CN114736294B - 一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法及其亲和层析填料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人免疫球蛋白纯化技术领域，具体涉及一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法及其亲和层析填料。破伤风免疫球蛋白的纯化方法包括使用层析柱对制品进行亲和层析处理；所述层析柱填装有层析填料，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。亲和层析填料的原料包括交联琼脂糖基介质和配体，配体包括破伤风类毒素成品、半成品以及原液。本技术方案可以解决现有技术缺少有效的富集血浆中的破伤风抗体的方法的技术问题。通过本工艺生产的破伤风人免疫球蛋白，蛋白浓度更低、纯度更高、血浆综合利用率得到提升、提高了破伤风人免疫球蛋白市场供给量。

Description

一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法及其亲和层析填料

技术领域

本发明涉及人免疫球蛋白纯化技术领域，具体涉及一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法及其亲和层析填料。

背景技术

破伤风是一种由厌氧菌破伤风梭状芽孢杆菌感染而引起的疾病，当皮肤、黏膜破溃时破伤风梭状杆菌可经过破溃处侵入人体内，并在伤口上繁殖，同时可能产生神经痉挛素和溶血毒素，如处置不当，极易造成患者死亡。目前预防此疾病的发生的方法为：首先，对暴露破伤风患者的伤口彻底清创，再根据伤情足量注射破伤风抗毒素或者破伤风人免疫球蛋白或者破伤风疫苗。由于破伤风抗毒素在临床使用中会导致过敏性休克和血清病这两类过敏反应及其他不良反应，破伤风抗毒素在临床使用中逐渐减少。而由于破伤风疫苗属于主动免疫，起效有一定的时间周期，故目前主要采用注射破伤风免疫球蛋白来进行被动免疫。

破伤风免疫球蛋白在国外20世纪60年代已开始使用，且少有过敏现象发生，近年来我国破伤风免疫球蛋白也已应用于临床，临床实验研究结果显示注射破伤风人免疫球蛋白组过敏反应率仅为0.2％，明显低于破伤风抗毒素组过敏反应率5％-30％，因此，破伤风免疫球蛋白在临床上使用也越来越受关注。

破伤风人免疫球蛋白是用于预防和治疗破伤风梭状杆菌感染的新型制剂。破伤风人免疫球蛋白是经过破伤风类毒素免疫机体后所产生破伤风抗体的健康人血浆，经过分离提纯及病毒灭活等工艺制备而成的被动免疫制剂。

根据《中国药典》规定，用于制作破伤风人免疫球蛋白的原料血浆其破伤风抗体效价应不低于10IU/ml，如果抗体效价低于10IU/ml，生产的制品效价达不到相应要求，需要过高的蛋白浓度才能达到效价要求，影响临床使用以及产生副作用。对于破伤风抗体效价低于10IU/ml的血浆不能用于生产破伤风人免疫球蛋白，只能用于普通静注人免疫球蛋白的生产，而这部分血浆数量巨大，如果能够将这部分血浆中的破伤风抗体富集，不仅会带来较大的经济价值，同时也能一定程度上补充破伤风人免疫球蛋白的市场缺口。

发明内容

本发明意在提供一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法，以解决现有技术缺少有效的富集血浆中的破伤风抗体的方法的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法，使用层析柱对制品溶液进行亲和层析处理；所述层析柱填装有层析填料，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。

本方案还提供了一种用于纯化破伤风免疫球蛋白的亲和层析填料，其原料包括交联琼脂糖基介质和配体，所述配体包括破伤风类毒素成品、半成品以及原液。

本方案的原理及优点是：

随着对蛋白质的认知不断深入对蛋白质纯化技术的不断革新，蛋白质的分离纯化是一项复杂的工作，分离纯化的方式多种多样，对于不同的目标产物分离纯化的方法不同，亲和色谱60年代发展起来的一种高效、快速蛋白分离的色谱方法，是利于蛋白质分子与某一分子专一可逆结合的生物特性，来选择分离目标蛋白质，亲和色谱具有容量大、分离效率高、且对目标产物的生物活性物质之间具有可逆又专一性的相互作用。亲和色谱主要包含基质、配基及亲和色谱的分离机理，随着研究的深入，基质及新配基的研究发现，亲和色谱的应用领域不断扩大。

