CN102178951A - 一种生产静注人免疫球蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人血浆蛋白的制备方法，具体是采用压滤法分离结合层析法纯化生产静注人免疫球蛋白的方法。其特征是采用压滤机为主要分离设备，代替离心机进行静注人免疫球蛋白的生产，使分离的温度等条件容易控制，分离速度快，而且没有高速运转设备，生产安全性高；同时，采用离子交换层析法进行产品的进一步纯化，得到高纯度的静注人免疫球蛋白，使静注人免疫球蛋白的纯度达到98.5％～100％，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA≤3IU/ml，ACA≤9％，而且采用该工艺回收率高，每吨血浆能收获静注人免疫球蛋白5600克～6300克。
Description
技术领域
本发明涉及人血浆蛋白的制备方法，具体是采用压滤法分离结合层析法纯化生产静注人免疫球蛋白工艺。
背景技术
静注人免疫球蛋白系由人血浆分离制备，并经病毒灭活处理的非特异性免疫球蛋白液体制剂，其中免疫球蛋白在95％以上，临床上主要用于治疗各种原发和继发性免疫球蛋白缺陷以及一些自身免疫性疾病。血浆蛋白的分离方法很多，低温乙醇法、盐析法和利凡诺法等。免疫球蛋白的大规模工业化生产，国外多数厂家采用Cohn低温乙醇法或其它变性方法，东欧和俄罗斯采用利凡诺法和我国个别单位利凡诺法，但1996年底废止。曾个别单位采用盐析法，现已淘汰。目前国内外多数采用低温乙醇法，但是目前采用的低温乙醇法主要存在以下不足：采用低温冷冻离心机作为分离设备分离血浆蛋白成分。操作温度不易控制、离心机分离效果不稳定、分离速度慢、同时离心机属于高速运转设备，生产安全事故时有发生，生产安全性不高；一般没有进一步纯化的工艺步骤，产品纯度不高。如申请专利号为02103826.0.即采用离心法分离，操作温度不易控制、离心机分离效果不稳定、分离速度慢、同时离心机属于高速运转设备，生产安全事故时有发生，生产安全性不高。我公司经过研究，发明了一种压滤法分离结合层析法纯化生产静注人免疫球蛋白的新工艺，首先采用低温乙醇工艺提取组分I+II+III沉淀，再将该沉淀溶解后，采用低温乙醇工艺分离出组分I+III沉淀，上清液再调节相关参数后，分离出II沉淀。溶解II沉淀后，用离子交换层析进行精制纯化，得到高纯度的静注人免疫球蛋白，使静注人免疫球蛋白的纯度达到98.5％～100％，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA小于等于3IU/ml，ACA小于等于9％，而且采用该工艺回收率高，每吨血浆能收获静注人免疫球蛋白5600克～6300克。
发明内容
本发明的目的就是采用压滤机为主要分离设备，代替离心机进行静注人免疫球蛋白的生产，使分离的温度等条件容易控制，分离速度快，而且没有高速运转设备，生产安全性高；同时，采用离子交换层析法进行产品的进一步纯化，使产品纯度可达98％以上。本发明的目的是这样实现的：采用压滤法分离结合层析法纯化生产静注人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05-0.3MPa，主要包括以下生产步骤：
A、从血浆中分离组分I+II+III：将冷冻血浆在不高于37℃的条件下融化，调整温度在1～4℃之间，或者把新鲜血浆直接调整温度在1～4℃之间，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到5.8～6.2，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为20％～22％，使反应液的最终温度为-4～-6℃，加入1％～2％(g/ml)的硅藻土做助滤剂，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+II+III沉淀；
B、从组分I+II+III沉淀分离组分I+III：将组分I+II+III沉淀溶解于4～6倍量预冷0～2℃的注射用水中，搅拌3小时以上，制冷反应液使其温度维持在0～2℃，搅拌至溶解。加入醋酸缓冲液，调节反应液pH值为5.1～5.4，向反应液加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为17％～19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-4.5～-5.5℃，继续搅拌1小时，用压滤机进行加压过滤。过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+III，冷冻保存组分I+III沉淀留作他用；
C、分离组分II：将上步加压过滤后的上清液用1M的碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值为7.0～7.6，加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25％～28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-8～-10℃，继续搅拌1小时，静止2小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为人免疫球蛋白的粗制品；
D、层析法纯化：采用阴离子交换层析介质：二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱层析。将上步获得的组分II沉淀用3～6倍量0～5℃的注射用水溶解，过滤澄清。加入3％盐酸，调节组分II溶解液pH值在6.5～6.7之间，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5～6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到6％～8％(g/ml)时，加入9倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％Hcl适量，即得静注人免疫球蛋白原液；
E、配制：透析结束后，加入麦芽糖，补加注射用水，用3％Hcl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.9～4.4，使最终制品人免疫球蛋白含量为53～55g/L，麦芽糖含量为9％～11％(g/ml)，除菌过滤，进行低pH孵育法病毒灭活，灭活结束后，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注人免疫球蛋白。
本发明的主要优点就是采用压滤机为主要分离设备，代替离心机进行静注人免疫球蛋白的生产，使分离的温度等条件容易控制，分离速度快，而且没有高速运转设备，生产安全性高；同时，采用离子交换层析法进行产品的进一步纯化，使静注人免疫球蛋白的纯度达到98.5％～100％，单体和二聚体之和达到99％～99.5％，PKA小于等于3IU/ml，ACA小于等于9％，而且采用该工艺回收率高，每吨血浆能收获静注人免疫球蛋白5600克～6300克。
