JP3167415B2

JP3167415B2 - 固相免疫検査における抗原細胞の保存方法

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Publication number: JP3167415B2
Application number: JP11184892A
Authority: JP
Inventors: 洋一柴田
Original assignee: Olympus Optic Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1992-04-30
Publication date: 2001-05-21
Anticipated expiration: 2016-05-21
Also published as: DE4219149C2; US5312744A; DE4219149A1; JPH05307038A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】臨床医学上重要な細胞の免疫学的
調査に利用される技術であり、詳しくは、種々の抗原細
胞を反応容器のような固相支持体に固相化して、組織抗
原の各種型判定並びに該組織抗原を中和する抗体の存在
を知るための固相免疫検査における抗原細胞の保存方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】輸血用の各種血液成分や移植用の器官等
の細胞は、様々な抗原型を表現している故に、組織抗原
と総称される。これら組織抗原が表現する抗原型はいず
れも移植ないし輸血に際して、供与者と受容者との間
で、厳密な適合性検査または中和性抗体確認検査が行わ
れる。このとき、適合性が不充分だったり、中和性抗体
が存在するのを見過ごして移植または輸血を実行すれ
ば、受容者を重篤な拒否反応やＧＶＨ反応の危険にさら
すことになる。従って、輸血検査においては、赤血球、
血小板及び白血球等の各種血液細胞の血液型を正確にか
つ再現性よくタイピングすることが要求される。この要
求を満たすべく、現在、各種検査方法の中でも、血液型
が既知である血液細胞を患者の血液サンプルと接触さ
せ、その抗原抗体反応の有無を検出する方法が広く用い
られている。この方法を用いる場合には、所望量の血液
細胞を常時安定して入手できることが必要であるため、
入手可能な最大量の血液細胞を予め確保しておき、これ
を凍結或いは冷蔵保存している。しかし、生きた血液細
胞の免疫学的有効期間は３〜４週間と短く、時間経過に
伴ってその抗原性が顕著に失われてしまう。従って、従
来、血液細胞を組織学的に安定化する試みが多数実施さ
れてきた。

【０００３】一般に、赤血球をマーカーセルとして沈降
させて分布パターンを得る受身（間接）凝集または直接
凝集検査では、赤血球を組織学的に安定化させるため
に、種々のアルデヒド処理が行われている。

【０００４】Ｓ．ＡｖｒａｍｅａｓらによるＩｍｍｕｎ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６，６７，１９６７には、赤血
球表面を抗原性が完全に失活するような強いアルデヒド
処理により組織学的に安定化した後、血液型以外の各種
病原物質に関する抗原または抗体を結合させることによ
り、受身凝集検査用マーカーセルを得る方法が開示され
ている。また、欧州公開特許３１７０８５号には、赤血
球を０．０１〜２％のホルムアルデヒド（ホルマリン）
或いは０．０１〜０．１％のグルタルアルデヒド（グル
タール）という非常に温和なアルデヒドで処理すること
によって、抗原を失活程度を抑制しながら組織学的に安
定化させた直接凝集検査用マーカーセルを得る方法が開
示されている。得られた直接凝集検査用マーカーセル
は、その抗原性を維持するため、ゼラチン或いはデキス
トラン等を含む十種類程度の異なる成分からなる複雑な
保存液に懸濁し、３〜６か月間冷蔵保存されている。

【０００５】これらの方法を用いると、抗原活性が比較
的安定なマーカーセルを得ることが可能であるが、ある
程度の表面抗原活性の失活は免れ得ない。また、上記の
ようなマーカーセルは、それ自身吸着能を持たないた
め、抗原等を固相化する際に、タンニン酸等のバインダ
ーを介在させる必要がある。更に、マーカーセルのよう
な微粒子に固相化し得る抗原または抗体は、超音波処理
等により可溶化されたものに限られる。

【０００６】近年、多数の凹上ウェルを持つマイクロプ
レートに、免疫反応性細胞を吸着させて、患者のサンプ
ル中のアナライトを高感度に検出する固相免疫方法が主
流になりつつある。固相法においては、固相化支持体に
多量の抗原を結合させること、及びこの結合された抗原
の活性を保持することが重要であり、そのため以下に示
すような種々の工夫が施されている。

