CN112409477A - IgM纯化方法 - Google Patents
IgM纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112409477A CN112409477A CN201910772305.7A CN201910772305A CN112409477A CN 112409477 A CN112409477 A CN 112409477A CN 201910772305 A CN201910772305 A CN 201910772305A CN 112409477 A CN112409477 A CN 112409477A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- igm
- protein
- chromatography
- concentration
- equilibrium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 56
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 16
- 235000019738 Limestone Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000006028 limestone Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 7
- MPNNOLHYOHFJKL-UHFFFAOYSA-N peroxyphosphoric acid Chemical compound OOP(O)(O)=O MPNNOLHYOHFJKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 6
- MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 23
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 16
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 14
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 9
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 8
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims description 6
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 6
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 6
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003918 blood extract Substances 0.000 claims description 2
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 claims description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 claims description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- GEWYFWXMYWWLHW-UHFFFAOYSA-N azanium;octanoate Chemical compound [NH4+].CCCCCCCC([O-])=O GEWYFWXMYWWLHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 102100029571 Immunoglobulin J chain Human genes 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 150000001555 benzenes Chemical class 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002964 rayon Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种IgM纯化方法，包括：a.提供包含IgM的样品；b.经至少一次蛋白质沉淀处理和至少一次蛋白质浓缩处理得到蛋白沉淀物；c.将所述蛋白沉淀物复溶，使用辛酸‑硫酸铵法去除杂蛋白得到包含所述IgM的粗提物；d.经疏水层析处理处理，收集穿透物；e.经羟基磷酸石灰石层析，收集洗脱物；以及f.经俘获IgG的亲和层析树脂纯化处理，收集穿透物。根据本发明如上所述方法纯化得到的组合物中IgM的纯度在95％以上，且产品稳定，冻存后不易出现沉淀，抗体活性好。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种IgM纯化方法。
背景技术
IgM(免疫球蛋白M)是由5个单体通过一个J链和二硫键连接成五聚体，分子量在5类免疫球蛋白中最大，为970kD，称为巨球蛋白(macroglobulin)。这种结构使免疫球蛋白M具有较多的抗原结合价，可以同时和数个靶细胞结合。因此，免疫球蛋白M在机体抗感染免疫中起主力抗体的作用。
IgM存在于血液和淋巴液中，通常是感染反应后产生的第一种抗体，可使其他免疫系统细胞破坏异物。虽然IgM的用途比较广泛，但要获得高纯度的IgM，还是比较困难的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
