ酸配列がα−ｈＡＮ
Ｐに相当する。

ラットの心房抽出物中に強いナトリウム利尿活性、利尿
活性、血圧降下活性が発見（ｄｅ　Ｂｏｌｄ。

Ａ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　２８
．８９−９４．１９８１）されて以来、心房性ナトリウ
ム利尿ポリペプチド（ＡＮＰ）と呼ばれる一連のペプチ
ドがヒトおよびラット心房組織から単離されており、こ
のペプチドが体液の恒常性および血圧のコントロールに
関連していることを示唆している（Ｋａｎｇａｗａ、　
Ｋ　ｅｔａｌ、　　ＢＢＲＣ１１８，１３１−１３９，
１９８４など）。

α−ＡＮＰ［１７−２８コに対するポリクローナルウサ
ギ抗血清を用いて、ヒトα−ＡＮＰおよびラットα−Ａ
ＮＰ（それぞれ、α−ｈＡＮＰおよびα−ｒＡＮＰと略
記する）を等しく認識するＡＮＰに特異的なラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）が確立され（Ｎａｋａｏ、　Ｋ、
　ａｔ　ａｌ、　ＢＢＲＣ１２４，８１５−８２１，１
９８４）　、α−ＡＮＰが心臓から分泌妨れホルモンと
して体内を循環することが示きれた（Ｓｕｇａｗａｒａ
、　Ａ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｈｙｐｅｒｔａｎｓｉｏｎ　
８　（ＳｕｐｐＨ）、　ｌ−１５１−１５５，１９８６
＞、また、ＲｒＡとクロマト分析を用いた研究により、
ＡＮＰは中枢神経系にも存在しくＭｏｒｉｉ、　Ｎ、　
ｅｔ　ａｌ　、　ＢＢＲＣ１２７，４１３−４１９、１
９８５）　、ラット脳およびを髄に存在するＡＮＰの主
要分子構造はａ−ｒＡＮＰ［４−２８１およびα−ｒＡ
ＮＰ［５−：２８］であることが明らかになり　（Ｓｈ
ｉｏｎｏ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ、　ＢＢＲＣ１３５，７
２８−７３４、１９８６，Ｍｏｒｉｉ、Ｎ、　　ａｔ　
ａｌ　　、ＢＢＲＣ１４５，１９６−２０３、１９８７
）、神経ペプチドとしてのＡＮＰの存在様式はホルモン
としてのＡＮＰのそれとは異なっていることが示された
（Ｎａｋａｏ、　Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｃａｎ。

Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　６５
．１７５６−１７６１．１９８７）。

このα−ＡＮＰに対する抗血清は、循環血中のＡＮＰと
脳のＡＮＰを識別しないが、免疫組織化学的な研究にも
使用きれた（Ｋａ賀ａｔλ、　ｌ（、ｅｔ　ａｌ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１６．５２１−５４６．１
９８５）。きらに、ラットにおいて、この抗血清の脳室
内投与により脳内の内因性ＡＮＰの作用が中和され水摂
取が促進きれた（Ｋａｔｓｕｕｒａ、　Ｇ、　ａｔ　ａ
ｔ、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　１２１．’　２８！１ｒ２８７
．１９８６）、このように、ポリクローナルウサギ抗血
清は多方面で有用であるが、これらの抗血清は供給が限
定されていること、エピトープが多様であること、ＡＮ
Ｐ以外のものに対する不要な抗体が混入してくることな
ど、避けられない欠点を有している。

以上のような理由により、ＡＮＰに対するモノクローナ
ル抗体が切望きれているが、最近様々な特異性を有する
モノクローナル抗体が報告されてきている（Ｊｏｈｎ、
　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　３８．１
９９１−１９９７．１９８６　；　Ｍｉｌｎｅ、　Ｒ，
ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

２４、１２７−１３２．１９８７　：　Ｇｌｅｍｂｏｔ
ｓｋｉ、　Ｃ，Ｃ，ｅｔａｌ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ　１２１．８４３−８５２．１９８７　：Ｎａｏ
ｍｉ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ、　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　１
２．４３３−４４０゜１９８７）。本発明は、α−ＡＮ
ＰのＮ末端配列に対する新規なモノクローナル抗体を提
供し、さらに詳細には、２８アミノ酸残基からなる循環
血中のＡＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗体を
提供する。