本研究采用破伤风类毒素作为亲和填料配基与填料基质偶联制作亲和层析填料，使用该亲和层析填料特异性吸附蛋白溶液中的破伤风免疫球蛋白，并调整适宜的条件使破伤风人免疫球蛋白解吸附，再通过超滤浓缩、配制得到高效价的破伤风人免疫球蛋白制品，实现了破伤风抗体效价的富集。通过本工艺生产的破伤风人免疫球蛋白，蛋白浓度更低、纯度更高、血浆综合利用率达到提升、提高了破伤风人免疫球蛋白市场供给量。

综上所述，本技术方案的有益效果总结如下：工艺简单、方便，不影响现有生产工艺路线和产品生产；由于在生产中采用的是特异性吸附层析，故产品纯度也更高，临床副反应发生可能性更低；提高血浆的综合利用率，避免了浪费；在相同破伤风抗体效价下，蛋白浓度更低，更适合临床使用；可生产更高抗体效价单位产品，便于临床使用；减少了在低温乙醇法工艺中的损失，提高了破伤风抗体回收率。

进一步，将制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱，最后使用洗脱溶剂处理层析柱，收集流出液获得抗体富集溶液A。将制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液调节层析柱pH值和电导率，使得破伤风免疫球蛋白吸附于层析柱上，然后再使用洗脱液将含有大量破伤风免疫球蛋白的抗体富集溶液A洗脱并收集。

进一步，每毫升层析填料上样≤500IU破伤风抗体效价的制品溶液；制品溶液的上样流速为0.5cm/min-1.0cm/min；所述平衡液的成分包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，pH为6.80-7.20，平衡液的用量为3-5倍柱床体积，平衡液流速为0.5cm/min-1.0cm/min。采用上述的参数条件，层析柱的pH值和电导率维持在理想水平，非破伤风免疫球蛋白的蛋白成分得到分离，破伤风免疫球蛋白吸附于层析柱上。

进一步，洗脱溶剂的成分包括醋酸，pH值为2.0-3.0，洗脱溶剂流速为0.5cm/min-1.5cm/min，洗脱溶剂的用量为2-3倍柱床体积。上述pH值以及组成的洗脱溶剂，可以有效将层析柱上吸附的免疫球蛋白洗脱。

进一步，将制品溶液上样于层析柱中之前，对所述层析柱进行前处理；所述前处理为：分别使用3-5倍柱床体积水和平衡液清洗所述层析柱，直至流出液的pH为6.80-7.20；水和平衡液的流速均为0.5cm/min-1.5cm/min。上述处理手段将层析柱的pH值和电导率维持在理想水平。

进一步，所述制品溶液的原料包括低温乙醇法生产工艺中获得的组分I、组分II、组分III、二次沉淀等沉淀溶解液过滤后物料以及一次上清等超滤去除乙醇；还包括原料血浆和去除冷胶血浆；还包括人免疫球蛋白产品。本工艺适用于多种含有破伤风免疫球蛋白的血液制品，可以有效地将破伤风免疫球蛋白分离并富集。

进一步，所述抗体富集溶液A经过富集和透析之后，获得抗体富集溶液C；将抗体富集溶液C配制为破伤风抗体效价为100IU/ml的破伤风人免疫球蛋白成品，破伤风人免疫球蛋白成品中含有20-40g/L的葡萄糖以及10-30g/L的甘氨酸，破伤风人免疫球蛋白成品的pH为6.40-7.40。

进一步，一种用于纯化破伤风免疫球蛋白的亲和层析填料，其由如下方法制作：

S1配体准备：将配体浓缩，然后用偶联缓冲液稀释，获得配体溶液；

S2介质准备：使用盐酸溶液清洗交联琼脂糖基介质，获得活化介质；

S3配体偶联：活化介质与配体溶液混合，经反应获得偶联后的微球；

S4清洗和钝化：使用去离子水或中性缓冲液洗涤偶联后的微球；然后使用缓冲液A和缓冲液B交替清洗偶联后的微球；最后使用缓冲液C平衡偶联后的微球的pH值，获得所述层析填料。