简而言之，本发明涉及一种IgM纯化方法，包括：
a.提供包含IgM的样品；
b.经至少一次蛋白质沉淀处理和至少一次蛋白质浓缩处理得到蛋白沉淀物；
c.将所述蛋白沉淀物复溶，使用辛酸-硫酸铵法去除杂蛋白得到包含所述IgM的粗提物；
d.经疏水层析处理，收集穿透物；
e.经羟基磷酸石灰石层析处理，收集洗脱物；以及
f.经俘获IgG的亲和层析树脂纯化处理，收集穿透物。
本发明所提供的方法可重现性好，操作简单，根据本发明如上所述方法纯化得到的组合物中IgM的纯度在95％以上，且产品稳定，冻存后不易出现沉淀，交叉反应小，抗体活性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例纯化物的HPLC检测结果图；
图2为本发明一个实施例中SDS-PAGE纯度分析的凝胶扫胶图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种IgM纯化方法，包括：
a.提供包含IgM的样品；
b.经至少一次蛋白质沉淀处理和至少一次蛋白质浓缩处理得到蛋白沉淀物；
c.将所述蛋白沉淀物复溶，使用辛酸-硫酸铵法去除杂蛋白得到包含所述IgM的粗提物；
d.经疏水层析处理，收集穿透物；
e.经羟基磷酸石灰石层析处理，收集洗脱物；以及
f.经俘获IgG的亲和层析树脂纯化处理，收集穿透物。
本申请通过用蛋白质沉淀处理、蛋白质浓缩处理、辛酸-硫酸铵处理这三步粗纯组合，再通过疏水层析分离，羟基磷酸石灰石层析分离，俘获IgG的亲和层析树脂纯化这三步精纯组合，可高效纯化出纯度达≥95％的IgM，本发明纯化分离的样品纯度高，稳定性高，交叉反应小，活性较好。
术语“处理”可以描述样品流过或通过层析柱、树脂、膜、过滤器，或其它机构的过程，并且应包括经每一机构的连续流动以及在每一机构间暂停或停止的流动。
在一些实施方式中，本发明包含一步或多步澄清(或称收集沉淀/上清)步骤，澄清的方法可以通过一步或多步离心、微滤、超滤或深层过滤等方法进行；澄清可以在例如上述任一步操作结束后进行，例如在收集穿透物和洗脱物之前和之后进行。
在一些实施方式中，离心的条件可以如本领域公知的参数来进行。例如，可以使用约1×10-8m/s的标准化装载和约2,000×g至约15,000×g的重力进行样品的离心。
在另一实施方式中，样品可以通过一步或多步深层过滤步骤进行澄清。深层过滤指使用一系列按顺序排列的具有逐渐减小孔径的滤器从溶液中去除颗粒的方法。深层过滤器三维基质产生了样品流经的迷宫样的路径。深层过滤器的保留机制原理依靠通过基质深层时的随机吸附和机械俘获。在多种实施方式中，过滤器膜或片可以是创伤棉、聚丙烯、人造丝纤维素、玻璃纤维、烧结金属、瓷、硅藻土或其它公知的成份。在某些实施方式中，可以对包含深层过滤器膜的组分进行化学处理来带有正电电荷，即阳离子电荷，以使过滤器能够俘获负电荷粒子，如DNA、宿主细胞蛋白或聚集体。
疏水层析基质中的活性基团为烷烃或芳香烃，烷烃的长度通常在8碳以内，芳香烃一般为苯基、联苯和苯的衍生物。在一些实施方式中，所述疏水层析所采用层析基质中的活性基团为苯基和/或丁基。
本领域技术人员可获得的任何满足上述疏水层析的系统均可用在本实施方式中，例如，疏水层析所用基质可以采用聚丙烯酸酯或聚苯乙烯-二乙烯基苯等常用材料；孔径(A)可选用500～100；粒径(μm)可选自15、30、60、80等。
疏水层析分离中流动相的盐常用的有硫酸铵、氯化钠、醋酸铵、磷酸盐等。在一些实施方式中，所述疏水层析分离所用的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500mM～2000mM；例如500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1100mM、1200mM、1300mM、1400mM、1500mM、1600mM、1700mM、1800mM、1900mM、2000mM，或任两个数值所组成的范围值。
疏水层析分离中流动相的缓冲液常用的有PB/PBS、Tris-HCl、HEPES、醋酸缓冲液等。在一些实施方式中，所述疏水层析分离所用的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度≥20mM，例如30mM，40mM，50mM，且缓冲液pH＝7.0～9.0。
PB：Phosphate Buffer，磷酸缓冲液；PBS：Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液。
疏水层析是利用生物分子表面的疏水性能差异实现分离。在高盐条件下生物分子吸附在疏水层析介质的疏水基团上，降低盐浓度时，不同蛋白按疏水性从弱到强依次被洗脱，从而达到分离纯化的目的。
在一些实施方式中，所述羟基磷酸石灰石层析(CHT)的平衡与上样缓冲液的pH＝7.0～9.0。
在一些实施方式中，所述羟基磷酸石灰石层析的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度为5mM～20mM。
在一些实施方式中，所述羟基磷酸石灰石层析的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500mM～2000mM，例如500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1100mM、1200mM、1300mM、1400mM、1500mM、1600mM、1700mM、1800mM、1900mM、2000mM，或任两个数值所组成的范围值。
羟基磷酸石灰石包括两个结合位点：Ca2+和PO4 3-。这些结合位点按照其自有的晶体结构分布。PO4 3-离子与带正电的蛋白质以离子键结合，具有阳离子交换特性；其中的Ca2+离子与带负电蛋白质的自由羧基簇以金属螯合方式结合。可通过适宜的条件(特别是适宜的pH)调节羟基磷酸石灰石与IgM的结合能力，从而有效吸附去除杂质。