ＡＮＰの測定法としては既に抗血清を用いたＲＩＡが確
立されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８，３２３−３２
５．１９８５；　Ｎａｔｕｒｅ　３１４．２６４−２６
６．１９８５：　ＢＢＲＣ１２４，８１５−８２１，１
９８４；　ＢＢＲＣ１２４，６６３−６６８，１９８４
；　ＢＢＲＣ１２５，３１５−３２３，１９８４）。こ
のうち、抗血清ＣＲ−３はＡＮＰのＣ末端断片［１７−
２８］を認識することが知られている。

また、α−ｈＡＮＰを認識するモノクローナル抗体とし
ては１１Ａ−Ａｌ　ｌが知られている。該抗体はラット
のＡＮＰの一種であるアトリオペプチン■を抗原として
得られたもので、そのエピトープはジスルフィド結合を
含むＣｙｓ［７］　−３ｅｔ　［２５］の間に存在し、
即ちＡＮＰのリング構造の一部であろうと考えられてい
る。該抗体の親和性はＭ　ｅ　ｔ　［１２、ヒト］と１
１ｅ［１２，２７８１間で差がなく、ｒＡＮＰとｈＡＮ
Ｐを認識する（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ　　３８．１９
９１−１９９７．１９８６）。

発明が解決しようとする課題最近、ＡＮＰに対する種々のモノクローナル抗体が報告
されており、ラジオイムノアッセイや免疫組織化学的実
験や中和実験に利用されている（Ｊｏｈｎ、　Ａ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　３８．１９９１（９
９７゜１９８６　；　Ｍｉｌｎｅ、　Ｒ，ｅｔ　ａｔ、
　Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２４゜１２７−１３２
．１９８７　；　Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ、　Ｃ，Ｃ，ｅ
ｔ　ａｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１２１．８４３−８５２
．１９８７　：　Ｎａｏｍｉ、　Ｓ。

ｅｔ　ａｌ、　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　６．４３３−４４
０．１９８７　；　５ｔａｓｃｈ。

Ｊ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　
Ｐｈａｒｍｃｏｌ、　１２９．１６５−１６８．１９８
６＞、一方、さらに親和性の高いモノクローナル抗体が
切望されていたが、それらと本発明のモノクローナル抗
体を比較した場合、本発明のモノクローナル抗体は、リ
ガンドへの親和性は最も高く、結合特異性はそれらと異
なる。加え℃、このモノクローナル抗体は、ラットにお
ける免疫組織化学実験や中和実験にも利用できる。また
、本抗体をＲＩＡなどに用いれば非常に高感度なα−Ａ
ＮＰの測定が可能であり、さらに、本抗体とα−ＡＮＰ
（７）Ｃ末端を認識する抗体、例えば、α−ＡＮＰ［１
７−２８１に対するポリクローナル抗血清を組み合わせ
れば、極めて高感度なα−ＡＮＰのサンドイッチェンザ
イムイムノアツセイ（ＥＩＡ）が可能になり、特に、血
中を循環するα−ＡＮＰのみを測定することが可能であ
る。また従来のα−ＡＮＰの測定法においては、血漿な
どの試料からα−ＡＮＰを精製する必要があったが本発
明の測定法は非常に感度が高いためその必要がない。

以上の様に、α−ＡＮＰのＮ末端配列を認識するこの新
規なモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−■はＡＮＰのホ
ルモンとしての生理学的病態生理学的意義を研究してい
くうえで非常に有用である。

問題点を解決するための手段本発明者らはｈＡＮＰのＮ端側断片を特異的に認識する
親和性の高いモノクローナル抗体を創製すべく鋭意研究
を行なった結果、α−ｈＡＮＰのＮ末端を認識するモノ
クローナル抗体を得、それを利用するα−ｈＡＮＰの高
感度測定法を完成するに至った。

（１）　　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調
製 α−ｈＡＮＰは２Ｂアミノ酸残基からなるポリペプチド
であり、比較的低分子であるため抗体の産生を誘起する
能力（免疫原性）が低い。そのため、抗原として用いる
ためには牛血清アルブミン、牛チログロブリンなどと結
合きせる。得られた複合体は、フロイントの完全アジュ
バント等のＪ当なアジュバントに乳濁し、マウスの免疫
に用いる。

