CN114456271A - 一种Rho(D)人免球蛋白的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于血液制品领域，具体涉及一种Rho(D)人免疫球蛋白生产工艺。本发明通过采用低温乙醇蛋白分离法和柱层析法，分离纯化蛋白，并采用S/D灭活病毒和纳米膜过滤除病毒两种灭活/去除工艺，同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒，降低了经血液制品传播疾病的风险，且利用本发明所得Rho(D)人免疫球蛋白制品的纯度高达99.7％，收率最高达3320瓶/吨血浆，其收率较传统低温乙醇分离法可提高8％‑12％。
Description
技术领域
本发明属于血液制品领域，具体涉及一种Rho(D)人免疫球蛋白生产工艺。
背景技术
新生儿溶血病见于胎儿和新生儿期，是因血型不合引起的，主要临床表现为黄疸、水肿、 贫血和肝脾肿大，发症包括充血性心力衰竭、胆红素脑病以及神经功能障碍等，严重者将引 起造成胎儿/新生儿的死亡。在我国，随着二胎政策的放开，母婴Rh血型不合引起的新生儿 溶血病越来越受到人们的关注，而治疗和预防该类疾病的Rho(D)人免疫球蛋白在国内尚未上 市，也不允许进口，因此市面上存在“一剂难求”的现象。
Rho(D)人免疫球蛋白是一种含有抗-D抗体的免疫球蛋白制剂，主要用于预防和治疗因 Rh血型不合引起的新生儿溶血病，在妊娠28周及产后72小时内各注射一剂Rho(D)人免疫 球蛋白，RhD致敏率将降低至0.001％。Rho(D)人免疫球蛋白上市将填补国内空白。
首先，对于血液制品来说病毒灭活是保证制品安全的关键步骤，单一的病毒灭活存在不 能达到同时灭活脂包性和非脂包性病毒的目的，因此血液制品一般需进行两步以上的病毒灭 活工艺，以提高制品病毒灭活/去除的效果，降低经血液制品传播疾病的风险。其次，提高纯 度和产率也是血液制品分离制备的关键，目前，有大量的血液制品分离制备的工艺研究，包 括低温乙醇分离法、层析法、两步病毒去除/灭活的运用，但是产品的纯度、产率和质量得不 到保证。因此，建立一种既能高效灭活病毒，又能提高Rho(D)人免疫球蛋白收率和纯度的生 产工艺较为重要。
本发明通过采用低温乙醇蛋白分离法和柱层析法，分离纯化蛋白，并采用S/D灭活病毒 和纳米膜过滤除病毒两种灭活/去除工艺，同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒，降低了经血液制 品传播疾病的风险，且利用本发明所得产品收率较传统低温乙醇分离法可提高8％-12％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种Rho(D)人免球蛋白生产工艺，所述生产工艺包括以下步骤：
(1)制备组分I：用0.9％氯化钠溶液稀释血浆至蛋白含量为45～55g/L，调血浆pH为 7.1～7.3，0℃以下加入-15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为8％v/v，控制终温度-3.0℃～-2.0℃ 搅拌反应，离心得组分I上清液；
(2)制备组分II+III(组分I+II+III)：调步骤(1)所得组分I上清液pH为6.80～7.00， 加入-15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为21％v/v，控制终温度-6.0℃～-4.0℃搅拌得反应液， 将反应液分离获得组分II+III沉淀；
(3)制备组分I+III(组分III)：用氯化钠溶液溶解步骤(2)所述的组分I+II+IIII沉 淀，调溶液pH为5.00～5.20，0℃以下，加入-15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为16％v/v， 控制终温度-6.0℃～-4.0℃搅拌反应，将反应液分离获得组分I+III滤液；
(4)S/D灭活：调节步骤(3)所得组分I+III滤液pH为5.25～5.35，4～8℃下加入1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和0.3％的磷酸三丁酯(TNBP)，搅拌后静置，获得S/D灭活液；
