DE2455369C3 - Verfahren zur Herstellung eines Objektträgers - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Objektträgers

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DE2455369C3 DE2455369A DE2455369A DE2455369C3 DE 2455369 C3 DE2455369 C3 DE 2455369C3 DE 2455369 A DE2455369 A DE 2455369A DE 2455369 A DE2455369 A DE 2455369A DE 2455369 C3 DE2455369 C3 DE 2455369C3
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Objektträgers mit aufgetragenem immunologisch reaktivem Material in lyophilisierter und selbsthaftender Form.
Diagnostische Verfahren bei Mensch und Tier bedienen sich in zunehmendem Maße immunologischer Prinzipien. Diese Reaktionen werden zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen in den Körperflüssigkeiten des Lebewesens benützt. Immunologische Testverfahren beruhen auf der Antigen-Antikörper-Reaktion. In derartigen Methoden müssen die oft empfindlichen immunologisch reaktiven Materialien gelagert und auf einen Träger aufgetragen werden. So können z. B. Suspensionen dieser Materialien verwendet werden, jedoch mit dem Nachteil, einer begrenzten Haltbarkeit und einer für den Verwender aufwendigen Abtragung auf den Träger. Durch Verwendung von lyophilisierten Suspensionen wird zwar die Haltbarkeit wesentlich verbessert, jedoch wird der Nachteil der zeitraubenden Auftragung auf den Träger nicht aufgehoben.
Die CH-PS 5 19 172 zeigt, daß Flächen, welche denjenigen eines Objektträgers ähnlich sind, unter normalen Umständen einem lyophilisierten immunologischen Material keine ausreichende Haftbarkeit verleihen. Aus dieser Literaturstelle war also keinerlei Anregung dahingehend zu entnehmen, einen Objektträger mit aufgetragenem immunologisch reaktivem Material in lyophilisierter und selbsthaftender Form zu schaffen, wobei die Selbsthaftung auch nach mehrmaliger Spülung mit einem wäßrigen Medium bestehen bleibt.
Im Gegensatz zu dem einfachen Lyophilisationsvorgang ermöglicht ein Trocknungsvorgang immunologisch reaktive Materialien mit ausreichender Haftbarkeit auf Objektträger aufzutragen, vgl. Ärztl. Laboratorium, Band 18,1972, Heft 4, S. 133 - 142.
Objektträger mit aufgetrocknetem immunologisch reaktivem Material besitzen jedoch den erheblichen Nachteil einer geringen Haltbarkeit und müssen bei - 20°C gelagert werden.
Die DEAS 15 98 859 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von für immunochemische Bestimmungen verwendbaren Reagenzmitteln in Form von feinteiligen festen Trägern aus einem Kunststofflatex, wobei man die Trägerteilchen zunächst ein gegenüber der immunochemischen Reaktion inertes und an dieser nicht beteiligtes Protein adsorbieren lassen muß. Diese Literaturstelle führt von dem Gedanken weg, daß ein Kunststofflager und sei es selbst in feinteüiger Form als solcher ein immunologisch reaktives Material festhalten kann.
Die US-PS 30 88 875 offenbart als Träger für das immunologische Reagens nur Latexteilchen in einer
ίο Größenordnung von 0,15 bis 0,25 μίτι. Solche feinteiligen und damit adsorptionsfähigen Latexteilchen sind aber nicht vergleichbar mit Objektträgern, die üblicherweise aus Glas jedoch auch aus Kunststoff bestehen können. Im Gegensatz zu solchen feinteiligen Latexteilchen, die auf Grund ihrer Teilchengröße eine Adsorptionskraft haben, besitzt ein Objektträger, der im Vergleich zu Latexteilchen nur eine minimale Kontaktfläche für das immunologisch reaktive Material aufweist, wenn überhaupt dann nur eine ganz untergeordnete Adsorptionsfähigkeit
Erfindungsgemäß wurde nun ein Verfahren gefunden, welches es ermöglicht immunologisch reaktive Materialien in lyophilisierter und selbsthaftender Form auf einen Objektträger aufzutragen, wobei die Vorteile der lyophilisierten Suspension bezüglich der Haltbarkeit, mit den Vorteilen der getrockneten Ausstriche bezüglich vereinfachter und arbeitssparender Vorbereitung und Handhabung vereinigt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Objektträgers mit aufgetragenem immunologisch reaktiven Material in selbsthaftender und lyophilisierter Form ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension immunologisch reaktiven Materials auf den Objektträger aufbringt, antrocknen läßt und anschließend lyophilisiert.