免疫は、上記乳濁液を数週間おきにマウスの腹腔、皮下
または静脈に数回繰り返し接種することにより行なう。

最終免疫後３日ないし５日後に肺臓を取り出し、抗体産
生細胞として使用する。この時同時に抗体産生細胞と融
合許せてハイプリドーマを得るための親細胞として、ヒ
ボキサンチンーグアニンーホスホリボシルトランスフエ
ラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ−）あるいはチミジンキナーゼ
欠損（ＴＫ−）の様な適切なマーカーを持つミエローマ
細胞株を用意し、これと抗体産生細胞とを融合させてハ
イブリドーマを作製する。

ハイブリドーマ作製における培地として、イーグルＭＥ
Ｍ、ダルベツコ変法培地、ＲＰＭＩ−１６４０などの通
常良く使用されているものに、適宜的１５％の牛胎児血
清（Ｆｅ２．　ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆｓｅｒｕｍ　）を
加えて用いる。

まず、親細胞であるミエローマと肺細胞を約１＝６の割
合で用意する。融合剤としてはよく用いられているポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）の５０％を用いるのが融
合率示高いとされている。

融合株はＨＡＴ選択法により選択する。生じるハイブリ
ドーマのスクリーニングは培養上清を用い、膜螢光抗体
法、ＥＬＩＳＡ法（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋａｄ　Ｉ＋＋
＋ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）、免疫組織染
色法、ＲＩＡ法など既知の方法により行ない、目的の免
疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマのクローン
を選択する。ハイブリドーマの単一性を吟味するため、
９６大のマイクロウェルにフィーダーレイヤー（ｆｅｅ
ｄｅｒ　１ａｙｅｒ　）として正常な肺細胞を蒔いた上
にハイブリドーマを１穴に１個より多くならないように
蒔き、生育してくるクローンについて再びスクリーニン
グを行なう、このサブクローニングを繰り返すことによ
り、単一性のハイブリドーマを得る。

（り　モノクローナル抗体の産生次に、本発明のモノクローナル抗体を製造するために、
上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏ　）または動物体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）で培
養する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系で培養する場合、培地は先
に述べた通常培地にＦｅ２を添加したものでよく、この
培地で３から５日培養の後、培養上清からモノクローナ
ル抗体を得る。ｉｎ　ｖｉｖｏ系の培養では、ハイブリ
ドーマを哺乳動物の腹腔に接種し、７ないし１４日後に
腹水を採取し、これよりモノクローナル抗体を得る。　
ｉｎ　ｖｉｖｏ系での培養の場合、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ系
での培養に比べて邊かに大量の抗体を効率的に取得しう
るので好ましい。

こうし℃得られた培養上清または腹水からのモノクロー
ナル抗体の精製は、硫安分画、ＤＥＡＥセファロースカ
ラム等の既知の方法を適宜組み合わせて行なうことが出
来る。

本発明者らは、α−ＡＮＰに対するモノクローナル抗体
ＫＹ−ＡＮＰ−１［を確立しその特性を調べた。得られ
たモノクローナル抗体はα−ｈＡＮＰに対して高い親和
性を示し、Ｋａは６．６　Ｘ　１０ＩｅＭ−１であった
。また、このモノクローナル抗体の特異性の分析におい
ては、α−ｒＡＮＰ［３−２８］に弱い交差反応性が見
られたが、α−ｒＡＮＰ［４−２８コおよびａ−ｒＡＮ
Ｐ［５−２８］とは殆ど反応せず、α−ＡＮＰの最初の
２〜３アミノ酸が抗体の結合に最も重要であることを示
している。α−ｈＡＮＰのＮ末端を延長した構造の７−
ｈＡＮＰの交差反応性は５０％であった。さらに、この
抗体は、α−ｈＡＮＰと同様にα−ｒＡＮＰを等しく認
識することから、α−ＡＮＰの１２番目のアミノ酸はエ
ピトープに含まれない、しかし、α−ＡＮＰ［１−１１
］は、この抗体に充分認識されなかった。これらの結果
より、この抗体の主要な認識部位はα−ＡＮＰの最もＮ
端側の配列であり、また、Ｃｙｓ　’と（ｙＳｍｌの間
のジスルフィド結合により形成されるリング構造も認識
する可能性があることが示唆される。ラット中枢神経系
のＡＮＰは主に、α−ＡＮＰのＮ末端が欠除した構造、
即ち、α−ＡＮＰ［：４−２８コおよびα−ＡＮＰ［５
−２８１であり、循環器系のα−ＡＮＰとは異なること
が報告されている。従って、本発明のモノクローナル抗
体は極めて循環血中のＡＮＰに特異的であり、ヒト型と
ラット型を同等に認識する。