(5)第一次超滤：步骤(4)所述S/D灭活液pH为3.8～4.0，用0.45μm滤芯过滤后使用30kDa超滤膜包进行浓缩至蛋白含量为30～50g/L时，用2～8℃透析水连续等体积透析脱醇至 蛋白含量＞6％，得超滤液；
(6)层析：调步骤(5)所述透析液电导为1.8～2.2ms/cm，pH为6.50～6.70，蛋白液浓 度≥35g/L，上离子交换层析柱，收集层析液；
(7)第二次超滤：调节步骤(6)所述流出液pH为3.8～4.2，用2～8℃透析水连续等体 积透析至蛋白含量≥55g/L，得超滤液；
(8)灭活病毒：低pH孵放灭活病毒，得灭活液；
(9)纳米膜过滤除病毒：用过滤孔径20nm的纳米膜进行除病毒过滤；
(10)第三次超滤：将步骤(8)得到的灭活液，用0.85％氯化钠溶液进行透析至并将蛋 白含量浓缩至抗-D抗体效价＞1000IU/mL进行透析至，得蛋白原液；
(11)成品：加入麦芽糖和甘氨酸，配置半成品，调pH值为6.4～7.4，0.45μm滤芯除菌 灌装制得成品。
优选地，步骤(2)中所述反应液分离前，需在反应液中加入硅藻土，所述加入硅藻土的 量为15g/kg。
优选地，步骤(3)中所述氯化钠溶液的浓度为0.01mol/L。
优选地，步骤(3)中所述分离为压滤分离，所述压滤压力为0.05～0.25MPa，所述出液 温度为-5.5℃～-3.5℃。
优选地，步骤(6)中所述浓缩液上离子交换层析柱前，需先平衡层析柱，所述平衡过程 为：先用醋酸盐缓冲液处理层析柱，再用磷酸盐平衡缓冲液平衡层析柱。
优选地，所述离子层析柱为DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱，所述上样速度 ≤3L/min。
优选地，步骤(8)中所述低pH孵放灭活步骤为：调pH为3.9～4.3，在23～25℃条件下， 孵放至少21天。
优选地，步骤(10)中所述除病毒过滤过程中的前端过滤压力≤0.3MPa。
优选地，步骤(11)所述半成品中抗-D抗体效价为1000IU/ml，蛋白含量为140g/L，麦 芽糖含量为30g/L，甘氨酸含量为25g/L，pH值为6.4～7.4。
本发明的有益效果是：
①本发明采用低温乙醇分离法和层析法分离纯化蛋白，运用不同浓度乙醇进行多次沉淀， 提高目的蛋白获得量，结合DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析去除杂蛋白，所得产品 收率较传统低温乙醇分离法可提高8％-12％，所得制剂纯度高达99.7％，收率高达3320瓶/ 吨血浆(Rho(D)人免疫球蛋白的规格为：1500IU(1.5ml/瓶))。
②采用S/D灭活病毒、巴氏灭活病毒、纳米膜除病毒灭活工艺，确保了病毒灭活/去除的 有效性。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体 实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
实施例1Rho(D)人免球蛋白生产工艺1
(1)组分I制作
将100人份以上抗-D抗体滴度大于512的原料血浆合并至反应罐中融浆，用0.9％氯化钠 溶液稀释混合血浆至蛋白含量为50g/L，用pH4.0的醋酸盐缓冲液将稀释后血浆pH值调至 7.20，降温至0℃以下开始加入-20℃的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到8％v/v，制品最终温 度控制在-2.5℃，搅拌反应，将反应液离心得组分I上清液；
(2)组分I+II+III制作与分离
用pH4.0的醋酸盐缓冲液调步骤(1)中所得组分I上清液的pH值至6.90，加入-20℃的 95％乙醇，使最终乙醇浓度达到21％v/v，-5.0℃继续搅拌2h，静置2h以上，每1kg反应液加 入硅藻土15g后，搅拌30min，压滤分离出组分I+II+III沉淀和滤过液。
(3)组分I+III制作与分离
取组分I+II+III沉淀，用12倍体积，0℃的0.01mol/L氯化钠溶液溶解，开启搅拌至40rpm。 完全溶解后加入pH4.0醋酸盐缓冲液，调整pH值为5.10±0.10，降温至0℃以下，加入-15℃ 以下的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到16％v/v，乙醇加入速度70kg/h。控制最终反应液温度 为-5.0℃。乙醇添加完成后，继续搅拌2h，静置6h，50rpm搅拌15min后进行压滤分离，压 滤压力控制在0.25MPa，出液温度控制在-4.5℃，得组分I+III滤液。