Der Ausdruck »immunologisch reaktive Materialien« bezieht sich auf solche Materialien, wie z. B. Proteine, Peptide, Polysaccharide usw. die für eine immunologische Bestimmung von entscheidender Bedeutung sind, d. h., die Anwesenheit dieser Materialien ist der bestimmende Faktor im immunologischen Testverfahren. Diese Materialien können in Körperflüssigkeiten von Mensch und Tier unter Verwendung von immunologischen Prinzipien nachgewiesen werden, oder zum Nachweis dienen.
Besonders geeignete immunologisch reaktive Materialien sind pathogene und fakultativ pathogene Organismen wie z. B. Parasiten, Protozoen, Bakterien oder Viren bzw. deren immunologisch aktive Komponenten, isolierte Antikörper von Mensch und Tier, Serumbestandteile, Toxine, Hormone, Enzyme, Alkaloide, Zeil- und Gewebeextrakte, Substanzen mit kleinem Molekulargewicht wie z. B. Insulin, Angiotensin und Urokinase, biogene Amine, Blutzellen, mit Antigen oder Antikörper chemisch bzw. physikalisch beschichtete Partikel wie z. B. Erythrocyten oder Latexteilchen.
Ganz besonders zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete Materialien sind Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, und Entamoeba histolytica.
Die Objektträger können aus irgendeinem geeigneten Material, wie beispielsweise Glas oder Kunststoff, bestehen und sind mit Vorteil durchsichtig. Besonders bevorzugt sind Objektträger mit mindestens einer Vertiefung für die Aufnahme des Präparats und auch solche, die sowohl auf der oberen als auch auf der unteren Seite sich entsprechende Vertiefungen aufweisen. Die Vertiefungen auf der oberen Seite dienen zur
Aufnahme des immunologisch reaktiven Materials, während die Vertiefungen an der unteren Seite zum Schütze vor mechanischen Beschädigungen der Oberfläche, wie z. B. Kratzer, welche die optischen Eigenschaften beeinträchtigen, gedacht sind.
Der Objektträger kann mehrere Vertiefungen enthalten und dementsprechend die qualitative Untersuchung von mehreren Seren, bzw. quantitative Untersuchung von mehreren Verdünnungsreihen eines Serums ermöglichen. Zusätzlich eignet sich der Objektträger zum Auftragen von mehreren verschiedenen immunologisch reaktiven Materialien und somit zur gleichzeitigen Bestimmung einer Untersuchungsprobe auf verschiedene Antigene bzw. Antikörper.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das immunologisch reaktive Material zunächst in einer geeigneten Flüssigkeit suspendiert. Als Suspensionsflüssigkeit eignen sich besonders wässerige Lösungen, wie z. B. eine Saccharose — bzw. eine Kochsalzlösung. Die Art der Auftragung ist nicht kritisch, es wird jedoch bevorzugt, die Suspension tropfenweise auf den Träger aufzutragen. Die Temperatur der Antrocknung hängt von der Zusammenstellung der aufgetragenen Suspension und der Empfindlichkeit der Reagenzien ab. Die Antrocknung erfolgt jedoch mit Vorteil bei einer Temperatur zwischen 00C und 100°C, vorzugsweise 20cC und 40°C. Die Zeit der Antrocknung hängt von der Sedimentationsgeschwindigkeit des suspendierten Materials und der Temperatur ab, beträgt jedoch vorzugsweise mindestens 5 Minuten. Die Lyophilisation erfolgt in üblicher Weise in einem herkömmlichen Gefriertrockner. Der auf diese Weise hergestellte beschichtete Träger kann bei Temperaturen über 0°C gelagert werden und benötigt dementsprechend keine Gefrierkonservierung.