本発明のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−１［を産生
するハイブリドーマＫＹ−ＡＮＰ−１［は１９８８年２
月２日から茨城系つくば南東１丁目１番３号の工業技術
院微生物工業技術研究所に、Ｍｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄ
ｏｍａ　ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ［、微工研条寄第１６９５号
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６９５）として、ブダペスト条
約に基づいて寄託されている。

本発明のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−１［を用い
るα−ＡＮＰの免疫学的測定法としては、−抗体法によ
るＲＩＡやサントイ・ノチＥＩＡを挙げることができる
。ＲＩＡに関しては、実施例に示すとおり、試料または
標準α−ＡＮＰと一定量のアイソトープ標識したα−Ａ
ＮＰとを本抗体と結合させ、抗体に結合した放射能を測
定する競合法が上げられる。サンドイッチＥＩＡとして
は、上述のα−ＡＮＰ（７）Ｃ末端を認識する抗血清Ｃ
Ｒ−３などと組み合わせた方法が可能であり、以下の様
にして測定できる。

抗体を固定化する固相としては、通常の免疫測定法に使
用される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスま
たは合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボ
ール）、チューブ、プレートなどを用いることができる
。これらの担体に、α−ｈＡＮＰのＮ端側またはＣ端側
を認識する抗体を吸着せしめる。吸着は通常リン酸バッ
ファー中、ｐＨ６〜１０、好ましくは中性付近で室温下
に一夜放置することにより行なう、抗体を吸着した担体
は、アジ化ナトリウムなどの肪腐剤の存在下、冷所に保
存する。

モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体について
、同様の処理で担体に結合せしめることができる。

抗体を含む腹水または抗血清は硫酸ナトリウムで分画し
、次いで、ＤＥＡＥ−セルロースのカラムを通すことに
よりＩｇＧを調製する。得られたＩｇＧをペプシンで消
化してＦ（ａｂ’　）＊断片とし、更にこれを２−メル
カプトエチルアミンで還元すれば、目的の抗α−ｈ　Ａ
　Ｎ　ＰＦａｂ’が得られる。１頗からＦａｂ　’の調
製については、ジャーナル・才ブ・イムノアッセイＣＪ
、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ］　、　４．２０９〜３２７
（１９８３）に詳細な説明があり、本発明においても、
同様の手法を利用することができる。

抗体の標識酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、グルツ
ースオキシダーゼなどが利用可能であるが、本発明にお
いては、特に西洋わさびペルオキシダーゼが好ましく用
いられる。また、架橋剤としては、Ｎ、Ｎ”−Ｏ−フェ
ニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シ
クロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マ
レイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシン
イミドエステル、４，４°−ジチオンピリジン、その他
公知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素
および抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じ
て、既知の方法に従って行なえばよい。また、抗体とし
ては、場合によっては、そのフラグメント、例えば）”
ａｂ’、）”ａｂ、　Ｆ（ａｂ’）＊を用いる。また、
ポリクローナル、モノクローナル抗体にかかわらず同様
の処理により酵素標識体を得ることができる。上記架橋
剤を用いて得られる酵素標識抗体はアフイニテイ・クロ
マトグラフィーなどにより精製すれば、更に感度の高い
免疫測定系が可能となる。精製した酵素標識抗体は、安
定剤としてチメロサールまたはグリセリンを加えて、あ
るいは凍結乾燥して冷暗所に保存する。