在一些实施方式中，羟基磷酸石灰石可以选用Bio-Rad伯乐CHT羟基磷灰石填料CHT II型，粒径尺度可以选择20μm、40μm或80μm。
在一些实施方式中，所述俘获IgG的亲和层析树脂与IgM是不亲和或低亲和的，例如可以选择蛋白A树脂、蛋白G树脂或蛋白A/G的混合树脂。
在一些实施方式中，所述俘获IgG的亲和层析树脂选自蛋白G树脂；
蛋白G层析所用的平衡与上样缓冲液的pH＝7.0～9.0。
在一些实施方式中，所述蛋白G层析所用的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度为20mM～50mM，例如20mM、30mM、40mM、50mM，或任两个数值所组成的范围值。
在一些实施方式中，所述蛋白G层析所用的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500mM～2000mM，例如500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM、1100mM、1200mM、1300mM、1400mM、1500mM、1600mM、1700mM、1800mM、1900mM、2000mM，或任两个数值所组成的范围值。
在一些实施方式中所述蛋白G层析所用的亲和填料可以选选自GE公司的ProteinG填料，例如HiTrap Protein G HP，其规格可以选择2×1mL、5×1mL、1×5mL、5×5mL、1×1mL不等。
在一些实施方式中，所述蛋白质沉淀处理包括盐析法和/或醇析法处理，例如硫酸铵沉淀法和/或聚乙二醇沉淀法处理。
在一些实施方式中，所述蛋白质浓缩处理为透析法处理。
在本发明的一个实施方式中，提供包含IgM的样品。任何包含IgM的样品均可以用在本发明中。包含IgM的样品可以包含例如细胞培养物(特别是细胞培养物上清)、血液提取物(特别是血清提取物)以及腹水(例如鼠、兔、羊、马、牛、骆驼等动物的腹水)。作为实例，可以在搅动罐生物反应器中在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达IgM。IgM可以是本领域公知的任何IgM或其片段。在一些实施方式中，也可以是IgM的融合蛋白。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1 IgM粗提
1)使用硫酸铵沉淀处理：将离心处理后的血清用PBS(pH＝7.0～8.0)稀释，加入饱和硫酸铵至终浓度为40％～60％，4度静置30min以上，离心弃上清；
2)将收集的沉淀用含盐150mM以上浓度的缓冲液，pH＝7.0～9.0复溶；复溶后按1:1000以上的比例用纯化水进行透析处理3～5天；
3)收集透析后的沉淀，用含盐150mM以上浓度的缓冲液，pH＝7.0～9.0复溶，复溶后用调pH＝3.0～5.0，按1ml：至少5μl的比例加入正辛酸，20℃～35℃条件下反应10min～2h后，离心弃沉淀；将收集的上清用调pH＝7.0～9.0补加饱和硫酸铵至终浓度为40％～60％，4度静置30min以上，离心弃上清；收集的沉淀用下一步精纯的缓冲液复溶，离心弃沉淀。
实施例2 IgM粗提
同实施例1，区别在于将步骤1)替换为：使用聚乙二醇沉淀处理：将无血清培养基培养的杂交瘤细胞分泌的抗体上清液离心澄清后，用等量PBS，pH＝7.0～8.0稀释，在搅拌下逐低加入PEG6000，使其终浓度为5％，静置30min，离心后弃上清。
实施例3 IgM精提
对实施例1所得粗提物进一步操作：
(1)疏水层析：
上清过GE公司疏水介质，本发明采用的疏水配基为苯基。
Buffer A：20mM PB+1000mM NaCl，pH＝8.0；
Buffer A平衡柱子后上样，从紫外吸光值开始上升时收集穿透样品。
(2)CHT柱
上述穿透样品过伯乐公司的CHT II介质纯化
Buffer A：15mM PB+1000mM NaCl，pH＝8.0；
Buffer B：300mM PB，pH＝8.0；
Buffer A平衡柱子后上样，0％～100％Buffer B线性梯度洗脱，收集洗脱样品。
(3)G柱纯化
洗脱样品过GE公司的Protein G柱纯化
Buffer A：30mM PB+1000mM NaCl，pH＝8.0；
Buffer A平衡柱子后上样后，从紫外吸光值开始上升时收集穿透样品。
实施例4
对实施例1所得粗提物进一步操作：
(1)疏水层析：
上清过GE公司疏水介质，本发明采用的疏水配基为苯基。
Buffer A：30mM PB+500mM NaCl，pH＝7.0；
Buffer A平衡柱子后上样，从紫外吸光值开始上升时收集穿透样品。
(2)CHT柱
上述穿透样品过伯乐公司的CHT II介质纯化
Buffer A：20mM PB+500mM NaCl，pH＝7.0；
Buffer B：500mM PB，pH＝7.0；
Buffer A平衡柱子后上样，0～100％Buffer B线性梯度洗脱，收集洗脱样品。
(3)G柱纯化
洗脱样品过GE公司的Protein G柱纯化；
Buffer A：50mM PB+500mM NaCl，pH＝7.0；
Buffer A平衡柱子后上样后，从紫外吸光值开始上升时收集穿透样品。
实施例5
对实施例2所得粗提物进一步操作：
(1)疏水层析：
上清过GE公司疏水介质，本发明采用的疏水配基为丁基。
Buffer A：40mM PBS+2000mM NaCl，pH＝9.0；
Buffer A平衡柱子后上样，从紫外吸光值开始上升时收集穿透样品。
(2)CHT柱
上述穿透样品过伯乐公司的CHT II介质纯化
Buffer A：5mM PBS+2000mM NaCl，pH＝9.0；
Buffer B：250mM PBS，pH＝9.0；
Buffer A平衡柱子后上样，0％～100％Buffer B线性梯度洗脱，收集洗脱样品。
(3)G柱纯化
洗脱样品过GE公司的Protein G柱纯化
Buffer A：20mM PBS+2000mM NaCl，pH＝9.0；
