CN116606370A - 一种天然IgM纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天然IgM纯化的方法，取天然血清，在0‑4℃透析35‑40 h后离心，沉淀用PBS溶解后膜过滤；滤液经protein G纯化收集流穿液，再用DEAE阴离子交换层析柱纯化，收集洗脱液；将上述的洗脱液用preConA介质的平衡液进行透析，用preConA填料进行纯化，收集流穿液；将氯化钠添加到上述的流穿液中直至最终浓度为0.2‑0.5M，将所述溶液的pH调节至4.0‑5.5，再用CMQZT6FF阳离子交换层析柱纯化，收集洗脱液；用PBS透析上述洗脱液，分子筛纯化后电泳合并纯度，浓缩干燥后得到样品。本发明所涉及的天然IgM纯化的方法将预处理后的天然血浆仅通过特定的层析组合方式即可提高IgM的纯度，方法步骤简单，能够纯化出活性好纯度高的天然IgM蛋白。
Description
技术领域
本发明属于抗体技术领域，特别涉及一种天然IgM纯化的方法。
背景技术
免疫球蛋白是浆细胞在各种生理和病理条件下受抗原刺激而产生的糖蛋白分子，通常由两条重链和两条轻链形成的一个Y型结构，免疫球蛋白可分为IgM、IgG、IgD、IgA、IgE五类，其中IgM占血清免疫球蛋白总量的5%~10%，血清浓度约1mg/ml；IgM在抗体介导的体液免疫反应中表现出极强的抗原中和及免疫调节作用等，是机体抗感染和免疫刺激后首先产生的抗体。
目前没有很好纯化方法或者一步法从血清中纯化出目的蛋白，所以采用多步法从血清中纯化出天然的目的蛋白。现有技术中从血浆中提取免疫球蛋白，通常采用辛酸-硫酸铵法：即先将蛋白质沉淀或者浓缩，复溶后用辛酸-硫酸铵法去除杂蛋白得到粗提物，再用疏水柱、羟基磷酸石灰石进一步纯化，最后再用蛋白G树脂纯化，收集流穿液。辛酸-硫酸铵法的目的在于尽可能的提取出血浆中的IgM蛋白，因此对于血浆后续产品提纯操作过多，容易导致产品品质降低，且分离效率不高。
由于天然的血清中IgM的含量很低且血清中成分复杂所以高纯度的天然IgM很难纯化出来。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种天然IgM纯化的方法，以解决相关方法收率和纯度较低的技术问题。
本发明的上述技术目的是通过如下方案实现的：一种天然IgM纯化的方法，包括：
S1:取天然血清，在0-4℃透析35-40 h后离心，沉淀用PBS溶解后膜过滤；滤液经protein G纯化收集流穿液，再用DEAE阴离子交换层析柱纯化，收集洗脱液；
S2:将上述的洗脱液用preConA介质的平衡液进行透析，用preConA填料进行纯化，收集流穿液；
S3:将氯化钠添加到上述的流穿液中直至最终浓度为0.2-0.5M，将所述溶液的pH调节至4.0-5.5，再用CMQZT6FF阳离子交换层析柱纯化，收集洗脱液；
S4:用PBS透析上述洗脱液，分子筛纯化后电泳合并纯度，浓缩干燥后得到样品。
进一步的，所述使用DEAE阴离子柱的平衡方式为用不超过20mM PBS(例如19mM、18mM、15mM、12mM、10mM)的缓冲液平衡2-4个柱体积；
所述DEAE阴离子柱使用不超过20mM PB(例如19mM、18mM、15mM、12mM、10mM)、1MNaCl(例如0.9mM、0.8mM、0.7mM、0.6mM、0.5mM)的缓冲液进行洗脱；
所述DEAE阴离子柱调节PH至7.2-8.6。
进一步的，所述平衡介质后上样，100％洗脱液进行洗脱，所述洗脱的流速为60-240cm/h。
进一步的，所述使用preConA介质柱的柱床体积与上样体积的比例为1:(2-20)；
所述preConA介质柱的平衡方式为用含有不超过20mM Tris-HC、不超过0.5MNaCl、1mM CaCl2 、1mM MnCl2、pH＝7.9-8.7的缓冲液平衡2-5个柱体积；
所述洗脱为用不超过20mM Tris-HCl、不超过0.5M NaCl、1mM CaCl2 、1mM MnCl2 、0.1M ɑ-D-甲基葡萄糖苷、pH＝7.9-8.7的缓冲液进行洗脱；