Der erfindungsgemäß hergestellte Objektträger kann in jeder diagnostischen Methode, wo ein immunologisch reaktives Material auf einen Träger in lyophilisierter Form aufgetragen wird. Verwendung finden. Mit Vorteil wird jedoch der Objektträger mit lyophilisiertem Antigen, in einer Immunofluoreszenz-Methode benützt.
Die nachstehende Tabelle gibt eine Auswahl von typischen Krankheiten bzw. Zuständen wieder, welche mit Hilfe des erfindungsgemäß hergestellten Trägers bestimmt werden können, unter Angabe der auf dem Träger lyophilisierten immunologisch reaktiven Materialien.
Antigen
Krankheit
Bruceila abortus
Mycoplasma pneumoniae
Australia-Antigen
Herpes simplex-Virus
Influenza-Virus
Zellkerne
Cryptococcen
Torulopsis species
Bruzellose
Pneumonien
akute Hepatitis
Herpes simplex
Grippe
systemischer Lupus
erythematodes oder
Sklerodermie
Cryptococcose
systemische Mykose
Antigen
Krankheit
Toxoplasma gondii
Entamoeba histolytica
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma gambiense/
rhodesiense
Leishmania donovani
Schistosoma mansoni
Echinococcus granulosus
Filarien
Fasciola hepatica
Plasmodien
Candida species
Aspergillen
Mycropolyspora faeni/
Micromonospora vulgaris
Treponema pailidum
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitis
Toxoplasmose
Amoebiasis
Chagas
Schlafkrankheit
Leishmaniose
Schistosomiasis
Echinokokkose
Filariosen
Fasciolosis
Malaria
Candidiose
Aspergillose
Farmerlunge
Syphilis
Gonorrhoe
Meningitis
55
60 An Hand der nachstehenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1
Auf einen 1 mm dicken Objektträger (76 mm χ 26 mm) aus Polystyrol mit 8 numerierten Vertiefungen (Durchmesser 6 mm. Tiefe 0,25 mm) an der oberen Seite und entsprechenden Vertiefungen an der unteren Seite, sowie einem Schriftfeld, wird pro Vertiefung tropfenweise 0,03 ml einer Suspension von Toxoplasma gondii (6 Millionen/ml) in einer 2,5prozentigen wäßrigen Lösung von Saccharose, zugegeben. (Die Toxoplasmen wurden nach den Angaben von A. Betz. Bull. World Hlth. Org., 39, 1968, p. 367-374, hergestellt.) Der auf diese Weise beschichtete Objektträger wird während 30 Minuten in einem Trockenschrank mit Umluft bei 37° inkubiert. Anschließend wird die Suspension auf dem Objektträger mit Hilfe von Trockeneis eingefroren und dann in einem Gefriertrockner lyophilisiert. Man erhält einen gebrauchsfertigen Objektträger mit selbsthaftenden Toxoplasmen, die bei Spülung mit Wasser nicht abgelöst werden.
Beispiel 2
Auf einen 1 mm dicken Objektträger (76 mm χ 26 mm) aus Polystyrol mit 8 numerierten Vertiefungen (Durchmesser 6 mm, Tiefe 0,25 mm) an der oberen Seite und entsprechenden Vertiefungen an der unteren Seite, sowie einem Schriftfeld, wird pro Vertiefung tropfenweise 0,03 ml einer Suspension von Entamoeba histolyticd (5000/ml) in einer physiologischen 0,85prozentigen Kochsalzlösung mit 2% Carbowax zugegeben. Die Amoeben wurden nach den Angaben von Morris Goldman, Americal J. Trop. Med. Hyg., Vol. 15, No. 5. 1966, p. 694-700, hergestellt. Der auf diese Weise beschichtete Objektträger wird während 30 Minuten, in einem Trockenschrank mit Umluft, bei 37° inkubiert. Anschließend wird die Suspension auf dem Objektträger mit Hilfe von Trockeneis eingefroren und dann in einem Gefriertrockner lyophilisiert. Man erhält einen gebrauchsfertigen Objektträger mit selbsthaftenden Amoeben, die bei Spülung mit Wasser nicht abgelöst werden.