【０００７】特開昭６０−３５２６３号には、ポリ塩化
ビニル性マイクロプレートの各ウェルに、ホルモン、免
疫グロブリン等の単一の抗原を含む溶液を分注して物理
吸着させた後、種々の糖類溶液と接触させ、自然乾燥さ
せる方法が開示されている。また、米国特許４，８９
１，３１９号には単一の抗原に対する抗白血球抗体や酵
素をポリスチレン製マイクロプレートの各ウェルに分注
し、長時間静置して物理吸着させた後、トレハロース溶
液と接触させ、自然乾燥させる方法が開示されている。
しかし、物理吸着力のみによって固相化された細胞は、
保存期間中或いは反応工程中に剥れ易いという問題があ
る。

【０００８】更に、米国特許５，０３０，５６０号に
は、アルデヒド処理による赤血球表面の抗原性の失活を
回避するために、正電荷を有する染料をバインダーとし
て、固相免疫試験用のマイクロプレートに赤血球や血小
板のような抗原性血液細胞を固相化させた後、種々の糖
類溶液と接触させ、乾燥させる方法が記載されている。
しかし、このような荷電性バインダーの吸着性を利用す
ると、試験中にアナライト以外の種々のタンパクと非特
異的に結合するため、判定を誤らせるという問題があ
る。

【０００９】一方、本発明者は、従来より待望されてい
た血小板に対する抗原のタイピングを実現すべく、血小
板を物理吸着のみで固相化したマイクロプレートと、抗
ＩｇＧ抗体を羊赤血球に結合させたマーカーセルとを用
いる混合受身凝集（ＭＰＨＡ）法による抗血小板抗体検
査キットを開発した。これはＯＬＹＢＩＯ（オリビオ）
という登録商標で販売されており、輸血検査分野での研
究に貢献している。しかし、この検査キットは、プレー
ト自身の物理吸着性のみによる固相化処理を採用してい
るため、抗原性が失活する恐れはないが、必ずしも十分
な結合力で固相化されていない。

【００１０】以上のように種々の検討は行われてきたも
のの、反応特異性並びにマイクロプレートへの吸着性に
優れ、しかも抗原性を長期間安定に保持することを可能
とする抗原性血液細胞の固相化方法はいまだに提案され
ていない。また、抗原性の保持に関する研究のほとんど
は、赤血球を材料にしており、輸血学的重要性にもかか
わらず、血小板における多数の抗原型を長期間安定に保
持された例はない。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、かかる事情に
鑑み、本発明の課題は、第一に、固相化支持体への吸着
性に優れ、アナライトと特異的な結合性を長期間安定に
保持できる固相免疫検査における抗原細胞の保存方法を
提供することにある。第二に、血小板における多数の抗
原型を長期間安定に保持することのできる固相免疫検査
における抗原細胞の保存方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、抗原細胞を物理的吸着による結合力及び
化学的架橋による結合力を最適に組み合わせた処理によ
って固相化し、これを保存液に接触させて保存する方法
を採用した。

【００１３】すなわち、本発明によれば、抗原細胞を固
相化支持体に物理的吸着処理によって結合させる工程
と、前記抗原細胞が結合した固相化支持体を化学的架橋
処理する工程と、前記化学的架橋処理された固相化支持
体上の抗原細胞を保存用液と接触させることにより安定
化する工程とを具備することを特徴とする固相免疫検査
における抗原細胞の保存方法が提供される。以下本発明
を詳細に説明する。まず、本発明の方法を遂行するに当
たって、抗原細胞を固相化支持体に物理的吸着処理によ
って結合させる。

【００１４】本発明における抗原細胞は、細胞表面に免
疫学的に活性を有する抗原を表現している組織抗原のす
べてが適用できる。例えば、骨髄、ひ臓、腎臓、肝臓、
内皮、角膜、悪性腫瘍、人毛のような体内器官を構成す
る細胞や、血小板、赤血球、白血球等の血液成分を構成
する細胞が挙げられるが、必要に応じて、これらの培養
物、破砕物或いは溶解物も有効に適用できる。