(4)S/D灭活
调节上述步骤所得组分I+III滤液pH值至5.30，温度控制至4℃，加入聚乙二醇辛基苯 基醚(Triton X-100)至终浓度为1％，加入磷酸三丁酯(TNBP)至浓度为0.3％，搅拌6h， 静置1h，得S/D灭活液。
(5)第一次超滤
将步骤(4)中得到的S/D灭活液缓慢加入0.5mol/L的盐酸液，调节pH至3.9，然后经0.45μm滤芯过滤后使用30kDa超滤膜包进行浓缩和透析，当蛋白含量浓缩至30-50g/L时，用5倍浓缩液体积的5℃透析水(注射用水)连续等体积透析脱醇，然后浓缩蛋白含量为60g/L， 收集浓缩液于超滤罐中。用适量透析水(注射用水)冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中。
(6)层析
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化：将步骤(5)中超滤收集的浓缩液 先用1mol/L磷酸盐缓冲液调整电导至2.0ms/cm，再用0.5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.60， 蛋白液浓度≥35g/L，待层析上柱提纯；上样前层析系统先用pH4.0醋酸盐缓冲液处理层析柱 (直径800mm，柱高180mm)；再用磷酸盐平衡缓冲液(浓度0.02mol/L，pH值6.60)平衡 层析柱；层析柱平衡完成后进行制品层析上样，上样速度控制在3L/min以内，当层析系统 UV检测器显示峰值刚出现时开始收集流出液，上样完成后用磷酸盐平衡缓冲液顶洗层析柱， 待UV检测器显示值下降至最高峰的约1/6时，停止收集流穿液；用pH4.0醋酸盐缓冲液冲 洗层析柱。
(7)第二次超滤
加入0.5mol/L盐酸溶液(0.5mol/L盐酸溶液添加速度为12kg/h)，调节步骤(6)所得流 出液调整pH至3.8，用6倍浓缩液体积的5℃透析水进行连续等体积透析，透析完成进行终 浓缩，将蛋白液蛋白含量浓缩至55g/L。
(8)灭活病毒
低pH孵放灭活病毒：在pH值3.9条件下，维持制品温度23℃，孵放25天，得灭活液。
(9)纳米膜除病毒过滤
灭活液先用0.2μm滤芯进行预过滤，再用过滤孔径为20nm的纳米膜进行除病毒过滤， 除病毒过滤过程中前端过滤压力为0.2MPa，得除病毒过滤液。
(10)第三次超滤
将步骤(9)得到的除病毒过滤液，用5倍体积的0.85％氯化钠溶液进行透析，并将蛋白 含量浓缩至抗-D抗体效价≥1100IU/ml，得到蛋白原液。
(11)半成品配制
根据原液检定结果按照以下要求进行半成品配制：
抗-D抗体效价：1005IU/ml；蛋白含量：130g/L；麦芽糖含量：30g/L；甘氨酸含量：25g/L； pH值：6.4。
(12)除菌灌装
半成品经0.45μm滤芯除菌灌装制得成品。
实施例2Rho(D)人免球蛋白生产工艺2
(1)组分I制作
将100人份以上抗-D抗体滴度大于512的原料血浆合并至反应罐中融浆，用0.9％氯化钠 溶液稀释混合血浆至蛋白含量为50g/L，用pH4.0的醋酸盐缓冲液将稀释后血浆pH值调至 7.20，降温至0℃以下开始加入-15℃的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到8％v/v，制品最终温 度控制在-2.0℃，搅拌反应，将反应液离心得组分I上清液；
(2)组分I+II+III制作与分离
用pH4.0的醋酸盐缓冲液调步骤(1)中所得组分I上清液的pH值至6.80，加入-15℃的 95％乙醇，使最终乙醇浓度达到20％v/v，-5.0℃继续搅拌2h，静置2h以上，每1kg反应液加 入硅藻土15g后，搅拌30min，压滤分离出组分II+III(组分I+II+III)沉淀和滤过液。
(3)组分I+III制作与分离
取组分I+II+III沉淀，用12倍体积，0℃的0.01mol/L氯化钠溶液溶解，开启搅拌至30rpm， 完全溶解后加入醋酸盐缓冲液(pH＝4.0)，调整pH值为5.10，降温至0℃，喷入-15℃的95％ 乙醇，使最终乙醇浓度达到16％v/v，乙醇喷入速度≤80kg/h。控制最终反应液温度为-5.0℃。 乙醇添加完成后，继续搅拌2h，静置6h，50rpm搅拌15min后进行压滤分离，压滤压力控制 在0.05MPa，出液温度控制在-4.5℃，得组分I+III滤液。
