CZ295679B6 - Způsob získávání inzulinu nebo derivátů inzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky - Google Patents
Způsob získávání inzulinu nebo derivátů inzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295679B6 CZ295679B6 CZ19982598A CZ259898A CZ295679B6 CZ 295679 B6 CZ295679 B6 CZ 295679B6 CZ 19982598 A CZ19982598 A CZ 19982598A CZ 259898 A CZ259898 A CZ 259898A CZ 295679 B6 CZ295679 B6 CZ 295679B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- amino acid
- insulin
- cysteine
- arg
- peptide
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 137
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 title claims abstract description 57
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title claims abstract description 49
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title claims abstract description 49
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 title claims abstract description 49
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims abstract description 56
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 claims abstract description 35
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 33
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 75
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 claims description 40
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 27
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 22
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 19
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N urea group Chemical group NC(=O)N XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 10
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 9
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 8
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 4
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 2
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 claims 2
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 claims 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 24
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N Ala-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CCDFBRZVTDDJNM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N Cys-Cys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KOHBWQDSVCARMI-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 6
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN WNGHUXFWEWTKAO-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 6
- DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N Ser-Ile-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O DLPXTCTVNDTYGJ-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 6
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ITYRYNUZHPNCIK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N Lys-Thr-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O TVHCDSBMFQYPNA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 5
- JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N Ser-Leu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JWOBLHJRDADHLN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N Ala-Thr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O KUFVXLQLDHJVOG-SHGPDSBTSA-N 0.000 description 4
- HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HPKSHFSEXICTLI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 4
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N Lys-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O GAOJCVKPIGHTGO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 4
- PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N Ser-Thr-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O PURRNJBBXDDWLX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 4
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 4
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N Arg-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HAVKMRGWNXMCDR-STQMWFEESA-N 0.000 description 3
- XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- 108010075254 C-Peptide Proteins 0.000 description 3
- 108090000087 Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 3
- 102000003670 Carboxypeptidase B Human genes 0.000 description 3
- GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N Cys-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GCDLPNRHPWBKJJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XTHUKRLJRUVVBF-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 MMFKFJORZBJVNF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 3
- LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N Tyr-Cys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XBWKCYFGRXKWGO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- -1 e.g. Chemical compound 0.000 description 3
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 33017-11-7 Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)CCC1 VOUAQYXWVJDEQY-QENPJCQMSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KXEVYGKATAMXJJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N Arg-Arg-Glu Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UXJCMQFPDWCHKX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N Gln-His-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWUFOVSLWADEJC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N Glu-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZJICFHQSPWFBKP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N Gly-Ile-Val Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O COVXELOAORHTND-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 2
- MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN MKIAPEZXQDILRR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWROVBNEHJSXDG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 101710186643 Insulin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 2
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N dipeptide phenylalanyl-tyrosine Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FSXRLASFHBWESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N (4R)-2-oxo-4-thiazolidinecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CSC(=O)N1 BMLMGCPTLHPWPY-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NBTGEURICRTMGL-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N Cys-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O GGRDJANMZPGMNS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N Ethylene carbonate Chemical compound O=C1OCCO1 KMTRUDSVKNLOMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 description 1
- MXPBQDFWIMBACQ-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O MXPBQDFWIMBACQ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ILGFBUGLBSAQQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N Glu-Leu-Arg Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O VSRCAOIHMGCIJK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N Gly-Pro-Gly Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 101000946524 Homo sapiens Carboxypeptidase B Proteins 0.000 description 1
- 101000619708 Homo sapiens Peroxiredoxin-6 Proteins 0.000 description 1
- YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N Ile-Val-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N YWCJXQKATPNPOE-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000000510 L-tryptophano group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2N([H])C([H])=C(C([H])([H])[C@@]([H])(C(O[H])=O)N([H])[*])C2=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102100022239 Peroxiredoxin-6 Human genes 0.000 description 1
- BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N Phe-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BXNGIHFNNNSEOS-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZIFYDQAFEMIZII-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001104043 Syringa Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N Thr-Pro-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O GFRIEEKFXOVPIR-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N Tyr-Cys-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FQNUWOHNGJWNLM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N Tyr-Leu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 CDKZJGMPZHPAJC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N Val-Glu-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XGJLNBNZNMVJRS-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Řešení se týká zlepšeného způsobu přípravy inzulinu nebo inzulinového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky.ŕ
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká zlepšeného způsobu získávání inzulínu nebo inzulínových derivátů se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a pomocných chaotropních látek.
Dosavadní stav techniky
Lidský inzulín je protein skládající se ze dvou aminokyselinových řetězců, které obsahují dohromady 51 aminokyselinových zbytků. V obou aminokyselinových řetězcích se vyskytuje 6 cysteinových zbytků, přičemž vždy dva cysteinové zbytky jsou navzájem svázány v disulfidovém můstku. V biologicky aktivním lidském inzulínu jsou A-řetězec a B-řetězec navzájem spojeny dvěma cysteinovými můstky a další cysteinový můstek se vyskytuje v Ařetězci. V molekule lidského inzulínu existuje statisticky vzato 15 možností k vytvoření disulfídových můstků. V biologicky účinné lidském inzulínu se vyskytuje jen jedna z těchto 15 možností. V lidském inzulínu jsou navzájem spojeny následující cysteinové zbytky:
A6-A11
A7-B7
A20-B19
Písmena A a B označují jednotlivé aminokyselinové řetězce inzulínu a číslo označuje polohu aminokyselinového zbytku, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného aminokyselinového řetězce. Disulfídové můstky mohou také vzniknout mezi dvěma molekulami lidského inzulínu, takže může snadno vzniknout mnoho nepřehledných disulfídových můstků.