采用上述技术手段可以制备获得效果理想的层析填料，通过将配体(破伤风类毒素)偶联到交联琼脂糖基介质上的方式，使得层析填料具有可逆吸附破伤风免疫球蛋白的能力

进一步，在S1中，将配体浓缩至破伤风类毒素效价达到5000IU/ml以上；偶联缓冲液的成分包括碳酸氢钠和氯化钠，pH值为7.50-8.50；配体溶液的破伤风类毒素效价为1000-2000IU/ml；

在S2中，在0-2℃的条件下使用1mmol/L的盐酸溶液清洗交联琼脂糖基介质3-5次，获得活化介质；

在S3中，活化介质与配体溶液按照体积比1:1-1:100混合；在15-25℃以及pH 7.5-9.5的条件下反应2-4h，获得偶联后的微球；

在S4中，缓冲液A的成分包括乙醇胺和氯化钠，pH值为8.0-8.5；缓冲液B的成分包括醋酸钠和氯化钠，pH值为3.5-4.5；缓冲液C的成分包括醋酸钠和氯化钠，pH值为6.5-7.5。

采用上述技术参数可以实现破伤风类毒素在交联琼脂糖基介质上的高效偶联。其中，说明配体偶联的温度对于活化介质与配体之间的结合效果有非常关键的影响。层析填料的制备过程较为复杂，步骤繁多，如何找到影响层析填料效果的关键技术点，是发明人一直尝试解决的问题。通过大量实验研究发现，配体偶联的温度需要控制在15-25℃的范围内，获得的层析填料才能高效地捕获破伤风免疫球蛋白，以及通过控制洗脱条件实现对破伤风免疫球蛋白的高效富集(即与层析填料解离)。

附图说明

图1为实验例2的流穿液和洗脱液的典型HPLC图像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：层析填料的制备

(1)配体准备：配体的原料包括破伤风类毒素成品、半成品以及原液，均可通过商业途径获得。其中，破伤风类毒素是破伤风疫苗的主要功效成分。使用终端为0.2μm滤芯过滤、浓缩上述原料，使破伤风类毒素效价达到5000IU/ml以上。用偶联缓冲液(0.2mol/L碳酸氢钠+0.5mol/L氯化钠，pH7.50-8.50)稀释效价至1000-2000IU/ml，即得配体溶液。

(2)介质准备：将交联琼脂糖基介质用0-2℃1mmol/L盐酸溶液清洗3-5次，获得活化介质。

(3)配体偶联：清洗后的活化介质与配体溶液按照1:1-1:100混合(即1ml活化的介质与1ml-100ml配体溶液混合)，在15-25℃、缓慢搅拌条件下调整pH值7.5-9.5，反应2-4h，获得偶联后体系。

(4)清洗和钝化：反应结束后用偶联后体系体积的10倍左右的去离子水或中性缓冲液(PB中性缓冲液)洗去配体溶液，再用10倍体积的缓冲液A(0.5mol/L乙醇胺+0.5mol/L氯化钠、pH8.0-8.5)、缓冲液B(0.1mol/L醋酸钠+0.5mol/L氯化钠、pH3.5-4.5)交替清洗三次偶联后微球，每次清洗时间间隔10-15min。最后用10倍缓冲液C(0.1M醋酸钠+0.15M氯化钠、pH6.5-7.5)平衡pH，获得本方案的微球状的层析填料。

实施例2：破伤风免疫球蛋白的纯化

(1)层析填料(层次介质)装柱：将平衡好的微球装载至层析柱中。

(2)制品准备：准备含有破伤风抗体的免疫球蛋白溶液，包括原料血浆、去除冷胶血浆、组分II+III、组分II、二次沉淀等沉淀溶解液过滤后、组分I、组分III、一次上清等超滤去除乙醇后，即在血浆生产工艺中的各个步骤获得的组分都能作为原料。如果是沉淀状态需要溶解过滤，如果溶液中含有乙醇的需要超滤去除。含有破伤风抗体的免疫球蛋白溶液还包括生产的特异性人免疫球蛋白、静注人免疫球蛋白原液、相关免疫球蛋白的半成品或者成品。调整含有破伤风抗体效价的免疫球蛋白溶液pH6.50-7.50、电导率不高于15ms/cm、蛋白浓度不高于50g/L，并测量含有破伤风抗体的免疫球蛋白溶液中破伤风抗体的效价，最好维持在大于10IU/ml的水平，通过该步骤获得层析前的制品溶液。