上記で調整された免疫学的測定試薬を用いてα−ｈＡＮ
Ｐを測定する際の抗体の組合わせとしては、α−ｈＡＮ
ＰのＮ端側を認識する抗体を固定化した場合にはＣ端側
を認識する抗体を酵素標識抗体とし、Ｃ端側を認識する
抗体を固定化した場合にはＮ端側を認識する抗体を酵素
標識抗体とすればよい、一般には、固定化には比較的大
量の抗体が必要であるため安定的に大量の抗体が得られ
るモノクローナル抗体（例えば、本発明のＫＹ−ＡＮＰ
−ＩＩ）が固定化に適しているが、抗血清から得られる
ポリクローナル抗体も不都合なく使用できる。酵素標識
する抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体
のいずれでもよく、固定化した抗体が認識するのとは異
なる部位を認識するものであればよい０例えば、固定化
抗体として本発明のＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩを用いた場合に
は酵素標識抗体として上述の抗血清ＣＲ−３などが適用
でき、またこの逆の組合わせでもよい。当然、α−ｈＡ
ＮＰのＣ端側を認識するモノクローナル抗体やＮ端側を
認識する抗血清も適用できる。

実施例ハイプリドーマの調製合成ａ−ｈＡＮＰ（１，５ｍｇ）と牛チログロブリン（
５，４ｍｇ　）を２ｍｌの蒸留水に溶解する。この溶液
に、蒸留水１ｍｌに溶解した１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド３０ｍｇを室温
で１０分かけて滴下し、室温で２４時間攪拌する。この
溶液を、蒸留水３ρに対して６回、３日間透析する。こ
の透析物を５つに分注して一２０℃で保存した（　ＢＢ
ＲＣ１２４、８１５−１３２１，１９８４参照）。

上記の分注保存した溶液Ｃ３ＱＯｔ１ｇのα−ｈＡＮＰ
を含む）に蒸留水を加え１．２ｍｌとし、これを１．２
ｍｌのフロイントの完全アジュバントに懸濁した。その
うち約２ｍｌを１０匹のＢＡＬ　Ｂ　／　ｃ雌マウスの
腹腔および皮下に注射しく１匹当り２００μｍ）、さら
に３週間後に同し方法で追加免疫した。その後、約４週
間隔で、完全アジュバントに乳濁した１０〜３０μｇの
α−ｈＡＮＰの皮下投与を３回繰り返した。１０μｇの
α−ｈＡＮＰの静脈注射による最終免疫の４日後、マウ
スの肺臓を摘出し、細胞融合に用いた。

肺臓細胞（６ＸＩＱ’個）とミエローマ細胞（Ｘ６３−
Ａｇ８．６５３．１０７個）をダルヘツコ培地中（ＤＭ
ＥＭ）で混合し、１５００ｒｐｍ、　４”Ｃで５分間遠
沈した。得られたベレットを３７℃に加温し解した後、
５０％ＰＥＧ４０００（ＰＥＧ１ｇ／ＤＭＥＭ１ｍｌ）
１ｍｌを３７℃で１分間かけて滴下した。３７℃で２分
間放置した後、３７℃のＤＭ　Ｅ　Ｍ　１０　ｍ　ｌを
５分かけて加え希釈し、４℃で１５％ＦＣ３添加ＤＭＥ
Ｍで遠心洗浄する。

融合後、１５％牛脂児血清を含むＨＡＴ培地中でハイプ
リドーマを選択した。細胞の増殖に伴い、［■６１コα
−ｈＡＮＰを用いるＲＩＡによって培養液中の抗体産生
を定期的に調へた。はぼ全てのウェルにおいてハイプリ
ドーマの増殖が観察され、そのうち約８％（２９ウエル
）が抗体を産生していた。抗体産生開胸は、マウス胸腺
細胞をフィーダーとして、限界希釈法により２回クロー
ニングした。最も強い反応性を有する抗体を産生するク
ローン株ＫＹ−ＡＮＰ−１［を確立し、その特性を調べ
るために増殖させた。

モノクローナル抗体の調ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．５ｍｌのプリスタンを腹腔
に２回１〜２週間間隔で投与することにより前処理した
。そのマウスの腹腔に、２００μＩのＤＭＥＭに懸濁し
た５Ｘ１０＠個のハイプリドーマＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩを
注射した。得られた腹水をプロティンＡ−セファロース
ＣＬ−４Ｂカラムで精製し、モノクローナル抗体ＫＹ−
ＡＮＰ−■を得た。