【００１５】本発明における抗原細胞が既知の抗原型か
らなる赤血球もしくは血小板である場合には、種々のＡ
ＢＯ式血液型と非特異的に反応するのを防止するため
に、通常、Ｏ型の血液が使用される。更に、検査対象が
血小板特有の抗原型に関するものである場合には、細胞
表面に存在するＨＬＡ抗原を失活させて用いるのが好ま
しい。さもなければ、患者サンプル中の各種ＨＬＡ抗体
とも反応して、型判定を誤らせるからである。また、特
に血液から血小板を精製する際には、採血後３０分以上
放置した血液を用いると、遠心処理において赤血球が混
入するのを有効に回避することができる。

【００１６】本発明における固相化支持体の形状として
は、検査用サンプル及び試薬を受容可能な凹部分、或い
は浸漬可能な表面を有するものであればいずれのものも
用いることができる。具体的には、例えば、マイクロプ
レート、試験管、又は箱型キュベット等の反応容器、或
いはガラススライド、フィルター、繊維、フロー管路等
の試験用具などを挙げることができる。これら固相化支
持体の面形状は固相化する抗原の特性、検査項目、検査
用試薬等に応じて変更することができる。例えば検査用
試薬として沈降性マーカーセルを用いる場合には、底面
がＵ字型ないしＶ字型の反応容器等を好ましく用いるこ
とができ、特にマイクロプレートを好ましく用いること
ができる。また、発色反応や発光反応を利用する検査に
おいては、反応容器の面形状は問わず、いずれの面形状
を有する試験用具等も用いることができる。

【００１７】また、本発明の固相化支持体の材質として
は、物理吸着性を有するものが用いられる。具体的に
は、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン又はポリ塩化
ビニル等のプラスチック類を好ましく用いることができ
る。また、通常の材質のものに、物理吸着性を付与する
ような種々の電気的、物理的或いは化学的処理を施した
ものも好ましく用いることができる。例えば、ガラス製
表面をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルピロ
リドン（ＰＶＰ）、カチオン染料等の公知の電荷性物質
を被覆処理して用いることができる。更に、前記プラス
チック製のものをこれらの物質で処理し、物理吸着能を
増強させることも可能である。例えば、ポリスチレン性
のＵ字状ウェルの物理吸着能を増強したマイクロプレー
トとしては、ＮＵＮＣ社のモジュールプレートＭａｘｉ
ｓｏｒｐ（ＩｇＧ結合能；４００ｎｇ／ｃｍ² ）、Ｐｏ
ｌｙｓｏｒｐ（１００ｎｇ／ｃｍ² ＩｇＧ）、或いはグ
ライナー社のイミュロン６００（６００ｎｇ／ｃｍ² Ｉ
ｇＧ）、イミュロン２００（２００ｎｇ／ｃｍ² Ｉｇ
Ｇ）等が挙げられる。しかし、これらの物質による固相
化支持体の処理は、固相後に影響を与えるような高濃度
で行ってはいけない。

【００１８】本発明における物理的吸着処理は、抗原細
胞の有効量を細胞浮遊液に懸濁し、固相化支持体と接触
させ、室温で所定時間放置、或いは高速遠心処理するこ
とによって行うことができる。固相化のための抗原細胞
の有効量は、固相すべき支持体表面に少なくとも１層の
抗原性の膜が形成し得る程度である。かかる有効量は固
相化する抗原の種類や性状、或いは支持体の物理吸着性
能や固相面積によって異なるので、適宜設定し直して、
固相効率の良い細胞濃度及び添加量を選択すればよい。
特に短時間で物理吸着させたい場合等は、高速遠心処理
を行うことが好ましい。本発明の抗原細胞を浮遊させる
ための細胞浮遊液は、固相化する細胞の特性に応じて公
知のものの中から適宜選択することができる。具体的に
は、例えば、各種の緩衝液或いは生理食塩水等を用いる
ことができる。また、特に本発明で好ましく用いられる
血小板の浮遊液としては、ＡＣＤ液等を用いることがで
きる。処理後は必要に応じて支持体を精製水、緩衝液、
生理食塩水、血液用希釈液等の適当な洗浄溶液で洗浄す
る。この物理的吸着処理後に、前記抗原細胞が結合した
固相化支持体に対して化学的架橋処理を施す。