(3)层析柱前处理：分别用柱床体积3-5倍的注射用水、平衡液(0.01±0.005mol/L磷酸氢二钠+0.01±0.005mol/L磷酸二氢钠，pH6.80-7.20)平衡层析柱出液pH6.80-7.20，处理流速0.5cm/min-1.5cm/min、压力＜1.0bar。

(4)制品层析：根据层析前的制品溶液中破伤风抗体效价，按照≤500IU/ml上样层析，即每毫升填料上样含有≤500IU单位的层析前的制品溶液，上样流速0.5cm/min-1.0cm/min、压力＜1.0bar，收集流穿液。上样结束后用3-5倍柱床体积平衡液(0.01±0.005mol/L磷酸氢二钠+0.01±0.005mol/L磷酸二氢钠，pH6.80-7.20)平衡层析柱，平衡液合并至流穿液中收集用于制作免疫球蛋白产品，即流穿液和平衡液按照现有技术的低温乙醇法继续进行分离纯化白蛋白以及球蛋白。

(5)洗脱：用2-3倍柱床体积的洗脱溶剂(1.0mol/L醋酸、pH2.0-3.0)洗脱层析柱，流速0.5cm/min-1.5cm/min、压力＜1.0bar，收集获得洗脱液(抗体富集溶液A)。流穿液和洗脱液的典型HPLC图像参见图1。

(6)超滤：用孔径30-50KD的膜包浓缩抗体富集溶液A蛋白浓度至40-60g/L，获得抗体富集溶液B。再使用0.7-0.9％氯化钠溶液超滤透析抗体富集溶液B，0.7-0.9％氯化钠溶液的体积为抗体富集溶液B的体积的5-8倍，通过该步骤获得抗体富集溶液C。

(7)配制：根据抗体富集溶液C中破伤风抗体效价总量，按照最终成品中破伤风抗体效价为100IU/ml计算配制体积，按照配制体积添加终浓度为20-40g/L的葡萄糖、终浓度为10-30g/L的甘氨酸，并调整pH6.40-7.40，即为破伤风人免疫球蛋白成品。

实施例3-实施例5基本同实施例1制备获得层析填料，不同点在于部分工艺参数的选取，具体参见表1。实施例4的原液和实施例5的半成品均为疫苗生产过程中的中间产品，原液是指疫苗经过纯化、超滤、浓缩后的产品，半成品是指原液添加各类辅料后的产品。原液和半成品和吸附破伤风疫苗成品一样，均含有大量的破伤风类毒素。

表1：实施例3-5的参数选择

实施例6-实施例9基本同实施例2，选用了实施例3制备的层析填料来进行破伤风免疫球蛋白的纯化，具体的工艺参数以及原料的选取参见表2。其中，原料血浆是血液离心去除细胞后的上清，含有蛋白质、无机盐和水等，不含血细胞。实施例6-实施例9均对原料血浆进行破伤风免疫球蛋白的富集，原料血浆即《中国药典》中所指的人血浆：血液制品生产用人血浆系以单采血浆术采集的供生产血浆蛋白制品用的健康人血浆。并对纯化效果进行评估，评价指标为破伤风抗体效价收率以及蛋白收率。对“(2)制品准备”中层析前的制品溶液、“(4)制品层析”中的流穿液和“(5)洗脱”中的使用2-3倍柱床体积的洗脱溶剂对层析柱进行洗脱获得的洗脱液(抗体富集溶液A)，进行破伤风抗体效价和蛋白质含量进行测量。破伤风抗体效价收率以及蛋白收率的计算方法为：对于洗脱液：破伤风抗体效价收率(％)＝(洗脱液体积×洗脱液中抗体效价/层析前体积×层析前抗体效价)×100％，蛋白收率＝洗脱液中蛋白含量/层析前制品溶液中蛋白含量×100％；对于流穿液：破伤风抗体效价收率(％)＝(流穿液体积×流穿液中抗体效价/层析前体积×层析前抗体效价)×100％，蛋白收率＝流穿液中蛋白含量/层析前制品溶液中蛋白含量×100％。