所述洗脱的流速为60-240cm/h。
进一步的，所述CMQZT6FF阳离子交换层析柱的柱床体积与上样体积的比例为1:(2-40)；
优选地，所述阳离子交换层析柱的平衡方式为：用含有不超过100mM柠檬酸钠(例如100mM、90mM、80mM、70mM、60mM)、pH＝4.0-6.9的缓冲液平衡2-5个柱体积；
所述洗脱用不超过100mM柠檬酸钠(例如100mM、90mM、80mM、70mM、60mM)、不超过1.5M氯化钠(例如1.5mM、1.4mM、1.3mM、1.2mM、1.0mM)、pH＝4.0-6.9的缓冲液进行洗脱；
所述洗脱的流速为60-240cm/h。
进一步的，所述分子筛采用Finedex 200，粒 径 范 围：prep grade：24-44μm，anal grade：10-24μm。
进一步的，所述膜过滤中过滤膜孔径大小为0.45μm或者0.22μm。
本发明相对现有技术具有如下优点：
本方案采用了新的思路纯化天然的IgM，由于血清中含有大量的IgG，严重影响后续的纯化，所以采用不结合IgM的填料protein G去除IgG。
通过多次层析纯化从天然血清中提取出IgM,减少了传统饱和硫酸铵法中多次透析工序处理工序，提高了提取效率。
本方案全部操作流程可在常规车间厂房内进行，不需要创造长时间的低温环境，减少能耗，进一步降低了生产成本。
实验证明，本方案中案所用的方法中，先用preConA柱纯化，再使用CMQZT6FF介质柱进行纯化完成后，得到IgM的纯度为97%和收率73%。
附图说明
图1是本发明提纯天然蛋白操作流程图；
图2是本发明天然血清纯水沉淀PBS重悬后的上清电泳示意图；
图3是本发明经分子筛纯化后样品电泳示意图。
附图标记：1.上清 2.流穿液 3.洗杂液 4.洗脱液（非还原胶）
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，下述的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法，例如蛋白质技术手册(汪家政，范明主编.科学出版社，2000)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一
一种天然IgM纯化的方法，依次包括以下步骤：
S1、血清准备
取100mL天然血清过夜透析到超纯水中，第二天以4℃，8000rpm离心20min，留沉淀弃上清，去除一些杂蛋白。用50mL的0.01M pH7.4 PBS 重悬沉淀，搅拌半小时。以4℃，8000rpm的条件离心稀释液20min，用孔径为0.45μm的滤膜对上清液进行过滤，然后使用Protein G纯化介质（L00209）对影响IgM纯化最大的影响蛋白IgG进行去除，收集流穿液。再将流穿液用DEAE阴离子柱纯化，不用透析更换PBS缓冲液，用1M NaCl洗脱，收集洗脱液，可以实现去除部分杂蛋白以及浓缩目的蛋白的作用。
通过纯水沉淀、Protein G亲和纯化、DEAE阴离子柱纯化去除大部分的IgG、凝血因子、脂蛋白等杂蛋白，以便后续步骤更好的提取所需的目的蛋白。
S2、preConA层析柱
preConA柱是一种将伴刀豆球蛋白A与琼脂糖偶联，用于纯化一些糖蛋白的填料。
用含有20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、1mM CaCl2 、1mM MnCl2的平衡缓冲液平衡preCon A填料，其平衡缓冲液pH值7.2-7.6。将含有20mM Tris-HCl、0.5M NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2 、0.1M ɑ-D-甲基葡萄糖苷的溶液作为洗脱液，pH调节到和平衡缓冲液一致。