【００１９】化学的架橋処理を物理的吸着処理と同時に
またはそれ以前に開始させると、先ず抗原細胞内での化
学的架橋が進行してしまい、支持体に対する物理的吸着
ないし化学的架橋が形成困難となるからである。

【００２０】本発明における化学的架橋処理は、化学的
架橋剤を適当な緩衝液或いは生理食塩水等に溶解し、表
面に抗原細胞が固相化された固相化支持体と接触させる
ことによって行われる。

【００２１】本発明の化学的架橋剤としては、それ自体
抗原抗体反応を起こさず、かつ荷電的吸着能を持たない
ものであればいずれのものも用いることができる。しか
しホルマリン、グルタール（グルタルアルデヒド）、又
はパラホルムアルデヒド等のアルデヒド系化学物質を用
いることが好ましい。抗原細胞の固相化支持体への結合
を強化すると共に、組織学的固定効果も得られるからで
ある。特に好ましくはグルタルアルデヒドである。これ
らのアルデヒド系物質の使用濃度は各特性に応じて異な
る。ホルマリン含有溶液を用いる場合は、添加後の最終
濃度は１．０〜５．０％の範囲になることが好ましい。
５．０を越えると抗原性が失活し、また、固相化後もア
ルデヒドに由来する非特異的反応が生じやすくなるから
である。一方、１．０未満では洗浄中、保存処理中、又
は保存期間中に、ウェル表面から細胞の一部が剥がれて
しまうからである。より好ましくは２．５〜４．５％の
範囲である。また、グルタール含有溶液を使用する場合
の有効グルタール濃度の範囲は、０．００３〜０．０６
％が好ましい。０．００３％未満では固定力が著しく低
下し、０．０６％を越えると抗原性が失活してしまうか
らである。より好ましくは０．００５〜０．０２％であ
る。かかる有効濃度範囲内において、使用する固相化支
持体の物理吸着力に応じてアルデヒド濃度を調節するこ
とにより安定した固相化を維持することができる。

【００２２】また、使用目的等に応じて複数種のアルデ
ヒド混合液も有効に用いることができる。この場合は最
適濃度範囲を検討してから行うことが好ましい。アルデ
ヒド濃度が適切か否かの判定は、処理後の洗浄液中或い
は洗浄後添加される保存液中に固相化されたはずの抗原
細胞が浮遊してくるか否かで行うことができる。

【００２３】このようにして得られた溶液を固相化支持
体と接触させる方法としては、固相化支持体上にピペッ
トで分注する方法、或いはこの溶液中に固相化支持体を
浸漬する方法を好ましく用いることができる。但しこれ
らの方法を遂行する際にはなるべく静かに行うよう注意
しなければならない。液流によって細胞が剥がれてしま
うからである。接触温度は４〜３７℃の範囲が好まし
い。また接触時間は１０分〜５０分の範囲が好ましく、
２０分〜４０分の範囲がより好ましい。接触時間が長す
ぎると、必要以上に抗原細胞の組織学的固定化が進行し
たり、抗原性を失活させたりする恐れがあるからであ
る。従って、所定時間後ただちに適当な洗浄用液で支持
体を洗浄することが必要である。本発明においては、抗
原細胞の長期に亘る安定な保存を可能とするために、前
記化学的架橋処理した固相化支持体上の抗原細胞を保存
用液と接触させる。

【００２４】本発明における保存用液としては、糖類及
び添加剤を含有するものであればいずれのものを用いて
もよい。糖類としては、単糖類、多糖類、糖アルコール
などいずれのものも好ましく用いることができる。しか
し、特に経済性或いは入手容易性等の観点から、サッカ
ローズ、ラクトーズ、またはデキストラン等を好ましく
用いることができる。

【００２５】前記糖類を溶解するための溶媒としては、
細胞の物理化学的性状を変質させないものであればいず
れのものを用いてもよい。しかし、細胞の物理化学的性
状を変質させない程度に緩衝能を有する緩衝液、或いは
生理食塩水を好ましく用いることができる。溶媒に対す
る前記糖類の含有量は、０．５％〜１０％が好ましい。
特に、経済性及び保存安定性の観点から、１〜５％がよ
り好ましい。