表2：实施例6-9的参数选择(破伤风抗体效价收率和蛋白收率均为3次重复实验的平均值)

在实施例6中，虽然在层析过程中大部分破伤风抗体被流穿，但洗脱液中仍然回收率37％的破伤风抗体效价，且蛋白含量只有2％，故以原料血浆进行层析的工艺能达到提取破伤风抗体的目的。在实施例7中，虽然在层析过程中仍有部分破伤风抗体被流穿，但洗脱液中破伤风抗体效价回收率仍然达到了45％，且蛋白含量只有3％。相较于采用高效价的破免原料血浆，破伤风抗体效价回收更高。说明血浆中效价过高可能影响层析效果，可能是血浆过于富集造成在层析时不能完全接触，故低效价的原料血浆通过层析能富集破伤风抗体效价。

实施例10-13基本同实施例6，不同点在于“(2)制品准备”中的原料来源。具体情况如下：

实施例10：取低温乙醇法生产工艺中组分II沉淀，使用沉淀重量6倍注射用水溶解，溶解后使用深层滤堆和终端为0.2μm串联过滤制品，然后按照实施例6的pH、电导率和蛋白浓度要求配制层析前的制品溶液，接下来按照实施例6的方法进行层析、超滤和配制，获得破伤风人免疫球蛋白成品。

组分II的具体获取过程如下：

原料血浆出库后，使用75vol.％乙醇溶液对血浆袋表面消毒，然后将血浆袋破袋，控制温度在0℃融化，融化后将血浆合并，使用离心机离心血浆(离心力为10000RCF)，收集上清液A。调整上清液A的温度为-1.0℃、蛋白浓度为65g/L、pH为6.80、电导率为12mS/cm、乙醇(纯乙醇)体积百分浓度为10vol.％(终浓度)，反应2h，压滤收集上清液B。调整上清液B的温度为-6.0℃、蛋白浓度为30g/L、pH为5.70、电导率为6.0mS/cm、乙醇体积百分浓度为18vol.％，反应2h，压滤收集沉淀，即为组分II+III沉淀。组分II+III沉淀中加入注射水溶解3h，注射水的质量为沉淀质量的8倍。控温0℃，加入磷酸缓冲液调整pH为4.6，反应2h；再加入磷酸缓冲液调整pH为5.0，反应2h；调整乙醇浓度为15vol.％，反应3h，压滤收集上清液C。调整上清液C温度为-1.0℃，pH为7.4，加入氯化钠，并使其终浓度为5g/L，加入乙醇，使其终浓度为26vol.％，反应3h，压滤收集沉淀，即为组分II沉淀。

实施例11：取低温乙醇法生产工艺中组分III上清，使用深层滤堆和终端为0.2μm串联过滤制品，过滤后制品使用50KD膜包透析10倍注射用水降低电导率和去除乙醇。然后按照实施例6的pH、电导率和蛋白浓度要求配制层析前的制品溶液，接下来按照实施例6的方法进行层析、超滤和配制，获得破伤风人免疫球蛋白成品。

组分III上清的具体获取过程如下：

1、原料血浆处理：原料血浆出库后，使用70vol.％乙醇溶液对血浆袋表面消毒，然后将血浆袋破袋，控制温度在4℃融化，融化后将血浆合并，使用离心机离心血浆(离心力为10000RCF)，收集上清液A。其中，原料血浆是血液离心去除细胞后的上清，含有蛋白质、无机盐和水等，不含血细胞。更具体地，原料血浆即《中国药典》中所指的人血浆：血液制品生产用人血浆系以单采血浆术采集的供生产血浆蛋白制品用的健康人血浆。

2、组分I沉淀分离：调整上清液A的温度为-1.0℃、蛋白浓度为65g/L、pH为7.30、电导率为14mS/cm、乙醇(纯乙醇)体积百分浓度为10vol.％(终浓度)，反应3h，压滤收集上清液B。

3、组分II+III沉淀分离：调整上清液B的温度为-4.0℃、蛋白浓度为45g/L、pH为6.30、电导率为8.0mS/cm、乙醇体积百分浓度为22vol.％，反应2h，压滤收集沉淀，即为组分II+III沉淀。