Beispiel 3
Man stellt eine Verdünnungsreihe des Serums eines Patienten her (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 und 1/6400). Auf den in Beispiel 1 hergestellten Objektträger wird pro Vertiefung mit einer Pipette je ein Tropfen des verdünnten Serums aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Ein Tropfen einer handelsüblichen Suspension von mit
Fluoresceinisothiocyanat markierten Antihumanglobulin wird mit einer Pipette in jede Vertiefung aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewäsehen. Zusätzlich wird noch mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet In jede Vertiefung wird ein Tropfen eines handelsüblichen Immersionsöls zugegeben und die Fluoreszenz mit einem Immersionsobjektiv in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt Die maximale Verdünnung, bei weicher die Fluoreszenz sich noch feststellen läßt, gibt einen Hinweis auf die relative Konzentration der Toxoplasma-Antikörper.
Beispiel 4 '5
Die Serumproben 8 verschiedener Patienten werden jeweils mit gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) auf das Fünfzigfache verdünnt und von 1 bis 8 numeriert. Auf den in Beispiel 1 hergestellten ObjeivUräger wird in jede der von I bis 8 numerierten Vertiefungen jeweils ein Tropfen der entsprechend numerierten, verdünnten Serumprobe mit einer Pipette aufgetragen. Danach wird V2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Ein Tropfen einer handelsüblichen Suspension von mit Fluoresceinisothiocyanat markiertem Antihumanglobulin wird mit einer Pipette in jede Vertiefung aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Zusätzlich wird noch mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet. In jede Vertiefung wird ein Tropfen eines handelsüblichen Immersionsöls zugegeben, und die Fluoreszenz mit einem Immersionsobjektiv in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Diejenigen Vertiefungen, bei welchen eine Fluoreszenz festgestellt wird, entsprechen Serumproben von Patienten die mit Toxoplasmen infiziert wurden.
Beispiel 5
Man stellt eine Verdünnungsreihe des Serums eines Patienten her (1/50, 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 und 1/6400). Auf den in Beispiel 2 hergestellten Objektträger wird pro Vertiefung mit einer Pippite je ein Tropfen des verdünnten Serums aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Ein 5c Tropfen einer handelsüblichen Suspension von mit Fluoresceinisothiocyanat markiertem, Antihumanglobulin wird mit einer Pipette in jede Vertiefung aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Zusätzlich wird noch mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet. In jede Vertiefung wird ein Tropfen eines handelsüblichen Immersionsöls zugegeben und die Fluoreszenz mit fm einem Immersionsobjektiv in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Die maximale Verdünnung bei welcher die Fluoreszenz sich noch feststellen läßt, gibt einen Hinweis auf die relative Konzentration der Entamoebahistolytica-Antikörper. ■«,
Beispiel 6
Die SerumDroben 8 verschiedener Patienten werden jeweils mit gepufferter Kocnsalzlösung (pH 72) auf das Fünfzigfache verdünnt und von 1 bis 8 numeriert Auf den in Beispiel 2 hergestellten Objektträger wird in jede der von 1 bis 8 numerierten Vertiefungen jeweils einen Tropfen der entsprechend numerierten verdünnten Serumprobe mit einer Pipette aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 72 gewaschen. Ein Tropfen einer handelsüblichen Suspension von mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Antihumanglobulin wird mit einer Pipette in jede Vertiefung aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 72 gewaschen. Zusätzlich wird noch mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet In jede Vertiefung wird ein Tropfen eines handelsüblichen Immersionsöls zugegeben und die Fluoreszenz mit einem Immersionsobjektiv in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Diejenigen Vertiefungen, bei welchen eine Fluoreszenz festgestellt wird, entsprechen Serumproben von Patienten die mit Amoeben infiziert wurden.