モノクローナル抗　の特性上記で得られたモノクローナル抗体のアイソタイプをオ
クタロ＝−法（Ｍｏｕｓｅ　ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＴｙ
ｐｉｎｇ　Ｋｉｔ、　Ｍｉｌｅｓ）によって決定した。

親和定数は後記のＲＩＡによるスキャッチャード分析法
に従って決定した。特異性は、α−ｈＡＮＰのＲＩＡに
おける各種ＡＮＰ関連ペプチドとの交差反応性を調べる
ことにより分析した。

得られたモノクローナル抗体は、オフタロニー法により
ＩｇＧ、サブクラスに属するものと決定された。スキ〜
ンチ〜−ド法により親和定数を調べたところ、α−ｈＡ
ＮＰに対するＫａ値は６．６Ｘ　１０”　Ｍ−’であり
、高い親和性を示した（第１図参照）。

ＲＩＡモノクローナル抗体を用いたＲＩＡは、ＢＢＲＣ１２４
、８１５−８２１，（１９８４）に詳述されているポリ
クローナル抗血清による方法に従って行なった。

試薬はすべて、０．５２ゼラチン（メルク）、１−Ｎａ
ｊＥＤＴＡ、　０．２　ｍＭ　ンスチン、０．１　％　
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と００１χメルチオレイトを
含む０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）に溶解し
た。

ＫＹ−ＡＮＰ−１１を含む腹水希釈液（１０７倍）１０
０μｌ、試料または標準α−ＡＮＰ希釈液１００μｌ、
上記バッファー２００μｍ、ＵＩｊ６Ｔコα−ｈＡＮＰ
（約８０００ｃｐｍ）　１００１１１の混合液を４℃で
４８時間反応させる。これをデキストラン−コーテッド
−チャーコール１ｍｌと混合し４℃で５分間反応させる
。その後、４℃で３０分間３０００ｒｐｍにて遠心し、
その上清の放射活性を７−カウンターで測定することに
より、サンプル希釈液中の抗体価を求めた。［＋ｔｇＩ
］α−ｈＡＮＰの比活性は４００〜８００μＣｉ／μｇ
であった。マウス腹水は１０７倍に希釈して使用でき、
その時のトレイサーとの結合率は約３０％であった。

上記１１８１−α−ｈＡＮＰはクロラミンＴ法によって
調製した。即ち、α−ｈＡＮＰ（１Ｍｇ）とＮａ”’Ｉ
（１ｍ　Ｃｉ　）を混合し、１０μ＋のクロラミンＴ（
５，２５ｍｇ／ｍ　Ｉ　）を加え、１０秒後に２０μｌ
のど口面硫酸ナトリウム（４，５ｍｇ／ｍ＋）を加える
。さらに、２％ゼラチン１ｍｌを加え、５ｅｐ−Ｐａｋ
　　Ｃ１Ｂ（ＷａｔｅｒＳ社製）で精製する。

このモノクローナル抗体を用いたＲＩＡにおけるα−ｈ
ＡＮＰの標準曲線と関連ペプチドの交差反応性を第２図
に示す。このＲＩＡはα−ｒＡＮＰと当モルの交差反応
性を示した。また、α−ｒＡＮＰ［３−２８１と　α−
ＡＮＰ［１−１１コ　に弱い反応性を示したが、α−Ａ
ＮＰ［１−６１、α−ＡＮＰ［：４−２８］、α−ＡＮ
Ｐ［５−２８コおよびα−ＡＮＰ［１７−２８コには実
質的に交差反応性を示さなかった。さらに、このＲＩＡ
はヒト心房由来の７−ｈＡＮＰおよび合成β−ｈＡＮＰ
に、それぞれ５０％と２０％の交差反応性を示した（表
１参照）。

第２図に示したα−ｈＡＮＰの標準曲線におけるＣ１−
ｈＡＮＰの検出限界は０．８　ｆｍｏｌ　（２，５ｐｍ
）／１ｕｂｅであり、ＩＣ，、は８　ｆｍｏｌ　（２５
ｐｇ）／１ｕｂｅであった。このＲＩＡにおける誤差は
１０％以下であった。