4、组分III分离：组分II+III沉淀中加入注射水溶解4h，注射水的质量为沉淀质量的10倍。控温5℃，加入磷酸缓冲液调整pH为5.0，反应2h；再加入磷酸缓冲液调整pH为5.4，反应2h；调整乙醇浓度为15vol.％，反应3h，压滤收集上清液，即为组分III。

实施例12：取低温乙醇法生产的破伤风人免疫球蛋白原液，使用深层滤堆和终端为0.2μm串联过滤制品。然后按照实施例6的pH、电导率和蛋白浓度要求配制层析前的制品溶液，接下来按照实施例6的方法进行层析、超滤和配制，获得破伤风人免疫球蛋白成品。

破伤风人免疫球蛋白原液是指通过改进的cohn低温乙醇法制作的组分II沉淀，再经过精制纯化、病毒去除、超滤透析的高纯度球蛋白中间产品，即为原液。

实施例13：取低温乙醇法生产的破伤风人免疫球蛋白半成品(实施例12的原液加入多种辅料获得)，使用终端为0.2μm过滤制品，然后按照实施例6的pH、电导率和蛋白浓度要求配制层析前制品溶液，接下来按照实施例6的方法进行层析、超滤和配制，获得破伤风人免疫球蛋白成品。

除了实施例10-13中记载的血液制品，本方案的纯化方法以及亲和层析填料还可以用于其他类型的血液制品，例如去除冷胶血浆、组分II+III、二次沉淀等沉淀溶解液过滤后、组分I沉淀上清，以及一次上清等超滤去除乙醇后的中间产品和二次沉淀等沉淀溶解液过滤后的中间产品等。

其中，去除冷胶血浆的制备方法为：将新鲜冰冻血浆融化，在3℃下连续离心，去除冷胶，上清即为去冷胶血浆。组分II+III的制备参见实施例10。组分I沉淀上清的制备方法为：原料血浆出库后，使用70％～75％乙醇溶液对血浆袋表面消毒，然后将血浆袋破袋，控制温度在0℃融化，融化后将血浆合并，使用离心机离心血浆(离心力为10000RCF)，收集上清液A。调整上清液A的温度为-3.0℃、蛋白浓度为40g/L、pH为6.80、电导率为12mS/cm、乙醇(纯乙醇)体积百分浓度为vol.％(终浓度)，反应3h，压滤收集上清液。

实施例10-13的实验结果参见表3。

表3：实施例10-13的实验结果(破伤风抗体效价收率和蛋白收率均为3次重复实验的平均值)

由上表可知，层析能够回收组分沉淀及中间产品的破伤风抗体效价，且第三个实验(实施例12)收率最高。由于第三个实验采用的是原液，在低温乙醇法生产破伤风人免疫球蛋白工艺中，原液中的破伤风人免疫球蛋白纯度已到达最大，且中间不含有任何辅料。

对比例1

本对比例基本同实施例7，不同点在于部分参数的选用(主要是洗脱条件)，详见表4。

表4：pH值对于亲和层析的效果的影响(破伤风抗体效价收率和蛋白收率均为3次重复实验的平均值，*表示通过t检验，与实施例7存在显著差异，p＜0.05)

由表4可知，洗脱溶剂pH值过低导致破伤风抗体失活，pH过高导致破伤风抗体效价收率非常低。

对比例2：

本对比例基本同实施例7，不同点在于平衡液的选择，具体详见表5。

表5：平衡液的选择对于亲和层析的效果的影响(破伤风抗体效价收率和蛋白收率均为3次重复实验的平均值，*表示通过t检验，与实施例7存在显著差异，p＜0.05)

平衡液主要用于调节层析柱的pH和电导率环境，发明人尝试了多种缓冲液来进行层析柱的调节，发现使用“0.01±0.005mol/L磷酸氢二钠+0.01±0.005mol/L磷酸二氢钠”的缓冲液的效果最佳。而是用另外两种缓冲液会导致破伤风免疫球蛋白与填料之间的结合效果变差，降低最终收率。由实验数据可知，2和3中，洗脱液中的破伤风抗体效价收率较低，破伤风抗体的富集效果变差，部分破伤风抗体还存在于流穿液中。