Buffer A平衡柱子后上样后，从紫外吸光值开始上升时收集穿透样品。
实验例1
本发明结果以实施例3为例，性能指标如下：
1、本发明中采用的纯化技术组合纯化后的IgM经HPLC检测，纯度达98.26％(图1)。
| 样品 | IgM峰％ | IgG峰％ | 低分子峰％ |
| IgM | 98.26％ | 0.49％ | 1.25％ |
2、本发明重复多个批次差异均不大，纯度一致性比较高。
3、SDS-PAGE纯度分析，胶浓度12％。
上样顺序：
泳道1：采用纯化水透析、CHT、离子交换柱组合纯化的样品；
泳道2：采用纯化水透析、CHT组合纯化的样品；
泳道3：采用纯化水透析、CHT、分子筛组合纯化的样品；
泳道4：本发明纯化样品；
泳道5：Maker蛋白。
结果如图2所示：本发明纯化样品基本无杂带。
实验例2
比较各种纯化组合下IgM产品性能效果及纯化效率。
硫酸铵沉淀、纯化水透析、辛酸硫酸铵沉淀、疏水层析、CHT、G柱组合纯化IgM，纯度能到达98％，产品稳定、批间易重现，整体工艺耗时7天，与IGg交叉反应小，介质可重复使用50-60次。
硫酸铵沉淀、纯化水透析、辛酸硫酸铵沉淀、疏水层析、CHT组合纯化IgM，纯度能到达90％，但与IGg交叉反应明显。
纯化水透析、CHT组合纯化IgM，纯度能到达70％，且冻存后有沉淀，批间难重现，整体工艺耗时8天，各项交叉严重，介质易发黄，可重复使用20-30次。
纯化水透析、CHT、离子交换柱组合纯化IgM，纯度能到达90％，批间难重现，整体工艺耗时9天，介质易发黄，可重复使用20-30次，回收效率低于本发明40％。
纯化水透析、CHT、分子筛组合纯化IgM，纯度能到达95％，整体工艺耗时11天，介质易发黄，可重复使用20-30次，回收效率低于本发明15％。
硫酸铵沉淀、纯化水透析、疏水层析、CHT、G柱组合纯化IgM，冻存后有沉淀，介质易发黄，可重复使用20-30次。
硫酸铵沉淀、辛酸硫酸铵沉淀、疏水层析、CHT、G柱组合纯化IgM，样品纯化较难，杂蛋白较多。
硫酸铵沉淀、纯化水透析、辛酸硫酸铵沉淀、疏水层析、G柱组合纯化IgM，纯度50％。
注：实验例1和2中用到的其他纯化手段：
(1)离子交换柱
将前一步获得的样品用凝胶过滤置换缓冲到30mM PB，pH＝8.0。
DEAE-纤维素柱层析：
BufferA：4mM PB，pH＝7.0～9.0；
BufferB:450mM PB，pH＝4.0～6.0；
Buffer A平衡介质后上样，0％～100％Buffer B洗杂线性梯度洗脱，收集洗脱样品，跑胶分析，合并较纯部分样品。
(2)分子筛
将前一步获得的样品过superdex G-200柱：
Buffer A：10mMPB+150mMNaCl，pH＝8.0；
Buffer A平衡介质后上样，上样后平衡柱子，收集紫外上升第一个峰，即为目的蛋白IgM。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种IgM纯化方法，其特征在于，包括：
a.提供包含IgM的样品；
b.经至少一次蛋白质沉淀处理和至少一次蛋白质浓缩处理得到蛋白沉淀物；
c.将所述蛋白沉淀物复溶，使用辛酸-硫酸铵法去除杂蛋白得到包含所述IgM的粗提物；
d.经疏水层析处理处理，收集穿透物；
e.经羟基磷酸石灰石层析，收集洗脱物；以及
f.经俘获IgG的亲和层析树脂纯化处理，收集穿透物。
2.根据权利要求1所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述疏水层析所采用层析基质中的活性基团为苯基和/或丁基；
可选的，所述疏水层析分离所用的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500mM～2000mM；
可选的，所述疏水层析分离所用的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度≥20mM，且缓冲液pH＝7.0～9.0。
3.根据权利要求1所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述羟基磷酸石灰石层析的平衡与上样缓冲液的pH＝7.0～9.0；
可选的，所述羟基磷酸石灰石层析的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度为5mM～20mM；进一步可选的，所述羟基磷酸石灰石层析的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500mM～2000mM。
4.根据权利要求1所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述俘获IgG的亲和层析树脂选自蛋白A树脂、蛋白G树脂、蛋白A/G混合树脂。
5.根据权利要求1所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述俘获IgG的亲和层析树脂选自蛋白G树脂；
蛋白G层析所用的平衡与上样缓冲液的pH＝7.0～9.0。
6.根据权利要求5所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述蛋白G层析所用的平衡与上样缓冲液中PB/PBS的浓度为20mM～50mM；可选的，所述蛋白G层析所用的平衡与上样缓冲液中NaCl的浓度为500mM～2000mM。
7.根据权利要求1～6任一项所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀处理包括盐析法和/或醇析法处理。
8.根据权利要求7所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀处理包括硫酸铵沉淀法和/或聚乙二醇沉淀法处理。
9.根据权利要求1～6任一项所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述蛋白质浓缩处理为透析法处理。