将步骤S1得到的流穿液透析到preConA填料的平衡液中，透析结束后8000rpm离心10min，再用0.22μm滤膜过滤，然后上样。以线性流速1-3cm/min收集第二次流穿液，此时，IgM蛋白跟随洗脱液流出preCon A柱，收集流穿液。
S3、CMQZT6FF层析柱
将CM QZT6FF介质装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:5，装填好的层析柱使用平衡缓冲液(柠檬酸钠50mmol/L、pH＝5.0)平衡；将步骤S2得到的流穿液泵入CMQZT6FF层析柱；再使用缓冲液(柠檬 酸钠50mmol/L、氯化钠1.0mol/L、pH＝5.0)洗脱，收集层析过程中的洗脱液；层析过程中控制流速240cm/h。
S4、纯化IgM样品
后续可继续重复提纯上述步骤S3中得到的洗脱液内IgM产品，也可采取其他方式。本实施例中采用更经济便捷的分子筛纯化方式，应该理解，采用其他纯化方式并不脱离本发明技术方案的宗旨和范围。
分子筛纯化
用孔径为0.45μm滤膜过滤上一步的洗脱液，用PBS重悬，采用Finedex 200分子筛纯化，得到滤液后用SDS-PAGE电泳合并纯度，浓缩干燥后得到样品。
实施例二
一种天然IgM纯化的方法，依次包括以下步骤：
S1、血清准备
取100mL天然血清过夜透析到超纯水中，第二天以4℃，8000rpm离心20min，留沉淀弃上清，去除一些杂蛋白。用50mL的0.01M pH7.4 PBS 重悬沉淀，搅拌半小时。以4℃，8000rpm的条件离心稀释液20min，用孔径为0.45μm的滤膜对上清液进行过滤，然后使用Protein G纯化介质（L00209）对影响IgM纯化最大的影响蛋白IgG进行去除，收集流穿液。再将流穿液用DEAE阴离子柱纯化，不用透析更换PBS缓冲液，用1M NaCl洗脱，收集洗脱液，可以实现去除部分杂蛋白以及浓缩目的蛋白的作用。
通过纯水沉淀、Protein G亲和纯化、DEAE阴离子柱纯化去除大部分的IgG、凝血因子、脂蛋白等杂蛋白，以便后续步骤更好的提取所需的目的蛋白。
S2、CM QZT6FF层析柱
将CM QZT6FF介质装填在层析柱内，柱床体积与上样体积的比例为1:5，装填好的层析柱使用平衡缓冲液(柠檬酸钠50mmol/L、pH＝5.0)平衡；将步骤S1得到的流穿液泵入CMQZT6FF层析柱；再使用缓冲液(柠檬 酸钠50mmol/L、氯化钠1.0mol/L、pH＝5.0)洗脱，收集层析过程中的洗脱液；层析过程中控制流速240cm/h。
S3、纯化IgM样品
用孔径为0.45μm滤膜过滤上一步的洗脱液，用PBS重悬，采用Finedex 200分子筛纯化，得到滤液后用SDS-PAGE电泳合并纯度，浓缩干燥后得到样品。
对比例一
水沉淀和分子筛纯化天然的IgM，依次包括以下步骤：
取5mL的天然血清，透析到纯水中，透析3天，然后以8000rpm离心20min，收集沉淀，弃上清，用等体积的PBS重悬沉淀，12000rpm离心20min，0.45μm滤膜过滤，用Finedex 200分子筛纯化重悬的上清，以PBS作为平衡液，0.2mL/min上样，收集第一个峰，SDS-PAGE电泳合并纯度。
对比例二
饱和硫酸铵法提取天然IgM，依次包括以下步骤：
将天然血清与等体积的PBS(pH7.4)混合后，加入饱和硫酸铵(pH7.0)溶液，使其终浓度为33%，4℃过夜。次日取出，4℃，15000g离心15min，取上清加入饱和硫酸铵，使硫酸铵终浓度为50%，4℃过夜。次日取出，4℃，15000g离心15min，弃上清，PBS(pH7.4)重悬沉淀，4℃条件下透析除盐2d，每天更换2次透析液。最后检测溶液中没有硫酸根离子和铵根离子则透析完成。SDS-PAGE电泳合并纯度，电泳后，将凝胶置于0.25%考马斯亮蓝染液中，在水平摇床上染色2~4h。之后弃去染色液，加入脱色液脱色。根据紫外可知得到的是纯度较高的IgM。
对上述方案进行验证实验：
1、实验及检测设备
实验设备采用GE Healthcare awant150；