对比例3：

本对比例基本同实施例7，不同点在于洗脱液(洗脱溶剂)的选择，具体详见表6。

表6：洗脱液的选择对于亲和层析的效果的影响(破伤风抗体效价收率和蛋白收率均为3次重复实验的平均值，*表示通过t检验，与实施例7存在显著差异，p＜0.05)

上述实验数据说明洗脱液类型的选取对洗脱效果影响比较大，使用氯化钠时，破伤风免疫球蛋白难以从柱填料上洗脱，所以破伤风抗体效价收率只有20％。

对比例4：

本对比例基本同实施例7，不同点在于配体偶联的温度的选择，具体详见表7。

表7：配体偶联的温度的选择对于亲和层析的效果的影响(破伤风抗体效价收率和蛋白收率均为3次重复实验的平均值，*表示通过t检验，与实施例7存在显著差异，p＜0.05)

上述实验数据说明配体偶联的温度对于活化介质与配体之间的结合效果有非常关键的影响。层析填料的制备过程较为复杂，步骤繁多，如何找到影响层析填料效果的关键技术点，是发明人一直尝试解决的问题。通过大量实验研究发现，配体偶联的温度需要控制在15-25℃的范围内，获得的层析填料才能高效地捕获破伤风免疫球蛋白，以及通过控制洗脱条件实现对破伤风免疫球蛋白的高效富集(即与层析填料解离)。表7中列举了10℃和30℃的例子，配体偶联的温度稍低或者稍高于本方案限定的范围，而在最终的洗脱液中，破伤风抗体效价收率仅在29％和36％的水平。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (3)

1.一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法，其特征在于：将制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱，最后使用洗脱溶剂处理层析柱，收集流出液获得洗脱液；

每毫升层析填料上样≤500IU破伤风抗体效价的制品溶液；制品溶液的上样流速为0.5cm/min-1.0cm/min；所述平衡液的成分包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，pH为6.80-7.20，平衡液的用量为3-5倍柱床体积，平衡液流速为0.5cm/min-1.0cm/min；

洗脱溶剂的成分包括醋酸，pH值为2.0-3.0，洗脱溶剂流速为0.5cm/min-1.5cm/min，洗脱溶剂的用量为2-3倍柱床体积；

所述制品溶液中破伤风抗体的效价＜10IU/ml；

所述层析柱填装有层析填料，所述层析填料由如下方法制备：

S1配体准备：将配体浓缩，然后用偶联缓冲液稀释，获得配体溶液；将配体浓缩至破伤风类毒素效价达到5000IU/ml以上；偶联缓冲液的成分包括碳酸氢钠和氯化钠，pH值为7.50-8.50；配体溶液的破伤风类毒素效价为1000-2000IU/ml；

S2介质准备：在0-2℃的条件下使用1mmol/L的盐酸溶液清洗交联琼脂糖基介质3-5次，获得活化介质；

S3配体偶联：活化介质与配体溶液按照体积比1:1-1:100混合；在15-25℃以及pH 7.5-9.5的条件下反应2-4h，获得偶联后的微球；

S4清洗和钝化：使用去离子水或中性缓冲液洗涤偶联后的微球；然后使用缓冲液A和缓冲液B交替清洗偶联后的微球；最后使用缓冲液C平衡偶联后的微球的pH值，获得所述层析填料；缓冲液A的成分包括乙醇胺和氯化钠，pH值为8.0-8.5；缓冲液B的成分包括醋酸钠和氯化钠，pH值为3.5-4.5；缓冲液C的成分包括醋酸钠和氯化钠，pH值为6.5-7.5。

2.根据权利要求1所述的一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法，其特征在于：将制品溶液上样于层析柱中之前，对所述层析柱进行前处理；所述前处理为：分别使用3-5倍柱床体积水和平衡液清洗所述层析柱，直至流出液的pH为6.80-7.20；水和平衡液的流速均为0.5cm/min-1.5cm/min。

3.根据权利要求2所述的一种破伤风免疫球蛋白的纯化方法，其特征在于：所述洗脱液经过富集和透析，然后配制为破伤风抗体效价为100IU/ml的破伤风人免疫球蛋白成品，破伤风人免疫球蛋白成品中含有20-40g/L的葡萄糖以及10-30g/L的甘氨酸，破伤风人免疫球蛋白成品的pH为6.40-7.40。