（以下余白）表１ＫＹ−ＡＮＰ−１１によるＲＩＡにおけるＡＮＰ関連ペ
プチドの交差反応性ペプチド　　　　　　　交差反応性（％）”α−ｈＡＮ
Ｐ　　　　　　　　　　１００ａ　−ｒＡＮＰ　　　　
　　　　　　１００ａ　−ｒＡＮＰ（３−２８）　　　
　　　　　０．２α−ｈＡＮＰ（４−２８）　　　　　
　　＜　０．０１α−ｒＡＮＰ（４−２８）　　　　　
　　＜　０．０１α　−ｈＡＮＰ（５−２８）　　　　
　　　　　　　　　　　　　＜　　０．００１α−ｒＡ
ＮＰ（５−２８）＜０．００１α−ＡＮＰ（１７−２８
）　　　　　　　　　　　　　＜　　０．００１α−Ａ
ＮＰ（１−１１）　　　　　　　　０．０４α−ＡＮＰ
（１−６）　　　　　　　　＜　０．００１β−ｈＡＮ
Ｐ　　　　　　　　　　２０７−ｈＡＮＰ　　　　　　
　　　　５０９値は分子レベルで示しである。

光」Ｉと１朱本発明のＫＹ−ＡＮＰ−１［は、α−ｈＡＮＰと同等に
α−ｒＡＮＰも認識するため、ヒトＡＲＰのみならず、
ラットやマウスなどの実験動物のＡＮＰｆｉｌｌ定にも
適している。また、α−ＡＮＰのＮ末端を認識するので
循環血中のα−ＡＮＰを特異的に測定することができる
。このα−ｈＡＮＰの測定法の確立により、心疾患、腎
疾患、高血圧症（本態性、二次性）、浮腫性疾患（肝硬
変、ネフローゼ、突発性浮腫等）、脱水症等体液バラン
スの異常を伴う疾患の診断および治療経過の簡便かつ正
確な観察が可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、［＋！′１コα−ｈＡＮＰのモノクローナル
抗体ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ［への結合のスキャッチャ　　　
　　”−ドブロットである。ＫＹ−ＡＮＰ−ｎを含む腹
水を［１１ｇ１コα−ｈＡＮＰ（２，７〜１４０９Ｍ、
５００μｍ／１ｕｂｅ）と共に４℃で４８時間インキュ
ベートし、デキストランフ−テッドチャコール法により
分離した後、特異的な結合を測定した。第２図は、ＫＹ−ＡＮＰ−１［を用いたＲＩＡにおける
α−ｈＡＮＰの典型的標準曲線と関連ペプチドの交差反
応曲線を示す、　［”’ＩＩα−ｈＡＮＰと種々の濃度
の標準α−ｈＡＮＰまたは関連ペプチドをＫＹ−ＡＮＰ
−ＩＩと共に４℃で２４時間インキュベートした。・は
α−ｂＡＮＰｓ　Ｑはα−ｒＡＮＰ　。ムはａ−ｒＡＮＰ（３−２８）、△はａ−ｈＡＮＰ（４
−２８）およびα−ｒＡＮＰ（４−２８）、◆はα−ｈ
ＡＮＰ（５−２８）およびα−ｒＡＮＰ（５−２８）、
◇はα−ＡＮＰ（１７−２８＞、■はα−ＡＮＰ（１−
１１）、口はα−ＡＮＰ（１−６）を示す。第１図［Ｂ］　（ｘｌｏ−”Ｍ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）α−ＡＮＰのＮ末端を認識するモノクローナル抗
体。
（２）α−ＡＮＰのＮ末端の２〜３アミノ酸残基を認識
する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
（３）α−ＡＮＰのリング構造を認識する請求項１また
は２に記載のモノクローナル抗体。
（４）モノクローナル抗体にＹ−ＡＮＰ−IIである請求
項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
（５）請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ。
（６）ハイブリドーマＫＹ−ＡＮＰ−IIである請求項６
に記載のハイブリドーマ。
（７）請求項１〜４のいずれかに記載のモノクローナル
抗体を用いることを特徴とするα−ＡＮＰの免疫学的測
定法。
（８）競合法によることを特徴とする請求項７に記載の
測定法。
（９）ラジオイムノアッセイであることを特徴とする請
求項８または９に記載の測定法。