DK142824B - Fremgangsmåde til fremstilling af en objektbærer med påført immunologisk reaktivt materiale i lyofiliseret og selvhæftende form. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆ66ELSESSKRIFT 1^282^+ DANMARK («) int.ci.3 G 01 n 33/sa «(21) Antegning nr. 6398/74 (22) I nd tover« cton 9* dec. 1974 (24) Lebedag g. dec. 1974 (44) Antegningen fremtogt og

fremiaeggetoesekrlftet offentiiggjort den 2. f eb . 1 98I

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begeret fre den

10. dec. 1973# 17272/73* CH

<71) p. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. AKTIENGESELLS CHAFT, Grenzacherstrasee 124-1 847 Postfach, CH-4002 Basel, CH.

(72) Opfinder: Rolf Dietrich, 15 Akazienweg, Neu-Aesch, CH.

(74) Fuldmatgtig under sagens behandling:

Plougmann & Vlngtoft Patentbureau._ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af en objektbærer med påført Immuno» logisk reaktivt materiale i lyofiliseret og selvbæftende form.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en objektbærer med påført immunologisk materiale i lyofiliseret og selvhæftende form.

Diagnostiske metoder til mennesker og dyr betjener sig i tiltagende omfang af immunologiske principper. Disse reaktioner anvendes til påvisning af antistoffer eller antigener i det levende væsens legemsvæsker. Et antigen er et fremmed stof, som, når det appliceres til det levende væsen, bevirker dannelsen af visse opløselige eller'cel-lebundne stoffer, der betegnes antistoffer. Et hvilket som helst stof, f.eks. et protein, som normalt ikke er til stede i et bestemt levende væsen, kan forårsage dannelsen af antistoffer, når det under egnede betingelser trænger ind i eller appliceres til et levende væsen.

2 U2824

De dannede antistoffer kan reagere med antigenerne in vitro og in vivo, hvorved de kan udøve en beskyttelsesfunktion ved en infektion.

Immunologiske testmetoder beror på denne antigen-antistof-reaktion, og ved testmetoderne bekræftes eller bestemmes tilstedeværelsen af et antigen eller et antistof ved, at man bringer det tilsvarende antistof eller det tilsvarende antigen i kontakt med en legemsvæske fra det levende væsen, for det meste blodserum, blodplasma, urin eller en specielt behandlet blodekstrakt. Der kan imidlertid også anvendes andre legemsvæsker. Ved tilstedeværelse af det tilsvarende antistof eller antigen i det levende væsens legemsvæske dannes et antigen-antistof-complex, som bliver synligt ved f.eks. farveændring, udfældning eller agglutination, eller som kan konstateres ved radioaktivitets- eller fluorescensmåling.

Ved sådanne metoder skal de ofte følsomme immunologisk reaktive materialer oplagres og anbringes på en bærer. Der kan således f.eks. anvendes suspensioner af disse materialer, men dette medfører ulemper med hensyn til begrænset holdbarhed og en for brugeren arbejdskrævende påføring på bæreren. Sådanne suspensioner skal nemlig opbevares i køleskab og ved anvendelsen anbringes på bæreren ved hjælp af en mikropipette eller en podeske og derefter tørres. Ved anvendelse af lyofiliserede suspensioner forbedres holdbarheden ganske vist væsentligt, men ulempen med den tidsrøvende påføring på bæreren afhjælpes ikke.

Til afhjælpning af den sidstnævnte ulempe er det blevet forsøgt at stille en bærer med allerede tørret påstrygning af et immunologisk reaktivt materiale til rådighed for brugeren. Disse bærere har den fordel, at de er brugsfærdige efter simpel optøning af på-strygningerne. Imidlertid skal sådanne bærere opbevares ved -20°C, da holdbarheden ellers er yderst ringe.

Tysk fremlæggelsesskrift nr. 1.162.971 beskriver derimod en bærer med påført reaktivt materiale (tuberkulinholdige småplader) i lyo-filiseret form. Det lyofiliserede materiale (tuberkulinsmåplader) er imidlertid helt klart ikke selvhæftende, men holdes fast ved gnidningskræfter efter indpresning i fordybningen i en elastisk formstoffolie.