Známý způsob přípravy lidského inzulínu je založen na využití lidského proinzulinu. Lidský proinzulin je protein s lineárním aminokyselinovým řetězcem z 86 aminokyselin, kde jsou A- a B-řetězec lidského inzulínu navzájem spojeny C-peptidem obsahujícím 35 aminokyselinových zbytků. K vytvoření disulfidových můstků existujících v lidském inzulínu dochází prostřednictvím meziproduktu, kdy jsou cysteinové zbytky lidského inzulínu opatřeny ochrannou sírovou skupinou, např. sulfonátovou (-S-SO3~) skupinou (EP 0 037 255). Dále je znám způsob získání proinzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky (Biochemistry, 60, 1968, s. 622-629), který vychází z proinzulinu z prasečího pankreatu, a kde cysteinové zbytky jsou k dispozici v podobě thiolových (-SH) zbytků. Pod pojmem „správně spojené cysteinové můstky“ se rozumějí disulfídové můstky, které se vyskytují v biologicky aktivním inzulínu savců.
Metody genové technologie umožňují, aby se prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zejména lidského proinzulinu nebo proinzulinu, jehož aminokyselinová sekvence a/nebo délka řetězce se odlišují od lidského inzulínu, připravil v mikroorganismech. Proinzuliny připravené v buňkách E. coli pozměněných metodami genového inženýrství nemají správně spojené cysteinové můstky.
Způsob získání lidského inzulínu zE. coli (EP 0 055 945) se skládá z následujících kroků:
Fermentace mikroorganizmů - rozrušení buněk - izolace fúzovaných proteinů - halogenkyanové štěpení fúzovaných proteinů - izolace štěpných produktů se sekvencí proinzulinu - ochrana cysteinových zbytků proinzulinu S-sulfonátovou skupinou - chromatografícké čištění S-sulfonátů - vytvoření správně spojených cysteinových můstků - vysolení proinzulinu - chromatografícké čištění proinzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky - koncentrování proinzulinového roztoku - chromatografícké čištění koncentrovaného proinzulinového roztoku
-1 CZ 295679 B6 enzymatické štěpení proinzulinu vedoucí k získání lidského inzulínu - chromatografícké čištění vzniklého lidského inzulínu.
Nevýhodou tohoto způsobu je počet kroků a také ztráty při krocích čištění, které vedou k nízkému výtěžku inzulínu. Vzhledem k mnohakrokovému způsobu se musí počítat se značnými ztrátami. Od kroku izolace fúzovaného proteinu přes halogenkyanové štěpení, sulfítolýzu a čištění proinzulinu se počítá se ztrátou až 40 % proinzulinu (EP 0 055 945). K podobně vysokým ztrátám může dojít v průběhu následujících kroků čištění až do vzniku konečného produktu.
Zvýšení výtěžku se při přípravě lidského inzulínu nebo inzulínových derivátů genovými technikami dá dosáhnout, pokud se významně sníží počet nezbytných kroků v celém postupu.
Z patentových přihlášek EP 0 600 372 Al (případně US 5 473 049) a EP 0 668 292 A2 je známo odpovídající zlepšení postupu pro získání inzulínu, při kterém se prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu, jejichž cysteinové můstky nejsou správně spojeny, přemění v přítomnosti merkaptanu, např. cysteinu, a nejméně jedné chaotropní pomocné látky, např. močoviny nebo hydrochloridu guanidinu, na prekurzor inzulínu nebo prekurzor inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky. Podle tohoto známého způsobu se proteiny nejdříve rozpustí ve vodném roztoku chaotropní pomocné látky nebo směsi různýchchaotropních látek o velmi nízké koncentraci. Pak se proteinová směs smísí svodným roztokem merkaptanu.
Překvapivě se nyní zjistilo, že výtěžek správně složených prekurzorů inzulínu nebo inzulínových derivátů se může zvýšit a reakční čas skladebného procesu zkrátit tím, že se prekurzor v počátečním kroku nerozpustí pomocí chaotropní pomocné látky, ale že se nejdřív do vodné suspenze prekurzoru vnáší merkaptan, zejména cystein nebo hydrochlorid cysteinu, a teprve v následujícím kroku se roztok prekurzoru vnese do vodného roztoku chaotropní pomocné látky, a pak se dosáhne správného složení prekurzoru naředěním směsi na výhodnou koncentraci cysteinu popřípadě hydrochloridu cysteinu vnesením směsi do odpovídajícího množství vody.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká způsobu získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, který spočívá vtom, že se provedou po sobě následující kroky:
a) smíchá se vodná suspenze prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu s množstvím cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu, které poskytne 1 až 15 SH-skupin cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru,
b) suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku pomocné chaotropní látky při hodnotě pH přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 15 až 55 °C a směs se udržuje na této teplotě 10 až 60 minut,
c) směs se vnese při pH hodnotě přibližně 8 až 11,5 a teplotě přibližně 5 až 30 °C do množství vody, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až 5mM koncentraci a pomocná chaotropní látka na 0,2 až l,0M koncentraci.
Výhodný je takový způsob, kde ve kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množství, které poskytuje 1 až 6 SH-skupin cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzoru, v kroku b) se vnese suspenze prekurzoru obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4- až 9-molámího roztoku pomocné chaotropní látky při pH hodnotě 9 až 11 a teplotě 30 až 45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v kroku c) se vnese směs při hodnotě pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do množství vody, které naředí cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 1 až 5mM a chaotropní pomocnou látku na koncentraci 0,2 až l,0M.