【００２６】また、添加剤としては、公知のもののいず
れを用いてもよい。しかし、血清アルブミン、ゼラチ
ン、アジ化ナトリウム等を好ましく用いることができ、
その中でもアジ化ナトリウムのような保存剤を用いるこ
とが最も好ましい。保存用液中の各種添加剤の濃度及び
容量は、細胞の保存性能と関連するため、保存される細
胞の種類や容量に応じて適宜設定することが好ましい。

【００２７】本発明の保存用液の具体例としては、例え
ば１％サッカローズ及び０．１％ＮａＮ₃を含む無菌生
理食塩水が挙げられる。この保存用液は、経済性及び保
存性の両方を共に満足する有用な組成を含有するものの
１つである。このときの糖濃度及びＮａＮ₃濃度の有効
範囲はそれぞれ１〜８％及び０．０１〜０．５％であ
る。

【００２８】このようにして得られた保存用液に細胞を
接触させた後、４〜３７℃で適当な時間インキュベート
する。これにより保存用液中の糖成分が細胞の分子間に
浸透して物理化学的変性が起こり難くなる。本発明にお
いて、細胞及び保存用液を接触させた後の保存方法とし
ては、保存液中に保存する方法、或いは乾燥して保存す
る方法が用いられる。

【００２９】保存液中に保存する場合の保存温度は、−
５〜１０℃が好ましく、４℃が最も好ましい。従って、
冷蔵保存或いは冷凍保存することが好ましい。また、保
存液中で保存する場合には、保存期間中に水分が蒸発し
たり、漏れでたりしないように注意する必要がある。保
存液の量が変化するにつれ、保存液の濃度が変化し、反
応性が不均一となるからである。また、蒸発或いは漏れ
を防止するために、固相化支持体を湿潤された布等と共
に気密性の函体に格納してもよい。

【００３０】乾燥して保存する場合の乾燥方法として
は、自然乾燥或いは減圧乾燥等いずれの乾燥方法を用い
てもよいが、自然乾燥することが好ましい。自然乾燥し
た支持体を保存する場合の温度としては、熱的変性が生
じない範囲であればいずれの温度でもよいが、室温で保
存することが好ましい。また、乾燥状態で保存する場合
には、酸化雰囲気や湿気に触れないように保存しなけれ
ばならない。従って、乾燥剤を作用させるか、湿度ゼロ
の気体を封入してパックするか、或いは真空パックする
のが好ましい。

【００３１】いずれの方法を用いる場合にも、各方法の
欠点をより有効に回避すべく、支持体を適当なシーリン
グ材によって密封し、温度変化の少ない場所に収納する
ことがより好ましい。特に固相化支持体としてマイクロ
プレートを使用する場合は、プレート用シールを好まし
く用いることができる。就中、８×１または８×２個の
ような少数ウェルからなるモジュールプレートの場合に
は、特性キャップを用いることが好ましい。これを用い
て密栓することにより、携帯性及び使い勝手が格段に向
上するからである。以上の保存条件で処理された抗原固
相化支持体は、保存液中または乾燥状態で半永久的に固
相状態及び抗原性を保持することができる。以下、本発
明の方法によって保存された固相化細胞の固相免疫検査
における利用の一例を示す。

【００３２】固相化支持体に施されたシーリング或いは
栓を解除し、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む洗浄
用液で十分洗浄する。この洗浄処理によって、保存期間
中に崩れたり剥がれたりした余分な付着分、或いは乱暴
な取扱い又は不十分な固相化等に伴う抗原細胞の遊離部
分を有効に除去することができる。また、抗原固相化部
分に影響を与えるような支持体における静電気の帯電を
も有効に除去することができる。

【００３３】洗浄した固相化支持体を、血清、血漿又は
全血等の検査対象となる患者サンプルと接触させ、室温
ないし３７℃で所要反応時間インキュベートする。これ
により固相化支持体上の細胞表面に存在する各種抗原と
サンプル中の該抗原に特異的な抗体とが結合する。反応
後の支持体は、通常、未反応成分を取り除くのに洗浄処
理するが、ホモジニアスな反応系では必要としない。