(4)S/D灭活
调节上述步骤所得组分I+III滤液pH值至5.30，温度控制至4℃，加入聚乙二醇辛基苯 基醚(Triton X-100)至终浓度为1％，加入磷酸三丁酯(TNBP)至浓度为0.3％，搅拌6h， 静置1h，得S/D灭活液。
(5)第一次超滤
将步骤(4)中得到的S/D灭活液缓慢加入0.5mol/L的盐酸液，调节pH至4.0，然后经0.45μm滤芯过滤后使用30kDa超滤膜包进行浓缩和透析，当蛋白含量浓缩至30g/L时，用5倍浓缩液体积的8℃透析水(注射用水)连续等体积透析脱醇，然后浓缩蛋白含量为60g/L，收集浓缩液于超滤罐中。用适量透析水(注射用水)冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中。
(6)层析
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化：将步骤(5)中超滤收集的浓缩液 先用1mol/L磷酸盐缓冲液调整电导至1.8ms/cm，再用0.5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.50， 蛋白液浓度≥35g/L，待层析上柱提纯；上样前层析系统先用pH4.0醋酸盐缓冲液处理层析柱 (直径800mm，柱高180mm)；再用磷酸盐平衡缓冲液(浓度0.02mol/L，pH值6.60)平衡 层析柱；层析柱平衡完成后进行制品层析上样，上样速度控制在3L/min以内，当层析系统 UV检测器显示峰值刚出现时开始收集流出液，上样完成后用磷酸盐平衡缓冲液顶洗层析柱， 待UV检测器显示值下降至最高峰的约1/6时，停止收集流穿液；用pH4.0醋酸盐缓冲液冲 洗层析柱。
(7)第二次超滤
加入0.5mol/L盐酸溶液(0.5mol/L盐酸溶液添加速度为12kg/h)，调节步骤(6)所得流 出液调整pH至4.0，用6倍浓缩液体积的8℃透析水进行连续等体积透析，透析完成进行终 浓缩，将蛋白液蛋白含量浓缩至55g/L。
(8)灭活病毒
低pH孵放灭活病毒：在pH值3.9条件下，维持制品温度23℃，孵放21天，得灭活液。
(9)纳米膜除病毒过滤
灭活液先用0.1μm滤芯进行预过滤，再用过滤孔径为20nm的纳米膜进行除病毒过滤， 除病毒过滤过程中前端过滤压力为0.3MPa，得除病毒过滤液。
(10)第三次超滤
将步骤(9)得到的除病毒过滤液，用5倍体积的0.85％氯化钠溶液进行透析，并将蛋白 含量浓缩至抗-D抗体效价≥1100IU/ml，得到蛋白超滤液。
(11)半成品配制
根据原液检定结果按照以下要求进行半成品配制：
抗-D抗体效价：1000IU/ml；蛋白含量：140g/L；麦芽糖含量：30g/L；甘氨酸含量：25g/L； pH值：7.4。
(12)除菌灌装
半成品经0.45μm滤芯除菌灌装制得成品。
实施例3Rho(D)人免球蛋白生产工艺3
(1)组分I制作
将100人份以上抗-D抗体滴度大于512的原料血浆合并至反应罐中融浆，用0.9％氯化钠 溶液稀释混合血浆至蛋白含量为55g/L，用pH4.0的醋酸盐缓冲液将稀释后血浆pH值调至 7.20，降温至0℃以下开始加入-30℃以下的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到8％v/v，制品最 终温度控制在-3.0℃，搅拌反应，将反应液离心得组分I上清液；
(2)组分I+II+III制作与分离
用pH4.0的醋酸盐缓冲液调步骤(1)中所得组分I上清液的pH值至7.00，加入-30℃的 95％乙醇，使最终乙醇浓度达到20％v/v，-5.0±0.5℃继续搅拌2h，静置2h以上，每1kg反应 液加入硅藻土15g后，搅拌30min，压滤分离出组分I+II+III沉淀和滤过液。
(3)组分I+III制作与分离
取组分I+II+III沉淀，用12倍体积，0℃的0.01mol/L氯化钠溶液溶解，开启搅拌至50rpm。 完全溶解后加入醋酸盐缓冲液(pH＝4.0)，调整pH值为5.10±0.10，降温至0℃以下，加入-30℃ 以下的95％乙醇，使最终乙醇浓度达到16％v/v，乙醇加入速度为50kg/h。控制最终反应液温 度为-5.0℃。乙醇添加完成后，继续搅拌2h，静置6h，50rpm搅拌15min后进行压滤分离， 压滤压力控制在0.20MPa，出液温度控制在-4.5℃，得组分I+III滤液。