10.根据权利要求1～6任一项所述的IgM纯化方法，其特征在于，所述包含IgM的样品选自细胞培养物、腹水或血液提取物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910772305.7A CN112409477B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | IgM纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910772305.7A CN112409477B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | IgM纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112409477A true CN112409477A (zh) | 2021-02-26 |
| CN112409477B CN112409477B (zh) | 2022-11-08 |
Family
ID=74779676
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910772305.7A Active CN112409477B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | IgM纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112409477B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113042016A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-06-29 | 上海捷门生物技术有限公司 | 用于纯化抗血清的固相亲和吸附剂以及获得纯化的抗体的方法 |
| CN116217708A (zh) * | 2023-01-28 | 2023-06-06 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种纯化人血浆IgM的方法 |
| CN116425864A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-07-14 | 北京东方略生物医药科技股份有限公司 | 一种IgM抗体纯化方法 |
| CN116606370A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-18 | 南京松天盛科生物科技有限公司 | 一种天然IgM纯化的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0345543A2 (en) * | 1988-06-06 | 1989-12-13 | Miles Inc. | Therapeutic IgM concentrates |
| US5077391A (en) * | 1989-12-01 | 1991-12-31 | Raison Robert L | Purification of immunoglobulin M |
| JPH0459797A (ja) * | 1990-06-29 | 1992-02-26 | Tosoh Corp | 抗体の精製法 |
| US5112952A (en) * | 1990-09-28 | 1992-05-12 | Pierce Chemical Company | Composition and method for isolation and purification of Immunoglobulin M |
| US20070072307A1 (en) * | 2005-06-17 | 2007-03-29 | Ranganathan Godavarti | Methods of purifying Fc region containing proteins |
| US20090318674A1 (en) * | 2008-06-03 | 2009-12-24 | Gagnon Peter S | Process for purification of antibodies |
| US20170044210A1 (en) * | 2014-04-30 | 2017-02-16 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of proteins using caprylic acid |
-
2019
- 2019-08-21 CN CN201910772305.7A patent/CN112409477B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0345543A2 (en) * | 1988-06-06 | 1989-12-13 | Miles Inc. | Therapeutic IgM concentrates |
| US5077391A (en) * | 1989-12-01 | 1991-12-31 | Raison Robert L | Purification of immunoglobulin M |
| JPH0459797A (ja) * | 1990-06-29 | 1992-02-26 | Tosoh Corp | 抗体の精製法 |
| US5112952A (en) * | 1990-09-28 | 1992-05-12 | Pierce Chemical Company | Composition and method for isolation and purification of Immunoglobulin M |