-2CZ 295679 B6
Chaotropní pomocná látka je taková sloučenina, která ve vodném roztoku ruší vodíkové můstky, jako je např. síran amonný, hydrochlorid guanidinu, ethylenkarbonát, thiokyanát, dimethylsulfoxid a močovina.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu je výhodnou chaotropní pomocnou látkou guanidin, hydrochlorid guanidinu nebo zvláště výhodnou látkou je močovina.
Koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) podle vynálezu je výhodně 7 až 9 M, teplota v kroku c) je výhodně 40 °C a pH hodnota v kroku b) je výhodně 10 až 11.
Ve způsobu podle vynálezu je pH hodnota v kroku c) výhodně 10 až 11. V kroku c) způsobu podle předkládaného vynálezu je množství vody, do kterého je vnesena směs, výhodně zvoleno tak, že poskytne naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci 2,5 až 4mM a chaotropní pomocné látky na koncentraci 0,5M.
Zvláště výhodný je způsob podle předkládaného vynálezu, kde koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je přibližně 8M, teplota v kroku b) je přibližně 40 °C, pH hodnota ve kroku b) je přibližně 10,6, pH hodnota v kroku c) je přibližně 10,6, a množství vody v kroku c) poskytuje naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu ve směsi na koncentraci přibližně 2,5 až 3mM a koncentraci chaotropní pomocné látky přibližně 0,5M.
Výsledkem způsobu podle předkládaného vynálezu je prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu, zvláště proinzulin, jejichž cysteinové můstky jsou správně spojeny.
Inzulínové deriváty jsou deriváty přirozeně se vyskytujícího inzulínu, a sice lidského inzulínu (sekvence identifikačního čísla 1 = A-řetězec lidského inzulínu, sekvence identifikačního čísla 2 = B-řetězec lidského inzulínu, viz seznam sekvencí) nebo zvířecího inzulínu, které se odlišují od příslušné jinak shodné sekvence přirozeně se vyskytujícího inzulínu substitucí (náhradou) několika přirozeně se vyskytujících aminokyselinových zbytků a/nebo adicí (přidáním) několika aminokyselinových zbytků a/nebo organických zbytků.
Zprekurzoru inzulínu popřípadě inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky, získaného pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu, se následně může vyrobit inzulín nebo inzulínový derivát se správně spojenými cysteinovými můstky způsobem popsaným v EP 0 600 372 (případně US 5 473 040) nebo EP 0 668 292 A2, a sice enzymatickým štěpením trypsinem nebo trypsinu podobným enzymem, případně navíc pomocí karboxypeptidázy B, a následným přečištěním na adsorpční pryskyřici.
Inzulín nebo inzulínový derivát, který je vyrobitelný zprekurzoru, je přednostně popsán vzorcem I
Cys— (A11)
Cys
Gly(A1)
S R3__oh
R1-----Cys (B1) (B7) (I)
Y--Z (B30) s
Cys * (B19)
-3CZ 295679 B6 kde
Y znamená geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
Z je
a) aminokyselinový zbytek ze skupiny His, Arg nebo Lys,
b) peptid se 2 nebo 3 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek Arg nebo Lys na karboxylovém konci peptidu,
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků, nebo
d) OH,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba,
R3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek, přičemž zbytky A2 až A20, které nejsou pro zjednodušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenci A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu, a zbytky B2 až B29, které nejsou pro zjednodušení vzorce I na obrázku znázorněny, odpovídají aminokyselinové sekvenci B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo inzulínového derivátu.
Aminokyselinové sekvence peptidů a proteinů jsou označovány od N-konce aminokyselinového řetězce. Údaje ve vzorci I, které jsou v závorce, např. A6, A20, Bl, B7 nebo B19 odpovídají polohám aminokyselinových zbytků v A-řetězci nebo B-řetězcí inzulínu.
Termín „geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek“ zahrnuje aminokyseliny Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro a selenocystein.
Pod pojmem „zbytky A2 až A20“ a „zbytky B2 až B29“ zvířecího inzulínu se rozumí např. aminokyselinové sekvence inzulínu z krávy, vepře nebo slepice. Pojmy „zbytky A2 až A20“ a „zbytky B2 až B29“ pro inzulínový derivát znamenají odpovídající aminokyselinové sekvence lidského inzulínu, které byly vytvořeny záměnou aminokyselin jinými geneticky kódovatelnými aminokyselinami.
A-řetězec lidského inzulínu má např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla 1):
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr
Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn.
B-řetězec lidského inzulínu má např. následující sekvenci (sekvence identifikačního čísla 2):
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala
Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr.
Přitom ve vzorci I je R3 asparagin (Asn), R1 je fenylalanin (Phe), Y je threonin (Thr) a Z je OH.
Způsob podle předkládaného vynálezu je zvláště vhodný k získání prekurzoru inzulínu nebo inzulínového derivátu podle obecného vzorce II, jehož cysteinové můstky (ve vzorci II neznázorněné) jsou správně složeny.