(4)S/D灭活
调节上述步骤所得组分I+III滤液pH值至5.30，温度控制至4℃，加入聚乙二醇辛基苯 基醚(Triton X-100)至终浓度为1％，加入磷酸三丁酯(TNBP)至浓度为0.3％，搅拌6h， 静置1h，得S/D灭活液。
(5)第一次超滤
将步骤(4)中得到的S/D灭活液缓慢加入0.5mol/L的盐酸液，调节pH至3.8，然后经0.45μm滤芯过滤后使用30kDa超滤膜包进行浓缩和透析，当蛋白含量浓缩至40g/L时，用5倍浓缩液体积的2℃透析水(注射用水)连续等体积透析脱醇，然后浓缩蛋白含量＞60g/L，收集浓缩液于超滤罐中。用适量透析水(注射用水)冲洗超滤膜，将冲洗液并入浓缩液中。
(6)层析
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析柱纯化：将步骤(5)中超滤收集的浓缩液 先用1mol/L磷酸盐缓冲液调整电导至2.2ms/cm，再用0.5mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.70， 蛋白液浓度≥35g/L，待层析上柱提纯；上样前层析系统先用pH4.0醋酸盐缓冲液处理层析柱 (直径800mm，柱高180mm)；再用磷酸盐平衡缓冲液(浓度0.02mol/L，pH值6.60)平衡 层析柱；层析柱平衡完成后进行制品层析上样，上样速度控制在3L/min以内，当层析系统 UV检测器显示峰值刚出现时开始收集流出液，上样完成后用磷酸盐平衡缓冲液顶洗层析柱， 待UV检测器显示值下降至最高峰的约1/6时，停止收集流穿液；用pH4.0醋酸盐缓冲液冲 洗层析柱。
(7)第二次超滤
加入0.5mol/L盐酸溶液，调节步骤(6)所得流出液调整pH至4.2，用6倍浓缩液体积的2℃透析水进行连续等体积透析，透析完成进行终浓缩，将蛋白液蛋白含量浓缩至55g/L。
(8)灭活病毒
低pH孵放灭活病毒：在pH值3.9条件下，蛋白含量为52g/L，维持制品温度23℃，孵放30天，得灭活液。
(9)纳米膜除病毒过滤
灭活液先用0.1μm滤芯进行预过滤，再用过滤孔径为20nm的纳米膜进行除病毒过滤， 除病毒过滤过程中前端过滤压力为0.3MPa，得除病毒过滤液。
(10)第三次超滤
将步骤(9)得到的除病毒过滤液，用5倍体积的0.85％氯化钠溶液进行透析，并将蛋白 含量浓缩至抗-D抗体效价≥1100IU/ml，得到蛋白原液。
(11)半成品配制
根据原液检定结果按照以下要求进行半成品配制：
抗-D抗体效价：1010IU/ml；蛋白含量：140g/L；麦芽糖含量：30g/L；甘氨酸含量：25g/L； pH值：6.8。
(12)除菌灌装
半成品经0.45μm滤芯除菌灌装制得成品。
实施例4成品Rho(D)人免球蛋白的质量指标检测
对实施1-3制备的成品Rho(D)人免球蛋白的纯度、产率和效价进行测定，其中Rho(D) 人免球蛋白的规格为1500IU(1.5ml)/瓶，药典规定人免球蛋白的纯度高于90.0％。结果如 下表1所示，依据本发明所述制备工艺制备获得的成品Rho(D)人免球蛋白的纯度高于99.7％， 收率高达3320瓶/吨，制备的效价与Rho(D)人免球蛋白的规格相同。本发明所述制备工艺采 用S/D灭活病毒和纳米膜过滤除病毒两种灭活/去除工艺，同时灭活脂包膜和非脂包膜病毒， 降低了经血液制品传播疾病的风险，并且所述工艺并不影响Rho(D)人免球蛋白成品的产率， 所得产品收率较传统低温乙醇分离法可提高8％-12％。
表1成品Rho(D)人免球蛋白的质量指标检测结果
实施例1-3所述灭活法完全可以达到去除HIV、HBV和HCV病毒的效果，最低检测限≤0.50LgTCID50/0.1ml。
根据药典规定，对实施例1-3制备的Rho(D)人免球蛋白进行热源检测，结果符合国家药 典规定(注射剂量按家兔体重每1kg注射0.15g蛋白质，符合规定)。
根据药典规定，对实施例1-3制备的Rho(D)人免球蛋白进行灭活剂残留测定，灭活剂残 留量低于限值(磷酸三丁酯小于10μg/ml)。
以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发 明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡 在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种Rho(D)人免球蛋白生产工艺，其特征在于，所述生产工艺包括以下步骤：
(1)制备组分I：用0.9％氯化钠溶液稀释血浆至蛋白含量为45～55g/L，调血浆pH为7.1～7.3，0℃以下加入-15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为8％v/v，控制终温度-3.0℃～-2.0℃搅拌反应，离心得组分I上清液；
(2)制备组分II+III：调步骤(1)所得组分I上清液pH为6.80～7.0，加入-15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为21％v/v，控制终温度-6.0℃～-4.0℃搅拌得反应液，将反应液分离获得组分I+II+III沉淀；
(3)制备组分I+III：用氯化钠溶液溶解步骤(2)所述的组分I+II+III沉淀，调溶液pH为5.00～5.20，0℃以下，加入-15℃以下的95％乙醇，使乙醇终浓度为16％v/v，控制终温度-6.0℃～-4.0℃搅拌反应，将反应液压滤分离获得组分I+III滤液；
(4)S/D灭活：调节步骤(3)所得组分I+III滤液pH为5.25～5.35，4～8℃下加入1％的Triton X-100和0.3％的磷酸三丁酯(TNBP)，搅拌后静置，分离获得S/D灭活液；
(5)第一次超滤：步骤(4)所述S/D灭活液pH为3.8～4.0，用0.45μm滤芯过滤后使用30kDa超滤膜包进行浓缩至蛋白含量为30～50g/L时，用2～8℃透析水连续等体积透析脱醇至蛋白含量＞60g/L，得蛋白超滤液；
(6)层析：调节步骤(5)所述透析液电导为1.8～2.2ms/cm，pH为6.50～6.70，蛋白液浓度≥35g/L，上离子交换层析柱，收集层析液；
(7)第二次超滤：调节步骤(6)所述流出液pH为3.8～4.2，用2～8℃透析水连续等体积透析至蛋白含量≥55g/L，得蛋白超滤液；
(8)灭活病毒：采用低pH孵放灭活病毒，得灭活液，所述pH小于4；
(9)纳米膜过滤除病毒：用过滤孔径20nm的纳米膜进行除病毒过滤，得除病毒过滤液；
(10)第三次超滤：将步骤(9)得到的除病毒过滤液，用0.85％氯化钠溶液进行透析至蛋白含量≥110g/L，得蛋白原液；
(11)成品：加入麦芽糖和甘氨酸，配置半成品，调pH值为6.4～7.4，0.45μm滤芯除菌灌装制得成品。
2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(2)中所述反应液分离前，需在反应液中加入硅藻土，所述加入硅藻土的量为15g/kg。
3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(3)中所述氯化钠溶液的浓度为0.03mol/L。
4.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(3)中所述分离为压滤分离，所述压滤压力为0.05～0.25MPa，所述出液温度为-5.5℃～-3.5℃。
5.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(6)中所述浓缩液上离子交换层析柱前，需先平衡层析柱，所述平衡过程为：先用醋酸盐缓冲液处理层析柱，再用磷酸盐平衡缓冲液平衡层析柱。
6.如权利要求5所述的生产工艺，其特征在于，所述离子层析柱为DEAE SepharoseFast Flow离子交换层析柱，所述上样速度≤4L/min。
7.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(8)中所述低pH孵放灭活步骤为：调pH为3.9～4.3，在23～25℃条件下，孵放至少21天。
8.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(10)中所述除病毒过滤过程中的前端过滤压力≤0.3MPa。
9.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，步骤(11)所述半成品中抗-D抗体效价为1000IU/ml，蛋白含量为140g/L，麦芽糖含量为30g/L，甘氨酸含量为25g/L，pH值为6.4～7.4。
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