3 14282Λ

Der er nu med den foreliggende opfindelse tilvejebragt en fremgangsmåde, som gør det muligt at påføre immunologisk reaktive materialer i lyofiliseret og selvhæftende form på en bærer, hvorved den lyofiliserede suspensions fordele med hensyn til holdbarhed kombineres med de tørrede påstrygningers fordele med hensyn til forenklet og arbejdssparende forberedelse og manipulering.

Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af en objektbærer med påført immunologisk reaktivt materiale i selvhæftende og lyofiliseret form, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man anbringer en suspension af et immunologisk reaktivt materiale på objektbæreren, underkaster suspensionen en tørringsproces, som afbrydes, medens der endnu er oprindeligt påført suspensionsvæske til stede, og derefter lyofiliserer.

Udtrykket "immunologisk reaktive materialer" betegner sådanne materialer, f.eks. proteiner, peptider, polysaccharider osv. , som er af afgørende betydning for en immunologisk bestemmelse, hvilket betyder, at disse materialers tilstedeværelse er den bestemmende faktor ved immunologiske testmetoder. Disse materialer kan påvises i legemsvæsker fra mennesker og dyr under anvendelse af immunologiske principper, eller de kan tjene til påvisningen.

Særlig egnede immunologisk reaktive materialer er patogene og fakultativt patogene organismer, f.eks. parasitter, protozoer, bakterier og vira eller deres immunologisk aktive komponenter, isolerede antistoffer fra mennesker og dyr, serumbestanddele, toxiner, hormoner, enzymer, alkaloider, celle- og vævekstrakter, stoffer med lille molekylvægt, f.eks. insulin, angiotensin og urokinase, biogene aminer, blodceller eller partikler, som kemisk eller fysisk er belagt med antigen eller antistof, f.eks. erythrocyter eller latex-partikler.

Ganske særlig egnede materialer til sådanne diagnostiske bestemmelsesmetoder er toxoplasmer, f.eks. Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi og Entamoeba histolytica.

Til den foreliggende opfindelses formål egner sig alle arter af bærere, f.eks. objektglas, film osv., som anvendes på det medicinske område eller i laboratorier. Bærerne kan bestå af et hvilket som 4 142824 helst egnet materiale, f.eks. glas eller formstof, og er med fordel gennemsigtige. Særlig foretrukne bærere er objektglas med mindst én fordybning til optagelse af præparatet.

I en foretrukken udføreIsesform er bæreren et objektglas, eller en lignende objektbærer, der både på oversiden og undersiden har fordybninger, som svarer til hinanden. Fordybningerne på oversiden tjener til optagelse af det immunologisk reaktive materiale, medens fordybningerne på undersiden tjener til beskyttelse mod mekanisk beskadigelse af overfladen, f.eks. ridsning, hvilken beskadigelse ville forringe de optiske egenskaber. I den ene ende er objektglasset med fordel udstyret med et skrivefelt.

Objektglasset eller -bæreren indeholder hensigtsmæssigt flere fordybninger og muliggør således en kvalitativ undersøgelse af flere sera eller en kvantitativ undersøgelse af flere fortyndingsrækker af et serum. Endvidere egner objektglasset sig til påføring af flere forskellige immunologiske reaktive materialer og således til samtidig bestemmelse af en undersøgelsesprøve med hensyn til forskellige antigener eller antistoffer.

Som suspensionsvæske egner sig især vandige opløsninger, f.eks. en saccharose - eller en kogsaltopløsning. Påføringens art er ikke kritisk, men det foretrækkes dog at påføre suspensionen dråbevis· på bæreren. Temperaturen ved tørringen afhænger af den påførte suspensions sammensætning og reagensernes følsomhed. Tørringen udføres imidlertid med fordel ved en temperatur mellem 0° - 100°C, fortrinsvis mellem 20° -40°C. Tørringstiden afhænger af det suspenderede materiales sedimentationshastighed og temperaturen, men er i .reglen 5 minutter. Lyofiliseringen sker på sædvanlig måde i et sædvanligt frysetørreapparat. Den på denne måde fremstillede belagte bærer kan opbevares ved temperaturer over 0°C og kræver derfor ingen frysekonservering.

Den foreliggende opfindelse kan udnyttes ved en hvilken som helst diagnostisk metode, hvor et immunologisk reaktivt materiale påføres en bærer i lyofiliseret form. Med fordel anvendes bæreren fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen imidlertid 142824 5 i form af et objektglas med lyofiliseret antigen, ved en immuno-fluorescensmetode. Særlig foretrukken er den indirekte immuno-fluorescensmetode.