-4CZ 295679 B6
R2-R1-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II) a kde
R2 je
a) atom vodíku
b) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg), nebo
c) peptid s 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek lysin (Lys) nebo arginin (Arg) na karboxylovém konci peptidu,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedné nebo více polohách pozměněného inzulínového derivátu,
Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,
X je
a) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysin (Lys) nebo arginin (Arg), nebo
b) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a karboxylovém konci peptidu, nebo
c) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků (His), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně v jedné nebo více polohách pozměněného inzulínového derivátu, a
R3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
1. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2je
a) atom vodíku nebo
b) peptid se 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidu,
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alaninu (Ala), threoninu (Thr) nebo šeřinu (Ser),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, a
R3 je aminokyselinový zbytek ze skupiny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
C-řetězec lidského inzulínu má následující sekvenci aminokyselin (sekvence identifikačního čísla 3):
| Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin | Val | Gly | Čí? JLxx | Val | Glu | Leu |
| Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Glu | Pro | Leu | Ala | Leu |
| Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg |
2. Ve vzorci II mají symboly přednostně následující význam:
R2je
a) atom vodíku nebo
b) peptid se 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, na jehož karboxylovém konci se nachází aminokyselinový zbytek argininu (Arg),
R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,
Y je threoninový zbytek (Thr),
X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg) nebo peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, kde jsou na začátku i na konci peptidů dva bazické aminokyselinové zbytky, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, a
R3 je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu (Gly).
Zbytek Z inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorce I je zpravidla část aminokyselinové sekvence X prekurzoru podle vzorce Π a vzniká aktivitou proteáz jako je např. trypsin, trypsinu podobné enzymy nebo karboxypeptidáza B. Zbytek R3 je aminokyselinový zbytek, který má polohu A21 v A-řetězci inzulínu. Zbytek Y je aminokyselinový zbytek, který má polohu B30 v B-řetězci inzulínu.
Trypsin nebo trypsinu podobné enzymy jsou proteázy, které štěpí aminokyselinový řetězec v místě argininového nebo lysinového zbytku. Karboxypeptidáza je exoproteáza, která odštěpuje bazické aminokyselinové zbytky jako je např. Arg nebo Lys, které jsou na karboxylovém konci aminokyselinového řetězce (Kemmler et al., J. Biol. Chem., 246, s. 6786-6791).
Z prekurzoru jmenovaného v 1. bodě je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými cysteinovými můstky, přičemž Y, R1, R2, R3, A2-A20 a B2-B29 mají význam popsaný v 1. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo -OH skupina.
Z prekurzoru jmenovaného ve 2. bodě je možné získat např. inzulínový derivát podle vzorce I se správně spojenými cysteinovými můstky, přičemž Y, R1, R2, R3, A2-A20 a B2-B29 mají význam popsaný v 2. bodu a Z je argininový zbytek (Arg), peptidový zbytek Arg-Arg nebo Lys-Lys nebo -OH skupina.
Prekurzor podle vzorce II se může tvořit pomocí mnohých genových konstruktů v mikroorganizmech (viz EP 0 489 780, EP 0 347 781, EP 0 453 969). Genové konstrukty jsou exprimovány v mikroorganizmech jako jsou např. E. coli nebo streptomycéty v průběhu fermentace. Vytvářené proteiny se ukládají uvnitř mikroorganizmů (EP 0 489 780) nebo jsou vylučovány do fermentačního roztoku.
Pro způsob podle předkládaného vynálezu se může použít takový prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu podle vzorce II, který je ještě bezprostředně po rozrušení buňky znečištěn mnohými proteiny pocházejícími z fermentačního roztoku a mikroorganizmů. Prekurzor podle vzorce II se může použít také v přečištění podobě, např. po srážení nebo chromatografickém čištění.
-6CZ 295679 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 (Srovnávací příklad, stav techniky)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven fůzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
Sekvence proinzulinu 1 (sekvence identifikačního čísla 4):
| Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn |
Sekvence proinzulinu 1 odpovídá vzorci II, přičemž
X je C-peptid lidského inzulínu (sekvence i. č. 3),
Y je Thr (B30),
R1 jePhe(Bl),
R2 je peptid s 10 aminokyselinovými zbytky,
R3 jeAsn(A21)a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20)
A-řetězce lidského inzulínu a (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) Břetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí proinzulinu 1 exprimovaný v buňkách E. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním. 20 kg izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofilizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulinu 1 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6. Po případném odstředění menšího množství látek způsobujících zákal se čirý roztok rozmíchal v 9000 1 vodného cysteinového roztoku (5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulinové sekvence 1 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HC1 upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak se nastavilo pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se přidaly do roztoku 3 g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 1,25 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci.
-7CZ 295679 B6
Po štěpení karboxypeptidázou B vznikl lidský inzulín, který se dále čistil pomocí chromatografíckých metod.
Lidský inzulín odpovídá vzorci I, přičemž
Y je Thr (B30),
Z je OH,
R1 ePhe(Bl),
R3 eAsn(A21)a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Lidský inzulín 2 se skládá ze sekvencí identifikačních čísel 1 a 2, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje, jak bylo popsáno v EP 0 668 292, pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulín 2 se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografícké koloně.
Analýza pomocí HPLC
0,5 proteinu se rozpouštělo ve 40 ml roztoku o složení: 6M hydrochlorid guanidia, 50mM Tris, pH 8,5, 5mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), 1% 2-merkaptoethanol, lOmM dithiotreitol, při 95 °C po 2 minuty, a pak odstředilo 20 minut při 14000 g. 0,02 ml čirého roztoku se naneslo na HPLC kolonu.