【００３４】次に支持体を、抗体の一部の型もしくは全
ての型に特異的親和性のある物質及びマーカー物質の複
合体と共にインキュベートする。抗体の一部の型もしく
は全ての型に特異的親和性のある物質としては、抗イム
ノグロブリン抗体を用いることができる。ここで使用す
る抗体のイムノグロブリンのタイプは検査すべきサンプ
ル中の抗体と同タイプとする。マーカー物質は、磁性
体、蛍光体、放射性同位体、可視性粒子等それ自体が客
観的にカウントできる物質、或いは基質ないし触媒と反
応する発色性又は発光性物質の群から選択することがで
きる。インキュベート温度は、室温〜３７℃の範囲が好
ましい。抗ＩｇＧ抗体を用いる場合は４時間の反応で飽
和状態となるが、反応パターンが安定になるのに更に時
間がかかるので、オーバーナイトで反応させることが好
ましい。

【００３５】インキュベート後、未反応の成分を洗浄除
去した固相化支持体を用いて、マーカー物質の有無ない
し数量を検出する。検出方法としては、公知の測定手段
を用いることができる。特に、マーカー物質が粒径２〜
１０μの範囲内の可視性粒子である場合には、肉眼判定
により定性検査することができる。以下、本発明の実施
例を詳細に説明するが本発明はこれらに限定されるもの
ではない。

【００３６】

【実施例】

（実施例１）ホルマリンを用いた場合の固相化及び保
存効果（１）血小板固相化プレートの作成

【００３７】９名の供血者（血液型はいずれもＯ型であ
る）から採血した全血７容及びＡＣＤ液１容を混合し、
得られた混合液をそれぞれ２６０×ｇで遠心処理するこ
とにより、血小板濃厚血漿（ＰｌａｔｅｌｅｔＲｉｃ
ｈＰｌａｓｍａ；ＰＲＰ）を得た。得られたＰＲＰ９
容に対し、更にＡＣＤ液１容を加えて、１１００×ｇで
遠心し、濃縮血小板（ＰｌａｔｅｌｅｔＣｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｅ；ＰＣ）を得た。得られたＰＣを生理食塩水
（生食水）で洗浄した後、２９％（ｗ／ｖ）クロロキン
を含むｐＨ５．０のＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液中に室温で３
０分間放置し、ＰＣが有するＨＬＡ抗原を失活させた。
失活させたＰＣを生食水で洗浄した後、生食水で８×１
０⁴ 個／μｌに調整し、これをＵ底マイクロプレート
（Ｎｕｎｃ社，モジュールタイプ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ）
に５０μｌ／ウェル分注した。６７０×ｇで遠心処理
後、種々の濃度のホルマリンを含むｐＨ６．７のＰＢＳ
溶液を各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ静かに添加し
た。室温で２０分間放置した後、ただちに生食水で洗浄
することにより血小板を必要程度固相化したマイクロプ
レートを得た。得られたプレートに保存液として１％サ
ッカローズ及び０．１％ＮａＮ₃を含む生食水を５０μ
ｌ／ウェル添加した後、２通りの方法で保存した。即
ち、一方はプレートをそのままシーリングし、４℃の保
冷庫で１５か月間保存した。他方は、３７℃で２４時間
自然乾燥させた後に乾燥剤と共にアルミ袋に封入して室
温で６か月間保存した。（２）抗血小板抗体の検出

【００３８】上記２つの方法で保存した血小板固相化プ
レートをそれぞれ開封した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含む生食水で十分洗浄した。排液後、改めて同洗浄
水を２５μｌ／ウェル分注した。分析すべき各種抗原型
に対する抗体を含んでいる血清をそれぞれ生食水で約４
倍希釈した。これに３，０００〜１０，０００ｒ．ｐ．
ｍ．の超高速な遠心処理を施すことによりデブリス、フ
ィブリン等の沈降成分を沈め、得られた上清を２５μｌ
／ウェル分注した。マイクロプレートを軽く振盪し、室
温で３時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
む生食水で洗浄し、排液後、この洗浄水を２５μｌ／ウ
ェル分注した。抗ヒトＩｇＧを羊血球に被覆したマーカ
ーセル（オリンパス光学工業（株）社製）を２５μｌ／
ウェル分注して、室温で一晩反応させた。オーバーナイ
トしたウェル底部の反応パターンを目視判定した。な
お、各反応工程中は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む
生食水で湿潤させたタオルを置いた湿潤箱内にマイクロ
プレートを収容して、蒸発を有効に防止した。下記表１
に７％ホルマリン含有ＰＢＳ溶液（最終ホルマリン濃度
４．７％）により固相化されたマイクロプレートの保存
後の反応性を示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】マイクロプレートのウェル底面を観察した
際に、ウェルにほぼ一様にマーカーセルが結合した分布
パターンを陽性（＋）、ウェル中央部にマーカーセルの
ほとんどが沈降した分布パターンを陰性（−）と判定し
た。表中の（ＮＴ）は、未検査の抗原型を示す。また、
対照としてアルデヒドを使用しない従来の物理吸着のみ
により固相化されたマイクロプレートの保存後の反応性
を示す。