Til specifik konstatering af antistoffer, som i den menneskelige eller den dyriske organisme dannes mod legemsfremmede (infektionsafværgelse) , eller legemstilhørende (autoagression) stoffer, har den indirekte immunofluorescensmetode nemlig vist sig at være særlig egnet. Ved en sådan metode bringes i et første trin et objektglas med påført antigen sammen med den tilsvarende legemsvæske, og der inkuberes, hvorpå der vaskes. På denne måde kan et til antigenet svarende modificeret gammaglobulin (antistof) reagere med antigenet og således forblive hæftende til objektglasset.

Når sådanne antistoffer er til stede i den prøve, der skal undersøges, påvises i et andet trin deres binding til antigenet med antihumanglobulin, som er forsynet med et fluorescensfarvestof.

Til dette formål sættes det markerede antihuman-globulin på objektglasset, hvorefter der inkuberes og skylles. Det markerede antihuman-globulin reagerer med det modificerede gammaglobulin (antistof), som er bundet til antigenet, således at fluorescensfarvestoffet forbliver hæftende til objektglasset, og den tilsvarende fluorescens kan konstateres mikroskopisk. Eksistensen af fluorescens betyder, at der i den prøve, der undersøges , findes antistoffer, som svarer til de på bæreren påførte antigener, hvilket muliggør diagnosen af sygdomme, der står i relation til sådanne antistoffer eller antigener.

Nedenstående tabel angiver et udvalg af typiske sygdomme eller tilstande, som kan bestemmes ved hjælp af bæreren fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og der er angivet de på bæreren lyofiliserede immunologisk reaktive materialer:

6 14282A

TABEL·

Antigen Sygdom

Toxoplasma gondii Toxoplasmose

Entamoeba histolytica Amoebiasis

Trypanosoma cruzi Chagas

Trypanosoma gambiense/rhodesiense Sovesyge

Leishmania donovani Leishmaniose

Schistosoma mansoni Schistosomiasis

Echinococcus granulosus Echinococcose

Filarier Filarioser

Fasciola hepatica Fasciolosis

Plasmodier Malaria

Candida species Candidiose

Aspergiller Aspergillose

Mycropolyspora faeni/Micromonospora Farmerlunge vulgaris

Treponema pallidum Syfilis

Neisseria gonorrhoeae Gonorrhoe

Neisseria meningitis Meningitis

Brucella abortus Bruzellose

Mycoplasma pneumoniae Pneumonier

Australia-antigen Akut hepatitis

Herpes simplex virus Herpes simplex

Influenza-virus Influenza

Cellekerne Systemisk lupus erythematodes eller Sklerodermi

Cryptococcer Cryptococcose

Torulopsis species Systemisk mykose

7 1*282A

Videre enkeltheder ved opfindelsen anskueliggøres ved nedenstående eksempler:

Eksempel 1.

På et 1 mm tykt objektglas (76 mm x 26 mm) af polystyren med 8 nummererede fordybninger (diameter 6 mm, dybde 0,25 mm) på oversiden.og tilsvarende fordybninger på undersiden samt et skrivefelt anbringes pr. fordybning dråbevis 0,03 ml af en suspension af Toxoplasma gondii (6 millioner/ml) i en 2,5%'s vandig opløsning af saccharose. (Toxoplasmerne er fremstillet efter angivelserne i A. Betz, Bull.

World Hlth. Org. 3!J, 1968 p. 367 - 374.) Det på denne måde belagte objektglas tørres delvis i 30 minutter i et tørre3kab med luftcirkulation ved 37°C. Derefter fryses suspensionen på objektglasset ved hjælp af tøris, hvorpå den lyofiliseres i et egnet frysetørreapparat.

Der fås et brugsfærdigt objektglas med selvhæftende toxoplasmer, som ikke frigøres ved skylning med vand.

Eksempel 2.