Beispiel 7
Auf einen 1 mm dicken Objektträger (76 mm χ 26 mm) aus Polystyrol mit 8 numerierten Vertiefungen (Durchmesser 6 mm. Tiefe 0,25 mm) an der oberen Seite und entsprechenden Vertiefungen an der unteren Seite, sowie einem Schriftfeld, wird pro Vertiefung tropfenweise 0,03 ml einer Suspension von Trypanosoma cruzi (2 Millionen/ml) in einer 2,5prozentigen wässerigen Lösung von Saccharose, zugegeben. (Die Trypanosomen wurden nach den Angaben von A Ilain, D. S., und Kayan, G, The Journal of Parasitology, Vol. 60, No. 1, Februar 1974, Seiten 179-184, hergestellt.)
Der auf diese Weise beschichtete Objektträger wird während 30 Minuten in einem Trockenschrank mit Umluft bei 37° inkubiert. Anschließend wird die Suspension auf dem Objektträger mit Hilfe von Trockeneis eingefroren und dann in einem Gefriertrockner lyophilisiert. Man erhält einen gebrauchsfertigen Objektträger mit selbsthaftenden Trypanosomen. die bei Spülung mit Wasser nicht abgelöst werden.
Beispiel 8
Man stellt eine Verdünnungsreihe des Serums eines Patienten her (1/50, 1/100. 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 und 1/6400). Auf den in Beispiel 7 herges'-'Uen Objektträger wird pro Vertiefung mit einer Pipette je ein Tropfen des verdünnten Serums aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Ein Tropfen einer handelsüblichen Suspension von mit Fluoresceinisothiocyanat markierten Antihumanglobulin wird mit einer Pipette in jede Vertiefung aufgetragen. Danach wird V2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert, und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Zusätzlich wird noch mit destilliertem Wasser gespült und mit einem Filterpapier getrocknet. In jede Vertiefung wird ein Tropfen eines handelsüblichen Immersionsüls zugegeben und die Fluoreszenz mit einem Immersionsobjektiv in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Die maximale Verdünnung, bei welcher die Fluoreszenz sich noch feststellen läßt, gibt einen
Hinweis auf die relative Konzentration der Trypanosoma-cruzi-Antikörper.
Beispiel 9
Die Serumproben 8 verschiedener Patienten werden jeweils mit gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) auf das Fünfzigfache verdünnt und von 1 bis 8 numeriert. Auf den in Beispiel / hergestellten Objektträger wird in jede der von I bis 8 numerierten Vertiefungen jeweils ein Tropfen der entsprechend numerierten, verdünnten Serumprobe mit einer Pipette aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37° in einer feuchten Kammer inkubiert und anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Ein Tropfen einer handelsübli-
chen Suspension von mit Fluoresceinisothiocyana markiertem Antihumanglobulin wird mit einer Pipettf in jede Vertiefung aufgetragen. Danach wird '/2 Stunde bei 37C in einer feuchten Kammer inkubiert, unc anschließend mit gepufferter Kochsalzlösung vorr pH-Wert 7,2 gewaschen. Zusätzlich wird noch mil destilliertem Wasser gespült und mit einem Filterpapiei getrocknet. In jede Vertiefung wird ein Tropfen eines handelsüblichen Immersionsöls zugegeben, und die Fluoreszenz mit einem Immersionsobjektiv in einem Fluoreszenzmikroskop bestimmt. Diejenigen Vertiefungen, bei welchen eine Fluoreszenz festgestellt wird entsprechen Serumproben von Patienten die mil Trypanosoma cruzi infiziert wurden.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines Objektträgers mit aufgetragenem immunologisch reaktivem Material in lyophilisierter und selbsthaftender Form, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension des immunologisch reaktiven Materials auf den Objektträger aufbringt antrocknen läßt und anschließend lyophilisiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immunologisch reaktive Material aus Toxoplasmen besteht
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Suspensionsflüssigkeit eine wässerige Saccharoselösung verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Antrocknung während mindestens 5 Minuten bei einer Temperatur zwischen 20° C und 400C erfolgt.
DE2455369A 1973-12-10 1974-11-22 Verfahren zur Herstellung eines Objektträgers Expired DE2455369C3 (de)

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