【００４１】上記表１に示した通り、９人の血小板の各
種抗原の抗原性は長期保存後にも全く変化しなかった。
特に、元来抗原性が弱いとされる抗原型ＨＰＡ−２ａ、
ＨＰＡ−２ｂ、ＨＰＡ−５ａ、及びＨＰＡ−５ｂについ
ても、長期間抗原性が保存されているため、かかる抗原
型を有する血小板を用いる輸血検査に非常に有用であ
る。更に、血小板固相後に乾燥処理しても抗原性が変化
しないことから、室温で極めて長期間保存することがで
きる。

【００４２】また、添加するホルマリン濃度を種々変更
した比較結果から、ウェル内の最終的ホルマリン濃度の
有効範囲は１．０〜５．０％と判明した。この濃度範囲
を越える場合には抗原性が失活し、不足濃度では洗浄中
または保存処理中もしくは保存期間中に、ウェル表面か
ら細胞の一部が剥がれる傾向を示した。かかる不都合を
より確実に回避するホルマリンの最終濃度は、２．５〜
４．５％である。

【００４３】なお、添加するホルマリン濃度に相関し
て、陰性を示す分布パターン中に非特異反応とみられる
マーカーセルの広がりが観察された。また、マイクロプ
レートの種類を結合能の低いタイプ（Ｎｕｎｃ社，Ｐｏ
ｌｙｓｏｒｐ）に変更した場合の有効ＰＣ濃度は１５
０，０００個／μｌだった。各種物理吸着力の異なるマ
イクロプレートに対するＰＣ添加濃度は５０，０００〜
２００，０００個／μｌである。（実施例２）グルタールを用いた場合の固相化及び保
存効果

【００４４】実施例１における９名とは異なる３名の供
血者（血液型はいずれもＯ型である）に由来する血小板
を使用し、添加するアルデヒドをグルタールに変えた点
を除いて、第１実施例と同様に処理した。

【００４５】下記表２に０．０２％グルタール含有ＰＢ
Ｓ溶液により固相化されたマイクロプレートの保存後の
反応性を示す。判定基準並びに従来法と比較する点は実
施例１と同様である。

【００４６】

【表２】

【００４７】上記表２に示した通り、３人の血小板の各
種血小板抗原は、グルタールによる固相化処理を加える
ことにより長期に安定化され、保存前後の抗原性が全く
変化しなかった。

【００４８】また、ホルマリンを用いた場合と異なり、
グルタールを用いた固相化プレートによる反応結果では
非特異反応に伴うマーカーセルの広がりは観察されなか
った。更にＰＢＳ溶液中のグルタール濃度を種々変更し
て得た血小板固相化プレートの検出結果から、ＰＢＳ溶
液中０．００３％未満の濃度では固定力が著しく低下
し、０．０６％を越える濃度で抗原性が失活する傾向が
みられた。このことから、添加後の最終グルタール濃度
は０．００３〜０．０６％が有効範囲であり、好ましく
は０．００５〜０．０２％である。実施例３保存用液の組成の検討

【００４９】保存用液の組成について検討した。実施例
１及び２と同様にして得た血小板固相化プレートの各ウ
ェルに、従来の無菌生理食塩水と複数種類の糖類溶液の
それぞれを組み合わせた保存用液を添加して、保存用液
中に４℃で長期保存した。所定期間後にプレートを取り
出し、上記実施例と同様にして抗原性の低下の有無を調
べた。結果を下記表３に示す。