Kolona: ®Nucleogel RP 300-5/46 (Macherey a Nagel, Aachen, Německo)
Gradient: Pufr A: 0,1% kyselina trifluoroctová (TFA)
Pufr B: 0,09% TFA v acetonitrilu
Teplota: 55 °C
Celkový čas běhu: 40 minut
Gradient je charakterizován následujícím množstvím pufru B po odpovídající době běhu:
min 25 %, 12 min 60 %, 13 min 90 %, 15 min 100 %
Průtok: 1 ml/min
Detekce: 215 nm
Retenční čas inzulínu: asi 19 minut
-8CZ 295679 B6
Příklad 2 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (viz EP 0 489 780) se připravil fúzní protein s aminokyselinovou sekvencí, která je uvedena v příkladu 1 (sekvence proinzulinu 1, sekvence i. č. 4). Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulinu 1 se shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
K vodné suspenzi fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (stanoveno lyofílizací alikvotní části) se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
Suspenze proinzulinu 1 (podíl inzulín obsahujícího fúzního proteinu stanovený pomocí HPLC činil 50 %) se rozpustila v 550 1 8M močoviny při pH 10,2 při 40 °C. Čirý roztok se přimíchal k 9000 1 vody při pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 5 hodinách se pomocí analytické HPLC v lOkg várce stanovil obsah proinzulinu I se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně. 9500 1 roztoku se pomocí IN HC1 upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se do roztoku přidalo 10 g trypsinu. Vznikly tak 4 kg inzulínu s 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci. Po štěpení karboxypeptidázou B vznikl lidský inzulín (sekvence i. č. 1 a 2 se správně spojenými cysteinovými můstky). Roztok se dále pomocí adsorpční pryskyřice zakoncentroval a čistil. Eluát obsahující inzulín 2 se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
Příklad 3 (Srovnávací příklad, stav techniky)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven fúzní protein s následující aminokyselinovou sekvencí.
Sekvence proinzulinu 2 (sekvence i. č. 5):
| Ala | Thr | Thr | ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| Cys | Gly | Ser | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | g fy |
Sekvence proinzulinu 1 odpovídá vzorci II, přičemž
X e C-peptid lidského inzulínu (sekvence id. č. 3),
Y e Thr (B30),
R1 ePhe(Bl),
-9CZ 295679 B6
R2 e peptid s 10 aminokyselinovými zbytky,
R3 e Gly (A21) a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu.
Fúzní protein se sekvencí proinzulinu 2 exprimovaný v buňkách E. coli se shromažďoval v buňkách a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
g izolovaných částic fúzního proteinu (vztaženo na suchou hmotnost po lyofílizaci, podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulinu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,6 a teplotě 20 °C. Čirý roztok se rozmíchal v 9000 1 vodného cysteinového roztoku (5 g hydrátu hydrochloridu cysteinu) při hodnotě pH 10,6 a teplotě 4 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 24 hodinách se ve 3kg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulinové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 30% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HCl upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se přidaly do roztoku 3 g trypsinu. Podle měření HPLC tak vzniklo 0,9 kg inzulínového derivátu se 2 argininovými zbytky na karboxylovém konci.
Tento inzulínový derivát odpovídá vzorci I, přičemž Y je Thr (B30),
Z e Arg-Arg,
R1 ePhe(Bl),
R3 eGly(A21)a (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 20) A-řetězce lidského inzulínu a (B2B29) jsou aminokyselinové zbytky (v polohách 2 až 29) B-řetězce lidského inzulínu, a skládá se ze sekvencí identifikačních čísel 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulínový derivát se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
Příklad 4 (Způsob podle předkládaného vynálezu)
Fermentací geneticky modifikovaných buněk E. coli (EP 0 489 780) byl připraven podle příkladu 3 fúzní protein se sekvencí proinzulinu 2 (sekvence i. č. 5).
Exprimovaný fúzní protein se sekvencí proinzulinu 2 se shromažďoval v buňkách E. coli a tvořil uzavřenou částici. Po skončení fermentace se buňky oddělily odstřeďováním a obvyklou vysokotlakou homogenizací rozrušily. Uvolněné částice fúzního proteinu se pak izolovaly odstředěním.
Do vodné suspenze fúzního proteinu obsahující 40 kg fúzního proteinu (jak bylo stanoveno lyofilizací alikvotní části) se přidalo 5 kg hydrátu hydrochloridu cysteinu.
-10CZ 295679 B6
Suspenze s proteinem (podíl fúzního proteinu obsahující inzulín byl určen pomocí HPLC a činil 50 %) se sekvencí odpovídající proinzulinu 2 se rozpustilo v 550 1 8M roztoku močoviny při pH 10,2 a teplotě 40 °C. Čirý roztok se přimíchal do 9000 1 vody při hodnotě pH 10,6 a teplotě 15 °C. Po ukončení skladebné reakce asi po 5 hodinách se v lOkg várce pomocí analytické HPLC stanovil obsah proinzulinové sekvence 2 se správně spojenými cysteinovými můstky, který odpovídal 50% přeměně.
9500 1 roztoku se pomocí IN HC1 upravilo na pH 5,0 a separovalo. Pak následovalo nastavení na pH 9,0 přidáním hydroxidu sodného. Pak se přidalo do roztoku 10 g trypsinu. Tak vzniklo 2,8 kg inzulínového derivátu (podle měření HPLC), který se skládá ze sekvencí id. č. 6 a 7, které jsou navzájem spojeny správně spojenými cysteinovými můstky.