På et 1 mm tykt objektglas (76 x 26 mm) af polystyren med 8 nummererede fordybninger (diameter 6 mm, dybde 0,25 mm) på oversiden og tilsvarende fordybninger på undersiden samt et skrivefelt anbringes pr. fordybning dråbevis 0,03 ml af en suspension af Entamoeba histolytica (5000/ml) i en fysiologisk 0,85%'s kogsaltopløsning med 2% "Carbowax". Amøberne er fremstillet efter angivelserne af Morris Goldman, Americal J. Trop. Med. Hyg. Vol 15_ No. 5, 1966 p. 694 - 700 . Det på denne måde belagte objektglas tørres delvis i 30 minutter i et tørreskab med luftcirkulation ved 37°C. Derefter fryses suspensionen på objektglasset ved hjælp af tøris, hvorpå der lyofiliseres i et frysetørreapparat. Der fås et brugsfærdigt objektglas med selvhæftende amøber, som ikke frigøres ved skylning med vand.

Eksempel 3.

Der fremstilles en fortyndingsrække af serummet fra en patient (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600,1/3200 og 1/6400). På det i henhold til eksempel 1 fremstillede objektglas anbringes ved hjælp af en pipette pr. fordybning en dråbe af det fortyndede serum. Derefter inkuberes der i en halv time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med 8 142824 pH-værdi 7,2. En dråbe af en kommerciel suspension af med flueres ceinisothiocyanat markeret antihumanglobulin anbringes i hver fordybning ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i en halv time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Desuden skylles der med destilleret vand og tørres med filtrerpapir. I hver fordybning anbringes en dråbe af en kommerciel immersionsolie, og fluorescensen bestemmes med et immersionsobjektiv i et fluorescensmikroskop. Den maksimale fortynding, ved hvilken fluorescensen endnu kan konstateres, giver en indikation af den relative koncentration af toxoplasma-antistofferne.

Eksempel 4.

Serumprøverne fra otte forskellige patienter fortyndes hver med pufret kogsaltopløsning (pH-værdi 7,2) til et 50 gange så stort rumfang og nummereres 1 - 8. På det ifølge eksempel 1 fremstillede objektglas anbringes i hver af fordybningerne, som er nummereret 1-8, en dråbe af den tilsvarende nummererede, fortyndede serumprøve ved hjælp af en pipette. Derefter inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. En dråbe af en kommerciel suspension af med fluorescein-isothiocyanat markeret antihumanglobulin anbringes i hver fordybning ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Desuden skylles der med destilleret vand og tørres med et filtrerpapir. I hver fordybning anbringes en dråbe af en kommerciel immersionsolie, og fluorescensen bestemmes med et immersionsobjektiv i et fluorescensmikroskop. De fordybninger, i hvilke der konstateres fluorescens, svarer til serumprøver fra patienter, som er inficeret med toxoplasmer.

Eksempel 5.

Der fremstilles en fortyndingsrække af serummet fra en patient a/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 og 1/6400). På det 9 142824 ifølge eksempel 2 fremstillede objektglas påføres med en pipette 1 dråbe af det fortyndede serum pr. fordybning. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37'C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. En dråbe af en kommerciel suspension af med fluoresceinisothiocyanat markeret antihumanglobu-lin anbringes i hver fordybning ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorefter der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Desuden skylles der med destilleret vand og tørres med filtrerpapir. I hver fordybning anbringes en dråbe af en kommerciel immersionsolie, og fluorescensen bestemmes med et immersionsobjektiv i et fluorescensmikroskop. Den maksimale fortynding, ved hvilken fluroescensen endnu kan konstateres, giver en indikation af den relative koncentration af Entamoeba histolytica-antistofferne.

Eksempel 6.

Serumprøverne fra otte forskellige patienter fortyndes hver med pufret kogsaltopløsning (pH-værdi 7,2) til et 50 gange så stort rumfang og nummereres 1 - 8. På det ifølge eksempel 2 fremstillede objektglas anbringes i hver af fordybningerne, som er nummereret 1 -8, en dråbe af de tilsvarende nummererede fortyndede serumprøver ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorefter der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. En dråbe af en kommerciel suspension af med fluoresceinisothiocyanat markeret antihumanglobulin anbringes i hver fordybning ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Desuden skylles der med destilleret vand og tørres med filtrerpapir. I hver fordybning anbringes en dråbe af en kommerciel immersionsolie, og fluorescensen bestemmes med et immersionsobjektiv i et fluorescensmikroskop. De fordybninger, ved hvilke der konstateres en fluorescens, svarer til serumprøver fra patienter, som er inficeret med amøber.

Eksempel 7.