【００５０】

【表３】

【００５１】上記表３から明らかなように本発明の固相
化方法による抗原固相化プレートは、極めて単純な組成
の保存用液によって長期保存が達成されることがわか
る。また、保存用液中のサッカローズ濃度を種々変更し
たところ、保存用糖類の有効濃度範囲は０．５％〜１０
％であることがわかった。サッカローズのかわりにラク
トーズを使用しても、同様の保存安定性が得られた。更
に、糖類と保存剤を含む単純な組成によると、１５か月
を経過しても依然として抗原性及び吸着性が変化してい
ないことも判明しているので、本発明の方法を採用した
固相化プレートは半永久的に保存しかつ使用可能と考え
られる。実施例３においてはＮａＮ₃を用いているが、
他の種々の添加剤を複数含有させて使用する場合にも、
同様の保存安定性を得ることができる可能性がある。

【００５２】

【発明の効果】本発明の保存方法は、物理吸着的処理及
び化学架橋的処理を適切に組み合わせているため、物理
吸着のみを利用して固相化する場合よりも、抗原細胞を
固相化支持体に強固に結合することができる。また、物
理吸着性のみを増強させた場合に生じるような非特異的
反応性も防止することができる。更に、好適濃度のアル
デヒドで処理することにより、抗原性の破壊ないし減退
を有効に防止しながら、抗原細胞の組織学的安定性を向
上することができる。特に、本発明の保存方法は、抗原
細胞に対する化学的架橋処理を物理的吸着処理の後に行
うことにより、固相化支持体に対する物理的吸着ないし
化学的架橋が形成され易くなるという効果も奏する。ま
た、本発明の保存方法は、抗原細胞を保存用液と接触さ
せる前に架橋剤を除去することで、抗原細胞および抗原
に対して不利益となる余分な影響を及ぼすことがない。
また本発明の保存方法は、血小板に関する多種類の抗原
の抗原性の強弱が抗原型により異なっている場合にも、
安定にその抗原性を保持することができる。

【００５３】従って、本発明の保存方法により保存され
た固相化細胞を用いると、常時信頼性のある検査結果が
得られる。また本発明の固相化細胞は強固に固相化され
ており、かつ組織学的安定性を有しているため、簡素な
保存用液を用いて、乾燥状態でも長期間保存でき、非常
に経済的なものである。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原細胞を固相化支持体に物理的吸着処
理によって結合させる工程と、前記抗原細胞が結合した
固相化支持体に、荷電的吸着能をもたない化学的架橋処
理剤を接触させることによって、前記抗原細胞を前記固
相化支持体に架橋する工程と、化学的架橋処理剤を固相
化支持体から除去した後に、前記化学的架橋処理された
固相化支持体上の抗原細胞を保存用液と接触させること
により安定化する工程とを具備することを特徴とする固
相免疫検査における抗原細胞の保存方法。
【請求項２】前記化学的架橋処理が、アルデヒド処理
である請求項１に記載の保存方法。
【請求項３】前記アルデヒド処理に用いるアルデヒド
が、グルタルアルデヒドである請求項２に記載の保存方
法。
【請求項４】前記化学的架橋処理剤の使用濃度を、そ
の有効濃度範囲において、前記固相化支持体の物理吸着
力に応じて調節することを特徴とする請求項１に記載の
保存方法。
【請求項５】前記物理的吸着処理が、物理吸着性を有
する材質で構成される固相支持体に、前記抗原細胞を接
触させることにより行われることを特徴とする請求項１
に記載の保存方法。
【請求項６】前記物理的吸着処理が、電気的或いは化
学的処理を施すことで物理吸着性を付与した固相支持体
に、前記抗原細胞を接触させることによって行われるこ
とを特徴とする請求項１に記載の保存方法。
【請求項７】前記物理的吸着処理が、固相後に影響を
与えない程度に吸着力を増強された固相化支持体を用い
て行われることを特徴とする請求項６に記載の保存方
法。
【請求項８】前記抗原細胞が、血液成分を構成する細
胞であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に
記載の保存方法。
【請求項９】前記抗原細胞が、血小板であることを特
徴とする請求項８に記載の保存方法。
【請求項１０】前記保存用液と接触させた固相化支持
体を、携帯し得る状態に密封処理する工程を更に含むこ
とを特徴とする請求項１に記載の保存方法。