Roztok se zakoncentruje pomocí adsorpční pryskyřice a přečistí. Eluát obsahující inzulínový derivát se bezprostředně po naředění vodou a nastavení hodnoty pH může dále čistit na chromatografické koloně.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...21 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:
Cly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu
5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein
-11 CZ 295679 B6 (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...30 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...35 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:
| Arg Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin | Val | Gly Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||
| Gly Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin | Pro | Leu Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu |
| 20 | 25 | 30 |
Gin Lys Arg (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
- 12CZ 295679 B6 (A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...96 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:
| Ala Thr Thr | Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg Phe Val Asn Gin | His 15 Glu | Leu Arg | ||||||||||||
| 1 Cys | Gly Ser | 5 His Leu 20 | Val Glu | Ala | 10 | ||||||||||
| Leu 25 | Tyr | Leu Val | Cys | Gly 30 | |||||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | cly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly | Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | Cys | Ser | Léu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Asn |
| 85 | 90 | 95 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix)ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...96 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:
-13CZ 295679 B6
| Ala | Thr | Thr | Ser | Thr | Gly | Asn | Ser | Ala | Arg | Phe | Val | Asn | Gin | His | Leu |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| cys | Gly | Sex | His | Leu | Val | Glu | Ala | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | Glu | Ala | Glu | Asp | Leu | Gin |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | Gly | Gin | Val | Glu | Leu | Gly Gly | Gly | Pro | Gly | Ala | Gly | Ser | Leu | Gin | |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Ala | Leu | Glu | Gly | Ser | Leu | Gin | Lys | Arg | Gly | Ile | Val | Glu | Gin |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Cys | Cys | Thr | Ser | Ile | cys | Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu | Asn | Tyr | Cys | Gly |
| 85 | 90 | 95 |
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:
Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 3 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
25 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Escherichia coli
-14CZ 295679 B6 (ix) ZNAK:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: protein (B) POZICE: 1...32 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:
Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob přípravy inzulínu nebo inzulínového derivátu se správně spojenými cysteinovými můstky z prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu v přítomnosti cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu a chaotropní pomocné látky, vyznačující se tím, že se postupně provedou následující kroky:a) smíchá se vodná suspenze prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu s takovým množstvím cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu, které poskytne 1 až 15 SH-zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu,b) suspenze prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu se vnese do 4 až 9M roztoku chaotropní pomocné látky při pH 8 až 11,5 a teplotě 15 až 55 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě 10 až 60 minut, ac) směs se vnese při pH 8 až 11,5 a teplotě 5 až 30 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na přibližně 1 až 5mM koncentraci a chaotropní pomocná látka na 0,2 až 1,0M koncentraci.
- 2. Způsobpodlenároku 1, vyznačuj ící se tím, že v kroku a) množství cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu odpovídá takovému množství, které poskytuje 1 až 6 SH-zbytků cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na každý cysteinový zbytek prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu, v kroku b) se vnese suspenze prekurzorů inzulínu nebo inzulínového derivátu obsahující cystein nebo hydrochlorid cysteinu do 4 až 9M roztoku chaotropní pomocné látky při pH 8 až 11 a teplotě 30 až 45 °C a získaná směs se udržuje na této teplotě po 20 až 40 minut, a v následujícím kroku c) se vnese směs při pH 8 až 11 a při teplotě 15 až 20 °C do vody v takovém množství, že se cystein nebo hydrochlorid cysteinu ve směsi naředí na koncentraci přibližně 1 až 5mM a chaotropní pomocná látka na koncentraci 0,2 až l,0M.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je guanidin nebo hydrochlorid guanidinu.-15 CZ 295679 B6
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že chaotropní pomocná látka je močovina.
- 5. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4, vyznač u j í cí se tí m, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je 7,0 až 9,0M.
- 6. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že teplota v kroku b) je 40 °C.
- 7. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že pH v kroku b) je 10 až 11.
- 8. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 7, vyznačující se tím,žepH v kroku c) je 10 až 11.
- 9. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že v kroku c) množství vody poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 10. Způsob podle jednoho nebo několika z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že koncentrace chaotropní pomocné látky v kroku b) je 8M, teplota v kroku b) je 40 °C, pH v kroku b) je 10,6, pH v kroku c) je 10,6, a množství vody v kroku c) poskytne ve směsi naředění cysteinu nebo hydrochloridu cysteinu na 2,5 až 3mM koncentraci a chaotropní pomocné látky na 0,5M koncentraci.
- 11. Způsob podle jednoho nebo několika nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že prekurzor inzulínu nebo inzulínového derivátu má sekvenci podle obecného vzorce IIR2-R,-(B2-B29)-Y-X-Gly-(A2-A20)-R3 (II), kdeR2jea) atom vodíku,b) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), neboc) peptid se 2 až 45 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidů,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe) nebo kovalentní vazba, (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách,Y je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek,X jea) aminokyselinový zbytek ze skupiny lysinu (Lys) nebo argininu (Arg), nebob) peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky obsahující aminokyselinový zbytek lysinu (Lys) nebo argininu (Arg) na N-konci a karboxylovém konci peptidů, neboc) peptid se 2 až 35 geneticky kódovatelnými aminokyselinami, obsahující 1 až 5 histidinových zbytků (His),-16CZ 295679 B6 (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, zvířecího inzulínu nebo případně inzulínového derivátu pozměněného v jedné nebo více polohách, aR3 je geneticky kódovatelný aminokyselinový zbytek.
- 12. Způsobpodlenároku 11, vyznačuj ící se t í m , že ve vzorci IIR2 jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až 25 aminokyselinovými zbytky, obsahující aminokyselinový zbytek argininu (Arg) na karboxylovém konci peptidu,R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek ze skupiny alanin (Ala), threonin (Thr) nebo serin (Ser),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid s aminokyselinovou sekvencí C-řetězce lidského inzulínu, (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek ze skupiny asparaginu (Asn), šeřinu (Ser) nebo glycinu (Gly).
- 13. Způsob podle nároku 11, vy z n a č uj í c í se t í m , že ve vzorci IIR2 jea) atom vodíku nebob) peptid s 2 až 15 aminokyselinovými zbytky, kde na karboxylovém konci peptidu se nachází aminokyselinový zbytek argininu (Arg),R1 je fenylalaninový zbytek (Phe), (B2-B29) jsou aminokyselinové zbytky v polohách B2 až B29 B-řetězce lidského inzulínu,Y je aminokyselinový zbytek threoninu (Thr),X je aminokyselinový zbytek argininu (Arg), nebo peptid se 2 až 35 aminokyselinovými zbytky, přičemž na začátku a na konci peptidu jsou dva bazické aminokyselinové zbytky, zvláště arginin (Arg) a/nebo lysin (Lys), (A2-A20) jsou aminokyselinové zbytky v polohách A2 až A20 A-řetězce lidského inzulínu, aR3 je aminokyselinový zbytek asparaginu (Asn) nebo glycinu (Gly).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19735711A DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 1997-08-18 | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ259898A3 CZ259898A3 (cs) | 1999-03-17 |
| CZ295679B6 true CZ295679B6 (cs) | 2005-09-14 |
Family
ID=7839275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982598A CZ295679B6 (cs) | 1997-08-18 | 1998-08-17 | Způsob získávání inzulinu nebo derivátů inzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5986048A (cs) |
| EP (2) | EP0980874B1 (cs) |
| JP (1) | JP4291900B2 (cs) |
| KR (2) | KR100537842B1 (cs) |
| CN (3) | CN1483831B (cs) |
| AR (1) | AR016821A1 (cs) |
| AT (2) | ATE217636T1 (cs) |
| AU (1) | AU744824B2 (cs) |
| BR (2) | BRPI9816233B8 (cs) |
| CA (1) | CA2245151C (cs) |
| CZ (1) | CZ295679B6 (cs) |
| DE (3) | DE19735711C2 (cs) |
| DK (2) | DK0906918T3 (cs) |
| ES (2) | ES2176870T3 (cs) |
| HU (2) | HU228203B1 (cs) |
| ID (1) | ID20717A (cs) |
| PL (1) | PL191901B1 (cs) |
| PT (2) | PT980874E (cs) |
| RU (2) | RU2205836C2 (cs) |
| TR (1) | TR199801587A2 (cs) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DE19930676B4 (de) * | 1999-07-02 | 2006-01-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Verfahren zur Stabilisierung von Insulin, Insulinderivaten und/oder deren Vorläufer in komplexen Mischungen bei deren Lagerung in wäßrigen Lösungsmitteln |
| AU2151401A (en) | 1999-12-22 | 2001-07-03 | Novo Nordisk A/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
| US20030212248A1 (en) * | 2000-07-12 | 2003-11-13 | Furman Thomas Charles | Process to increase protein stability |
| DE10235168A1 (de) * | 2002-08-01 | 2004-02-12 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Preproinsulin |
| DE102004015965A1 (de) * | 2004-04-01 | 2005-10-20 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Gewinnung von Insulinen durch verbesserte Luftbegasung der Faltung |
| EP1973942B1 (en) | 2005-12-22 | 2011-02-09 | Genentech, Inc. | Recombinant production of heparin binding proteins |
| SG162834A1 (en) | 2006-07-14 | 2010-07-29 | Genentech Inc | Refolding of recombinant proteins |
| KR20110016430A (ko) * | 2007-07-03 | 2011-02-17 | 암젠 인코퍼레이티드 | 봉입체 건량을 이용한 단백질 측정 |
| RU2451750C2 (ru) * | 2007-09-24 | 2012-05-27 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека |
| ES2613152T3 (es) | 2008-01-09 | 2017-05-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Nuevos derivados de insulina con perfil tiempo/acción extremadamente retardado |
| WO2009133529A2 (en) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Wockhardt Research Centre | Processes for refolding of insulin |
| CR20170369A (es) | 2008-10-17 | 2017-11-01 | Sanofi Aventis Deutschland | COMBINACIÓN DE UNA INSULINA Y UN AGONISTA DE GLP-1 (Divisional 2011-0188) |
| WO2011058082A1 (de) | 2009-11-13 | 2011-05-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin |
| PL2498802T3 (pl) | 2009-11-13 | 2015-06-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Kompozycja farmaceutyczna zawierająca agonistę GLP-1, insulinę i metioninę |
| SG187904A1 (en) | 2010-08-30 | 2013-04-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Use of ave0010 for the manufacture of a medicament for the treatment of diabetes mellitus type 2 |
| US9821032B2 (en) | 2011-05-13 | 2017-11-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin |
| TWI559929B (en) | 2011-09-01 | 2016-12-01 | Sanofi Aventis Deutschland | Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease |
| US12157766B2 (en) * | 2012-08-05 | 2024-12-03 | Absci Corporation | Cytoplasmic expression system |
| WO2014099577A1 (en) | 2012-12-17 | 2014-06-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| PE20151409A1 (es) * | 2013-02-26 | 2015-10-07 | Hanmi Pharm Ind Co Ltd | Analogo de insulina novedoso y su uso |
| CN103694339B (zh) * | 2013-12-04 | 2017-10-13 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种甘精胰岛素前体的复性方法 |
| US10407483B2 (en) | 2014-03-14 | 2019-09-10 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| EP3229828B1 (en) | 2014-12-12 | 2023-04-05 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation |
| TWI748945B (zh) | 2015-03-13 | 2021-12-11 | 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患治療 |
| TW201705975A (zh) | 2015-03-18 | 2017-02-16 | 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 | 第２型糖尿病病患之治療 |
| CN104911203A (zh) * | 2015-06-30 | 2015-09-16 | 成都易胜科生物科技有限公司 | 一种重组人胰岛素的工业制备方法 |
| EP3344651B1 (en) | 2015-09-02 | 2022-03-02 | Merck Sharp & Dohme Corp. | A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds |
| WO2017205309A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Insulin receptor partial agonists |
| WO2018018613A1 (zh) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法 |
| CN113773391B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-10-20 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素的制备方法 |