| US20070072307A1 (en) * | 2005-06-17 | 2007-03-29 | Ranganathan Godavarti | Methods of purifying Fc region containing proteins |
| US20090318674A1 (en) * | 2008-06-03 | 2009-12-24 | Gagnon Peter S | Process for purification of antibodies |
| US20170044210A1 (en) * | 2014-04-30 | 2017-02-16 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of proteins using caprylic acid |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PETE GAGNON ET AL.: "Purification of IgM Monoclonal Antibodies", 《BIOPHARM INTERNATIONAL》 * |
| 刘振兴等: "黄鳍棘鲷血清IgM的纯化及兔抗血清的制备", 《中国水产科学》 * |
| 刘生杰等: "免疫球蛋白G(IgG)三种提取方法比较", 《中国农学通报》 * |
| 刘生杰等: "辛酸沉淀-凝胶过滤法提取猪血清IgM", 《阜阳师范学院学报(自然科学版)》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113042016A (zh) * | 2021-04-25 | 2021-06-29 | 上海捷门生物技术有限公司 | 用于纯化抗血清的固相亲和吸附剂以及获得纯化的抗体的方法 |
| CN116217708A (zh) * | 2023-01-28 | 2023-06-06 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种纯化人血浆IgM的方法 |
| CN116217708B (zh) * | 2023-01-28 | 2024-04-09 | 中国医学科学院输血研究所 | 一种纯化人血浆IgM的方法 |
| CN116425864A (zh) * | 2023-02-22 | 2023-07-14 | 北京东方略生物医药科技股份有限公司 | 一种IgM抗体纯化方法 |
| CN116606370A (zh) * | 2023-07-21 | 2023-08-18 | 南京松天盛科生物科技有限公司 | 一种天然IgM纯化的方法 |
| CN116606370B (zh) * | 2023-07-21 | 2023-09-19 | 南京松天盛科生物科技有限公司 | 一种天然IgM纯化的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112409477B (zh) | 2022-11-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112409477B (zh) | IgM纯化方法 | |
| RU2610667C2 (ru) | Способ очистки белков | |
| AU2011214361B2 (en) | Single unit antibody purification | |
| EP2768843B1 (en) | Solid phase for mixed-mode chromatographic purification of proteins | |
| EP3663401B1 (en) | Purification process for biological molecules such as plasmid dna using anionic exchange chromatography | |
| CN104487448B (zh) | 纯化抗体的方法 | |
| US20130289247A1 (en) | Single unit ion exchange chromatography antibody purification | |
| CN103497248B (zh) | 一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法 | |
| CN114181300A (zh) | 一种高纯度单克隆抗体的制备方法 | |
| CN107964044B (zh) | 从乳样中纯化抗cd20单克隆抗体的方法 | |
| US11884702B2 (en) | Systems and methods for process scale isolation of immunoglobulin G | |
| US20210095261A1 (en) | Protein purification method and kit | |
| WO2020183332A1 (en) | Purification of adalimumab using tandem chromatography | |
| JPH07155194A (ja) | タンパク質の精製法 | |
| US20140187749A1 (en) | Single unit chromatography antibody purification | |
| CN113166197A (zh) | 新纯化方法 | |
| CN111153993A (zh) | 抗TNF-α单克隆抗体的制备方法 | |
| TW201302777A (zh) | 單一單元層析法抗體純化技術 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |