Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Způsob získávání inzulinu nebo derivátů inzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky
CZ295679B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Franz-Josef Dr. Rubröder Reinhold Dr. Keller
Description
translated from
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu získávání inzulínu nebo inzulínových derivátů se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a pomocných chaotropních látek.
Dosavadní stav techniky
Lidský inzulín je protein skládající se ze dvou aminokyselinových řetězců, které obsahují dohromady 51 aminokyselinových zbytků. V obou aminokyselinových řetězcích se vyskytuje 6 cysteinových zbytků, přičemž vždy dva cysteinové zbytky jsou navzájem svázány v disulfidovém můstku. V biologicky aktivním lidském inzulínu jsou A-řetězec a B-řetězec navzájem spojeny dvěma cysteinovými můstky a další cysteinový můstek se vyskytuje v Ařetězci. V molekule lidského inzulínu existuje statisticky vzato 15 možností k vytvoření disulfídových můstků. V biologicky účinné lidském inzulínu se vyskytuje jen jedna z těchto 15 možností. V lidském inzulínu jsou navzájem spojeny následující cysteinové zbytky:
A6-A11
A7-B7
A20-B19
Písmena A a B označují jednotlivé aminokyselinové řetězce inzulínu a číslo označuje polohu aminokyselinového zbytku, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného aminokyselinového řetězce. Disulfídové můstky mohou také vzniknout mezi dvěma molekulami lidského inzulínu, takže může snadno vzniknout mnoho nepřehledných disulfídových můstků.
Známý způsob přípravy lidského inzulínu je založen na využití lidského proinzulinu. Lidský proinzulin je protein s lineárním aminokyselinovým řetězcem z 86 aminokyselin, kde jsou A- a B-řetězec lidského inzulínu navzájem spojeny C-peptidem obsahujícím 35 aminokyselinových zbytků. K vytvoření disulfidových můstků existujících v lidském inzulínu dochází prostřednictvím meziproduktu, kdy jsou cysteinové zbytky lidského inzulínu opatřeny ochrannou sírovou skupinou, např. sulfonátovou (-S-SO3~) skupinou (EP 0 037 255). Dále je znám způsob získání proinzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky (Biochemistry, 60, 1968, s. 622-629), který vychází z proinzulinu z prasečího pankreatu, a kde cysteinové zbytky jsou k dispozici v podobě thiolových (-SH) zbytků. Pod pojmem „správně spojené cysteinové můstky“ se rozumějí disulfídové můstky, které se vyskytují v biologicky aktivním inzulínu savců.
Metody genové technologie umožňují, aby se prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zejména lidského proinzulinu nebo proinzulinu, jehož aminokyselinová sekvence a/nebo délka řetězce se odlišují od lidského inzulínu, připravil v mikroorganismech. Proinzuliny připravené v buňkách E. coli pozměněných metodami genového inženýrství nemají správně spojené cysteinové můstky.
Způsob získání lidského inzulínu zE. coli (EP 0 055 945) se skládá z následujících kroků:
Fermentace mikroorganizmů - rozrušení buněk - izolace fúzovaných proteinů - halogenkyanové štěpení fúzovaných proteinů - izolace štěpných produktů se sekvencí proinzulinu - ochrana cysteinových zbytků proinzulinu S-sulfonátovou skupinou - chromatografícké čištění S-sulfonátů - vytvoření správně spojených cysteinových můstků - vysolení proinzulinu - chromatografícké čištění proinzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky - koncentrování proinzulinového roztoku - chromatografícké čištění koncentrovaného proinzulinového roztoku
-1 CZ 295679 B6 enzymatické štěpení proinzulinu vedoucí k získání lidského inzulínu - chromatografícké čištění vzniklého lidského inzulínu.
Nevýhodou tohoto způsobu je počet kroků a také ztráty při krocích čištění, které vedou k nízkému výtěžku inzulínu. Vzhledem k mnohakrokovému způsobu se musí počítat se značnými ztrátami. Od kroku izolace fúzovaného proteinu přes halogenkyanové štěpení, sulfítolýzu a čištění proinzulinu se počítá se ztrátou až 40 % proinzulinu (EP 0 055 945). K podobně vysokým ztrátám může dojít v průběhu následujících kroků čištění až do vzniku konečného produktu.
Zvýšení výtěžku se při přípravě lidského inzulínu nebo inzulínových derivátů genovými technikami dá dosáhnout, pokud se významně sníží počet nezbytných kroků v celém postupu.
Z patentových přihlášek EP 0 600 372 Al (případně US 5 473 049) a EP 0 668 292 A2 je známo odpovídající zlepšení postupu pro získání inzulínu, při kterém se prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu, jejichž cysteinové můstky nejsou správně spojeny, přemění v přítomnosti merkaptanu, např. cysteinu, a nejméně jedné chaotropní pomocné látky, např. močoviny nebo hydrochloridu guanidinu, na prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky. Podle tohoto známého způsobu se proteiny nejdříve rozpustí ve vodném roztoku chaotropní pomocné látky nebo směsi různýchchaotropních látek o velmi nízké koncentraci. Pak se proteinová směs smísí svodným roztokem merkaptanu.
Překvapivě se nyní zjistilo, že výtěžek správně složených prekurzorů inzulínu nebo inzulínových derivátů se může zvýšit a reakční čas skladebného procesu zkrátit tím, že se prekurzor v počátečním kroku nerozpustí pomocí chaotropní pomocné látky, ale že se nejdřív do vodné suspenze prekurzoru vnáší merkaptan, zejména cystein nebo hydrochlorid cysteinu, a teprve v následujícím kroku se roztok prekurzoru vnese do vodného roztoku chaotropní pomocné látky, a pak se dosáhne správného složení prekurzoru naředěním směsi na výhodnou koncentraci cysteinu popřípadě hydrochloridu cysteinu vnesením směsi do odpovídajícího množství vody.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká způsobu získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, který spočívá vtom, že se provedou po sobě následující kroky:
a) smíchá se vodná suspenze prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu s množstvím cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu, které poskytne 1 až 15 SH-skupin cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru,
b) suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku pomocné chaotropní látky při hodnotě pH přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 15 až 55 °C a směs se udržuje na této teplotě 10 až 60 minut,
c) směs se vnese při pH hodnotě přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 5 až 30 °C do množství vody, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až 5mM koncentraci a pomocná chaotropní látka na 0,2 až l,0M koncentraci.
Výhodný je takový způsob, kde ve kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množství, které poskytuje 1 až 6 SH-skupin cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru, v kroku b) se vnese suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4- až 9-molámího roztoku pomocné chaotropní látky při pH hodnotě 9 až 11 a teplotě 30 až 45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v kroku c) se vnese směs při hodnotě pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do množství vody, které naředí cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 1 až 5mM a chaotropní pomocnou látku na koncentraci 0,2 až l,0M.
-2CZ 295679 B6
Chaotropní pomocná látka je taková sloučenina, která ve vodném roztoku ruší vodíkové můstky, jako je např. síran amonný, hydrochlorid guanidinu, ethylenkarbonát, thiokyanát, dimethylsulfoxid a močovina.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu je výhodnou chaotropní pomocnou látkou guanidin, hydrochlorid guanidinu nebo zvláště výhodnou látkou je močovina.
Koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) podle vynálezu je výhodně 7 až 9 M, teplota v kroku c) je výhodně 40 °C a pH hodnota v kroku b) je výhodně 10 až 11.
Ve způsobu podle vynálezu je pH hodnota v kroku c) výhodně 10 až 11. V kroku c) způsobu podle předkládaného vynálezu je množství vody, do kterého je vnesena směs, výhodně zvoleno tak, že poskytne naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci 2,5 až 4mM a chaotropní pomocné látky na koncentraci 0,5M.
Zvláště výhodný je způsob podle předkládaného vynálezu, kde koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je přibližně 8M, teplota v kroku b) je přibližně 40 °C, pH hodnota ve kroku b) je přibližně 10,6, pH hodnota v kroku c) je přibližně 10,6, a množství vody v kroku c) poskytuje naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 2,5 až 3mM a koncentraci chaotropní pomocné látky přibližně 0,5M.
Výsledkem způsobu podle předkládaného vynálezu je prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zvláště proinzulin, jejichž cysteinové můstky jsou správně spojeny.
Inzulínové deriváty jsou deriváty přirozeně se vyskytujícího inzulínu, a sice lidského inzulínu (sekvence identifikačního čísla 1 = A-řetězec lidského inzulínu, sekvence identifikačního čísla 2 = B-řetězec lidského inzulínu, viz seznam sekvencí) nebo zvířecího inzulínu, které se odlišují od příslušné jinak shodné sekvence přirozeně se vyskytujícího inzulínu substitucí (náhradou) několika přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků a/nebo adicí (přidáním) několika aminokyselinových zbytků a/nebo organických zbytků.
Zprekurzoru inzulínu popřípadě inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky, získaného pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu, se následně může vyrobit inzulín nebo inzulínový derivát se správně spojenými cysteinovými můstky způsobem popsaným v EP 0 600 372 (případně US 5 473 040) nebo EP 0 668 292 A2, a sice enzymatickým štěpením trypsinem nebo trypsinu podobným enzymem, případně navíc pomocí karboxypeptidázy B, a následným přečištěním na adsorpční pryskyřici.
Inzulín nebo inzulínový derivát, který je vyrobitelný zprekurzoru, je přednostně popsán vzorcem I
Cys— (A11)
Cys
Gly(A1)
S R3__oh
R1-----Cys (B1) (B7) (I)
Y--Z (B30) s
Cys * (B19)
-3CZ 295679 B6 kde
Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Z je
a) aminokyselinový zbytek ze skupiny His, Arg nebo Lys,
b) peptid se 2 nebo 3 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek Arg nebo Lys na karboxylovém konci peptidu,
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, nebo
d) OH,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba,
R3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, přičemž zbytky A2 až A20, které nejsou pro zjednodušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a zbytky B2 až B29, které nejsou pro zjednodušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenci B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
Aminokyselinové sekvence peptidů a proteinů jsou označovány od N-konce aminokyselinového řetězce. Údaje ve vzorci I, které jsou v závorce, např. A6, A20, Bl, B7 nebo B19 odpovídají polohám aminokyselinových zbytků v A-řetězci nebo B-řetězcí inzulínu.
Termín „geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek“ zahrnuje aminokyseliny Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro a selenocystein.
Pod pojmem „zbytky A2 až A20“ a „zbytky B2 až B29“ zvířecího inzulínu se rozumí např. aminokyselinové sekvence inzulínu z krávy, vepře nebo slepice. Pojmy „zbytky A2 až A20“ a „zbytky B2 až B29“ pro inzulínový derivát znamenají odpovídající aminokyselinové sekvence lidského inzulínu, které byly vytvořeny záměnou aminokyselin jinými geneticky kódovatelnými aminokyselinami.
A-řetězec lidského inzulínu má např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla 1):
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.
B-řetězec lidského inzulínu má např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla 2):
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.
Přitom ve vzorci I je R3 asparagin (Asn), R1 je fenylalanin (Phe), Y je threonin (Thr) a Z je OH.
Způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště vhodný k získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu podle obecného vzorce II, jehož cysteinové můstky (ve vzorci II neznázorněné) jsou správně složeny.
-4CZ 295679 B6
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II) a kde
R2 je
a) atom vodíku
b) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg), nebo
c) peptid s 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek lysin (Lys) nebo arginin (Arg) na karboxylovém konci peptidu,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedné nebo více polohách pozměněného inzulínového derivátu,
Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
X je
a) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg), nebo
b) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a karboxylovém konci peptidu, nebo
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků (His), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedné nebo více polohách pozměněného inzulínového derivátu, a
R3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
1. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2je
a) atom vodíku nebo
b) peptid se 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidu,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alaninu (Ala), threoninu (Thr) nebo šeřinu (Ser),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, a
R3 je aminokyselinový zbytek ze skupiny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
C-řetězec lidského inzulínu má následující sekvenci aminokyselin (sekvence identifikačního čísla 3):
| Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin | Val | Gly | Čí? JLxx | Val | Glu | Leu |
| Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Glu | Pro | Leu | Ala | Leu |
| Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg |
2. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2je
a) atom vodíku nebo
b) peptid se 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, na jehož karboxylovém konci se nachází aminokyselinový zbytek argininu (Arg),
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je threoninový zbytek (Thr),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, kde jsou na začátku i na konci peptidů dva bazické aminokyselinové zbytky, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, a
R3 je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu (Gly).
Zbytek Z inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorce I je zpravidla část aminokyselinové sekvence X prekurzoru podle vzorce Π a vzniká aktivitou proteáz jako je např. trypsin, trypsinu podobné enzymy nebo karboxypeptidáza B. Zbytek R3 je aminokyselinový zbytek, který má polohu A21 v A-řetězci inzulínu. Zbytek Y je aminokyselinový zbytek, který má polohu B30 v B-řetězci inzulínu.
Trypsin nebo trypsinu podobné enzymy jsou proteázy, které štěpí aminokyselinový řetězec v místě argininového nebo lysinového zbytku. Karboxypeptidáza je exoproteáza, která odštěpuje bazické aminokyselinové zbytky jako je např. Arg nebo Lys, které jsou na karboxylovém konci aminokyselinového řetězce (Kemmler et al., J. Biol. Chem., 246, s. 6786-6791).
Z prekurzoru jmenovaného v 1. bodě je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými cysteinovými můstky, přičemž Y, R1, R2, R3, A2-A20 a B2-B29 mají význam popsaný v 1. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo -OH skupina.
Z prekurzoru jmenovaného ve 2. bodě je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými cysteinovými můstky, přičemž Y, R1, R2, R3, A2-A20 a B2-B29 mají význam popsaný v 2. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo Lys-Lys nebo -OH skupina.
Prekurzor podle vzorce II se může tvořit pomocí mnohých genových konstruktů v mikroorganizmech (viz EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 453 969). Genové konstrukty jsou exprimovány v mikroorganizmech jako jsou např. E. coli nebo streptomycéty v průběhu fermentace. Vytvářené proteiny se ukládají uvnitř mikroorganizmů (EP 0 489 780) nebo jsou vylučovány do fermentačního roztoku.
Pro způsob podle předkládaného vynálezu se může použít takový prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorce II, který je ještě bezprostředně po rozrušení buňky znečištěn mnohými proteiny pocházejícími z fermentačního roztoku a mikroorganizmů. Prekurzor podle vzorce II se může použít také v přečištění podobě, např. po srážení nebo chromatografickém čištění.
-6CZ 295679 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (Srovnávací příklad, stav techniky)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven fůzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
Sekvence proinzulinu 1 (sekvence identifikačního čísla 4):
| Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn |
Sekvence proinzulinu 1 odpovídá vzorci II, přičemž
X je C-peptid lidského inzulínu (sekvence i. č. 3),
Y je Thr (B30),
R1 jePhe(Bl),
R2 je peptid s 10 aminokyselinovými zbytky,
R3 jeAsn(A21)a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20)
A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) Břetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí proinzulinu 1 exprimovaný v buňkách E. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním. 20 kg izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofilizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulinu 1 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6. Po případném odstředění menšího množství látek způsobujících zákal se čirý roztok rozmíchal v 9000 1 vodného cysteinového roztoku (5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulinové sekvence 1 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HC1 upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak se nastavilo pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se přidaly do roztoku 3 g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 1,25 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci.
-7CZ 295679 B6
Po štěpení karboxypeptidázou B vznikl lidský inzulín, který se dále čistil pomocí chromatografíckých metod.
Lidský inzulín odpovídá vzorci I, přičemž
Y je Thr (B30),
Z je OH,
R1 ePhe(Bl),
R3 eAsn(A21)a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Lidský inzulín 2 se skládá ze sekvencí identifikačních čísel 1 a 2, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje, jak bylo popsáno v EP 0 668 292, pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulín 2 se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografícké koloně.
Analýza pomocí HPLC
0,5 proteinu se rozpouštělo ve 40 ml roztoku o složení: 6M hydrochlorid guanidia, 50mM Tris, pH 8,5, 5mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), 1% 2-merkaptoethanol, lOmM dithiotreitol, při 95 °C po 2 minuty, a pak odstředilo 20 minut při 14000 g. 0,02 ml čirého roztoku se naneslo na HPLC kolonu.
Kolona: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey a Nagel, Aachen, Německo)
Gradient: Pufr A: 0,1% kyselina trifluoroctová (TFA)
Pufr B: 0,09% TFA v acetonitrilu
Teplota: 55 °C
Celkový čas běhu: 40 minut
Gradient je charakterizován následujícím množstvím pufru B po odpovídající době běhu:
min 25 %, 12 min 60 %, 13 min 90 %, 15 min 100 %
Průtok: 1 ml/min
Detekce: 215 nm
Retenční čas inzulínu: asi 19 minut
-8CZ 295679 B6
Příklad 2 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (viz EP 0 489 780) se připravil fúzní protein s aminokyselinovou sekvencí, která je uvedena v příkladu 1 (sekvence proinzulinu 1, sekvence i. č. 4). Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulinu 1 se shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
K vodné suspenzi fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (stanoveno lyofílizací alikvotní části) se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
Suspenze proinzulinu 1 (podíl inzulín obsahujícího fúzního proteinu stanovený pomocí HPLC činil 50 %) se rozpustila v 550 1 8M močoviny při pH 10,2 při 40 °C. Čirý roztok se přimíchal k 9000 1 vody při pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 5 hodinách se pomocí analytické HPLC v lOkg várce stanovil obsah proinzulinu I se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně. 9500 1 roztoku se pomocí IN HC1 upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se do roztoku přidalo 10 g trypsinu. Vznikly tak 4 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci. Po štěpení karboxypeptidázou B vznikl lidský inzulín (sekvence i. č. 1 a 2 se správně spojenými cysteinovými můstky). Roztok se dále pomocí adsorpční pryskyřice zakoncentroval a čistil. Eluát obsahující inzulín 2 se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
Příklad 3 (Srovnávací příklad, stav techniky)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven fúzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
Sekvence proinzulinu 2 (sekvence i. č. 5):
| Ala | Thr | Thr | ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | g fy |
Sekvence proinzulinu 1 odpovídá vzorci II, přičemž
X e C-peptid lidského inzulínu (sekvence id. č. 3),
Y e Thr (B30),
R1 ePhe(Bl),
-9CZ 295679 B6
R2 e peptid s 10 aminokyselinovými zbytky,
R3 e Gly (A21) a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí proinzulinu 2 exprimovaný v buňkách E. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
g izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofílizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulinu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6 a teplotě 20 °C. Čirý roztok se rozmíchal v 9000 1 vodného cysteinového roztoku (5 g hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulinové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HCl upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se přidaly do roztoku 3 g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 0,9 kg inzulínového derivátu se 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci.
Tento inzulínový derivát odpovídá vzorci I, přičemž Y je Thr (B30),
Z e Arg-Arg,
R1 ePhe(Bl),
R3 eGly(A21)a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu, a skládá se ze sekvencí identifikačních čísel 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulínový derivát se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
Příklad 4 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven podle příkladu 3 fúzní protein se sekvencí proinzulinu 2 (sekvence i. č. 5).
Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulinu 2 se shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
Do vodné suspenze fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (jak bylo stanoveno lyofilizací alikvotní části) se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
-10CZ 295679 B6
Suspenze s proteinem (podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulinu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,2 a teplotě 40 °C. Čirý roztok se přimíchal do 9000 1 vody při hodnotě pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 5 hodinách se v lOkg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulinové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HC1 upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se přidalo do roztoku 10 g trypsinu. Tak vzniklo 2,8 kg inzulínového derivátu (podle měření HPLC), který se skládá ze sekvencí id. č. 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulínový derivát se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:
Cly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
-11 CZ 295679 B6 (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...35 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:
| Arg Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin | Val | Gly Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
| Gly Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin | Pro | Leu Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu |
| 20 | 25 | 30 |
Gin Lys Arg (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
- 12CZ 295679 B6 (A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...96 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
| Ala Thr Thr | Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin | His 15 Glu | Leu Arg | ||||||||||||
| 1 Cys | Gly Ser | 5 His Leu 20 | Val Glu | Ala | 10 | ||||||||||
| Leu 25 | Tyr | Leu Val | Cys | Gly 30 | |||||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | cly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Léu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn |
| 85 | 90 | 95 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix)ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...96 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:
-13CZ 295679 B6
| Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gly | Sex | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Gly |
| 85 | 90 | 95 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 3 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli
-14CZ 295679 B6 (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
Claims (13)
Hide Dependent
translated from
Claims (13)
Hide Dependent
translated from
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy inzulínu nebo inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky z prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, vyznačující se tím, že se postupně provedou následující kroky:a) smíchá se vodná suspenze prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu s takovým množstvím cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu, které poskytne 1 až 15 SH-zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu,b) suspenze prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku chaotropní pomocné látky při pH 8 až 11,5 a teplotě 15 až 55 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě 10 až 60 minut, ac) směs se vnese při pH 8 až 11,5 a teplotě 5 až 30 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až 5mM koncentraci a chaotropní pomocná látka na 0,2 až 1,0M koncentraci.
- 2. Způsobpodlenároku 1, vyznačuj ící se tím, že v kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množství, které poskytuje 1 až 6 SH-zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu, v kroku b) se vnese suspenze prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4 až 9M roztoku chaotropní pomocné látky při pH 8 až 11 a teplotě 30 až 45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v následujícím kroku c) se vnese směs při pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na koncentraci přibližně 1 až 5mM a chaotropní pomocná látka na koncentraci 0,2 až l,0M.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je guanidin nebo hydrochlorid guanidinu.-15 CZ 295679 B6
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je močovina.
- 5. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4, vyznač u j í cí se tí m, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je 7,0 až 9,0M.
- 6. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že teplota v kroku b) je 40 °C.
- 7. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že pH v kroku b) je 10 až 11.
- 8. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 7, vyznačující se tím,žepH v kroku c) je 10 až 11.
- 9. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že v kroku c) množství vody poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 10. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je 8M, teplota v kroku b) je 40 °C, pH v kroku b) je 10,6, pH v kroku c) je 10,6, a množství vody v kroku c) poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 11. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu má sekvenci podle obecného vzorce IIR2-R,-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II), kdeR2jea) atom vodíku,b) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), neboc) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidů,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách,Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,X jea) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), nebob) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a karboxylovém konci peptidů, neboc) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků (His),-16CZ 295679 B6 (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách, aR3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
- 12. Způsobpodlenároku 11, vyznačuj ící se t í m , že ve vzorci IIR2 jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidu,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alanin (Ala), threonin (Thr) nebo serin (Ser),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek ze skupiny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
- 13. Způsob podle nároku 11, vy z n a č uj í c í se t í m , že ve vzorci IIR2 jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, kde na karboxylovém konci peptidu se nachází aminokyselinový zbytek argininu (Arg),R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek threoninu (Thr),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, přičemž na začátku a na konci peptidu jsou dva bazické aminokyselinové zbytky, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu (Gly).