| CN113773400B (zh) * | 2020-06-09 | 2023-08-18 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种门冬胰岛素衍生物及其应用 |
| CN113773396A (zh) * | 2020-06-10 | 2021-12-10 | 宁波鲲鹏生物科技有限公司 | 一种地特胰岛素衍生物及其应用 |
| JP7749397B2 (ja) * | 2021-09-30 | 2025-10-06 | キヤノン株式会社 | 超音波ファントム及び超音波ファントムの製造方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| DE3501641A1 (de) * | 1985-01-19 | 1986-07-24 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur gewinnung von insulin-vorlaeufern aus reaktionsgemischen, die bei der faltung von insulin-vorlaeufern aus den entsprechenden s-sulfonaten anfallen |
| GR1005153B (el) * | 1989-08-29 | 2006-03-13 | The General Hospital Corporation | Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους. |
| RU2045535C1 (ru) * | 1991-06-18 | 1995-10-10 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Способ получения проинсулина человека |
| ES2097426T3 (es) * | 1992-12-02 | 1997-04-01 | Hoechst Ag | Procedimiento para la obtencion de proinsulina con puentes de cistina correctamente unidos. |
| DE4405179A1 (de) * | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| RU2081122C1 (ru) * | 1994-06-16 | 1997-06-10 | Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН | Способ выделения и очистки инсулина или его биотехнологических предшественников |
| JP4624495B2 (ja) * | 1994-12-29 | 2011-02-02 | フェリング・インターナショナル・センター・エス．・エー． | ヒト・インスリンの生成 |
| DE19735711C2 (de) | 1997-08-18 | 2001-04-26 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Vorläufers von Insulin oder Insulinderivaten mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
-
1997
- 1997-08-18 DE DE19735711A patent/DE19735711C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-11 ES ES98115048T patent/ES2176870T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 ES ES99115386T patent/ES2177178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 EP EP99115386A patent/EP0980874B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DK DK98115048T patent/DK0906918T3/da active
- 1998-08-11 AT AT98115048T patent/ATE217636T1/de active
- 1998-08-11 DE DE59804121T patent/DE59804121D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 PT PT99115386T patent/PT980874E/pt unknown
- 1998-08-11 EP EP98115048A patent/EP0906918B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 DE DE59803985T patent/DE59803985D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-11 AT AT99115386T patent/ATE217012T1/de active
- 1998-08-11 DK DK99115386T patent/DK0980874T3/da active
- 1998-08-11 PT PT98115048T patent/PT906918E/pt unknown
- 1998-08-14 ID IDP981136A patent/ID20717A/id unknown
- 1998-08-14 CA CA002245151A patent/CA2245151C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 AR ARP980104052A patent/AR016821A1/es active IP Right Grant
- 1998-08-17 TR TR1998/01587A patent/TR199801587A2/xx unknown
- 1998-08-17 CZ CZ19982598A patent/CZ295679B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 HU HU0600287A patent/HU228203B1/hu unknown
- 1998-08-17 AU AU80763/98A patent/AU744824B2/en not_active Expired
- 1998-08-17 JP JP23036898A patent/JP4291900B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN031523307A patent/CN1483831B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 CN CN98117909A patent/CN1132845C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 RU RU98116259/04A patent/RU2205836C2/ru active
- 1998-08-17 BR BRPI9816233A patent/BRPI9816233B8/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-08-17 CN CN2006101000625A patent/CN101186940B/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 BR BR9803755-2A patent/BR9803755A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-08-17 US US09/134,836 patent/US5986048A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-17 HU HU9801886A patent/HU228161B1/hu unknown
- 1998-08-18 KR KR1019980033384A patent/KR100537842B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-18 PL PL328108A patent/PL191901B1/pl unknown
-
1999
- 1999-08-31 US US09/386,303 patent/US6380355B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-09-07 US US09/947,563 patent/US6727346B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-10-07 RU RU2002126598/15A patent/RU2302882C2/ru active
-
2005
- 2005-05-27 KR KR1020050044974A patent/KR100574580B1/ko not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ295679B6 (cs) | Způsob získávání inzulinu nebo derivátů inzulinu se správně spojenými cysteinovými můstky | |
| JP3863579B2 (ja) | 正しく連結されたシスチン架橋を有するインシュリンを得る方法 | |
| US5473049A (en) | Process for obtaining proinsulin possessing correctly linked cystine bridges | |
| US5491216A (en) | Tri-arginine insulins | |
| FI79860B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humaninsulin des-pheb1-humaninsulin eller derivat daerav ur svininsulin, des-pheb1-svininsulin eller derivat daerav. | |
| DK172242B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af insulinderivater | |
| US7659363B2 (en) | Process for the preparation of insulin or an insulin derivative in the presence of oxygen | |
| NZ196609A (en) | Preparation of proinsulin-like insulin precursors | |
| EP0087238A1 (en) | Am improved method for preparing human insulin from non-human insulin | |
| EP0490249A1 (en) | Process for the enzymatic preparation of GRF(1-44)NH2 | |
| MXPA98006666A (en) | Improved procedure for the obtaining of insulin precursors with cistina bridges correctly uni | |
| HK1119449B (en) | Process for obtaining insulin or insulin derivatives having correctly bonded cystine bridges | |
| HK1010457B (en) | Process to obtain insulin with correct cystin bridges |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20180817 |