På et 1 mm tykt objektglas (76 mm x 26 mm) af polystyren med 8 num- 10 142824 mererede fordybninger (diameter 6 mm, dybde 0,25 mm) på oversiden og tilsvarende fordybninger på undersiden samt et skrivefelt anbringes pr. fordybning dråbevis 0,03 ml af en suspension af Trypanosoma cru-zi (2 millioner/ml) i en 2,5%'s vandig saccharoseopløsning. (Trypano-somerne er fremstillet efter angivelserne af Allain, D.S. og Kayan G., The Journal of Parasitology Vol 60, No. 1, februar 1974, side 179 - 184).

Det på denne måde belagte objektglas tørres delvis i 30 minutter i et tørreskab med luftcirkulation ved 37°C. Derefter fryses suspensionen på objektglasset ved hjælp af tøris, hvorpå der lyofiliseres i et frysetørreapparat. Der fås et brugsfærdigt objektglas med selvhæftende trypanosomer, som ikke frigøres ved skylning med vand.

Eksempel 8.

Der fremstilles en fortyndingsrække af serummet fra en patient (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 og 1/6400). På det ifølge eksempel 7 fremstillede objektglas anbringes pr. fordybning en dråbe af det fortyndede serum ved hjælp af en pipette. Derefter inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. En dråbe af en kommerciel suspension af med fluoresceinisothiocyanat markeret antihumanglobulin anbringes i hver fordybning ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37°C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Desuden skylles der med destilleret vand og tørres med et filtrerpapir. I hver fordybning anbringes en dråbe af en kommerciel immer-sionsolie, og fluorescensen bestemmes med et immersionsobjektiv i et fluorescensmikroskop. Den maksimale fortynding, ved hvilken der endnu kan konstateres fluorescens, giver en indikation af den relative koncentration af Trypanosoma cruzi-antistof.

Eksempel 9.

Serumprøveme fra otte forskellige patienter fortyndes hver med pufret kogsaltopløsning (pH-værdi 7,2) til et 50 gange så stort 11 142824 rumfang og nummereres 1 - 8. På det ifølge eksempel 7 fremstillede objektglas anbringes i hver af de fordybninger, som er nummereret 1 -8, en dråbe af den tilsvarende nummere'rede fortyndede serumprøve ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37eC i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-vasrdi 7,2. En dråbe af en kommerciel suspension af med fluorescein-isothiocyanat markeret antihumanglobulin anbringes i hver fordybning ved hjælp af en pipette. Derpå inkuberes der i 1/2 time ved 37*C i et fugtigt kammer, hvorpå der vaskes med pufret kogsaltopløsning med pH-værdi 7,2. Desuden skylles der med destilleret vand og tørres med et filtrerpapir. I hver fordybning anbringes en dråbe af en kommerciel immersionsolie, og fluorescensen bestemmes med et immer-sionsobjektiv i et fluorescensmikroskop. De fordybninger, i hvilke der konstateres fluorescens, svarer til serumprøver fra patienter, som er inficeret med Trypanosoma cruzi.

Forsøgsrapport A.

En toxoplasma-suspension (6 x 106/ml) i 2,5%'s vandig saccharose-opløsning dryppes i en mængde på ca. 0,03 ml på en objektbærer af formstof, hvorefter den fryses og lyofiliseres. Efter lyofili-seringen forbliver antigenet godt vedhæftende, men efter neddypning i vand kan der ikke findes toxoplasmer på objektbæreren. Når de belagte objektbærere i overensstemmelse med det ovenstående eksempel 1 underkastes en tørringsbehandling, forbliver antigenet hæftende på objektbærerens overflade også efter flere ganges skylning af overfladen.

Forsøgsrapport B.

I marts 1974 fremstilledes belagte objektbærere i henhold til ovenstående eksempel 1. Efter tørringen blev objektbærererne anbragt i aluminiumhylstre, som var forkølet med tøris. Form-stofpropper, der indeholdt en tørisportion, blev påsat løst, og hylstrene blev anbragt i den i forvejen kølede lyofilisator.

Efter forløbet af lyofiliseringen blev lyofilisationskammeret skyllet med tørt nitrogen, propperne blev hydraulisk presset på hylstrene, og kammeret åbnedes. Lagringen skete ved 2 - 8°C, 25°C, 37°C og 45°C. Hver måned blev der udtaget objektbærere, som blev afprøvet.