IgM含量检测设备采用迈瑞生化分析仪。
2、实验结果计算方法
IgM纯度计算方法：采用样品中IgM含量与总蛋白质含量比值得到样品中IgM的纯度值；
IgM收率计算方法：分别根据层析不同实验步骤样品中IgM含量(即IgM检测值乘以样品体积)与层析前样品中IgM含量(即IgM检测值乘以样品收集体积)的比值而得到不同步骤样品中IgM的收率；
上述纯度、收率计算根据实验设备提供的数据进行计算，存在一定误差。
进行实验：实验重复三次取平均值：
| 实施1 | 实施2 | 对比1 | 对比2 | |
| preConA介质PH | 7.4 | — | — | — |
| CM QZT6FF介质PH | 5.0 | 5.0 | — | — |
| IgM纯度 | 97.7％ | 85.4％ | 82.0％ | 90.5％ |
| IgM收率 | 73.2％ | 77.1％ | 55.9％ | 54.3％ |
上述纯度、收率计算根据实验设备提供的数据进行计算，存在一定误差。
通过上述实验表明，本方案所用的方法分离IgM的方法中，IgM的收率平均达到70％以上、纯度可达85％以上。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种天然IgM纯化的方法，其特征在于，包括：
S1:取天然血清，在0-4℃透析35-40 h后离心，沉淀用PBS溶解后膜过滤；滤液经protein G纯化收集流穿液，再用DEAE阴离子交换层析柱纯化，收集洗脱液；
S2:将上述的洗脱液用preConA介质的平衡液进行透析，用preConA填料进行纯化，收集流穿液；
S3:将氯化钠添加到上述的流穿液中直至最终浓度为0.2-0.5M，将所述溶液的pH调节至4.0-5.5，再用CMQZT6FF阳离子交换层析柱纯化，收集洗脱液；
S4:用PBS透析上述洗脱液，分子筛纯化后电泳合并纯度，浓缩干燥后得到样品。
2.根据权利要求1所述的天然IgM纯化的方法，其特征在于，所述使用DEAE阴离子柱的平衡方式为用不超过20mM PBS的缓冲液平衡2-4个柱体积；
所述DEAE阴离子柱使用不超过20mM PB、1M NaCl的缓冲液进行洗脱；
所述DEAE阴离子柱调节PH至7.2-8.6。
3.根据权利要求2所述的天然IgM纯化的方法，其特征在于，所述平衡介质后上样，100％洗脱液进行洗脱，所述洗脱的流速为60-240cm/h。
4.根据权利要求1所述的天然IgM纯化的方法，其特征在于，所述使用preConA介质柱的柱床体积与上样体积的比例为1:(2-20)；
所述preConA介质柱的平衡方式为用含有不超过20mM Tris-HCl、不超过0.5M NaCl、1mM CaCl2 、1mM MnCl2、pH＝7.2-7.6的缓冲液平衡2-5个柱体积；
所述洗脱为用不超过20mM Tris-HCl、不超过0.5M NaCl、1mM CaCl2 、1mM MnCl2 、0.1Mɑ-D-甲基葡萄糖苷、pH＝7.2-7.6的缓冲液进行洗脱；
所述洗脱的流速为60-240cm/h。
5.根据权利要求1所述的天然IgM纯化的方法，其特征在于，所述CMQZT6FF阳离子交换层析柱的柱床体积与上样体积的比例为1:(2-40)；
优选地，所述阳离子交换层析柱的平衡方式为：用含有不超过100mM柠檬酸钠、pH＝4.0-6.9的缓冲液平衡2-5个柱体积；
所述洗脱为用不超过100mM柠檬酸钠、不超过1.5M氯化钠、pH＝4.0-6.9的缓冲液进行洗脱；
所述洗脱的流速为60-240cm/h。
6.根据权利要求1所述的天然IgM纯化的方法，其特征在于，所述分子筛采用Finedex200，粒径范围：prep grade：24-44μm，anal grade：10-24μm。
7.根据权利要求1所述的天然IgM纯化的方法，其特征在于，所述膜过滤中过滤膜孔径大小为0.45μm或者0.22μm。
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