附图说明
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明工艺流程图。
具体实施方式
实施例1：
A、从血浆中分离组分I+II+III沉淀：将冷冻血浆1000L在35℃的条件下融化，调整血浆温度为1℃，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆的pH值为5.8，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中最终的乙醇浓度为20％，把反应液的温度调整到-4℃，加入1％(g/ml)的硅藻土做助滤剂，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+II+III沉淀。
B、从组分I+II+III沉淀分离组分I+III：将组分I+II+III沉淀溶解于4倍量预冷0℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至0℃，搅拌至溶解。加入醋酸缓冲液，调节反应液的pH值为5.10，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达17％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-4.5℃，继续搅拌1小时，用压滤机进行加压过滤。过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+III，冷冻保存
C、分离组分II：将上步加压过滤后的上清液用1M的碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值为7.0，用浓度为95％的乙醇把反应液的乙醇浓度调整到25％，把温度调整到-8℃，继续搅拌1小时，静止2小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为人免疫球蛋白的粗制品。
D、层析法纯化：将上步获得的组分II沉淀用3倍量0℃的注射用水溶解，滤芯澄清。加入3％盐酸，调节组分II溶解液的pH值为6.5，将层析柱用pH值为6.5的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到6％(g/ml)时，加入9倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％Hcl适量，即得静注人免疫球蛋白原液；
E、配制：透析结束后，加入麦芽糖，补加注射用水，用3％Hcl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.9，使最终制品人免疫球蛋白含量为53g/L，麦芽糖含量为9％(g/ml)，除菌过滤，进行低pH孵育法病毒灭活，灭活结束后，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注人免疫球蛋白。
表1：产品的主要质量指标
实施例2：
A、从血浆中分离组分I+II+III沉淀：将冷冻血浆1000L在32℃的条件下融化，调整血浆温度为2℃，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆的pH值为6.0，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中最终的乙醇浓度为21％，把反应液的温度调整到-5℃，加入1.5％(g/ml)的硅藻土做助滤剂，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+II+III沉淀。
B、从组分I+II+III沉淀分离组分I+III：将组分I+II+III沉淀溶解于5倍量预冷1℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至1℃，搅拌至溶解。加入醋酸缓冲液，调节反应液的pH值为5.25，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达18％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-5.0℃，继续搅拌1小时，用压滤机进行加压过滤。过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+III，冷冻保存
C、分离组分II：将上步加压过滤后的上清液用1M的碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值为7.3，用浓度为95％的乙醇把反应液的乙醇浓度调整到26％，把温度调整到-9℃，继续搅拌1小时，静止2小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为人免疫球蛋白的粗制品。
D、层析法纯化：将上步获得的组分II沉淀用4倍量2℃的注射用水溶解，滤芯澄清。加入3％盐酸，调节组分II溶解液的pH值为6.6，将层析柱用pH值为6.6的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.6后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到7％(g/ml)时，加入9倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％Hcl适量，即得静注人免疫球蛋白原液；
E、配制：透析结束后，加入麦芽糖，补加注射用水，用3％Hcl调整浓缩后蛋白液的pH值为4.2，使最终制品人免疫球蛋白含量为54g/L，麦芽糖含量为10％(g/ml)，除菌过滤，进行低pH孵育法病毒灭活，灭活结束后，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注人免疫球蛋白。
表2：产品的主要质量指标
实施例3：
A、从血浆中分离组分I+II+III沉淀：将冷冻血浆1000L在30℃的条件下融化，调整血浆温度为4℃，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆的pH值为6.2，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中最终的乙醇浓度为22％，把反应液的温度调整到-6℃，加入2.0％(g/ml)的硅藻土做助滤剂，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+II+III沉淀。
B、从组分I+II+III沉淀分离组分I+III：将组分I+II+III沉淀溶解于6倍量预冷2℃的注射用水，搅拌3小时以上，制冷反应液温度至2℃，搅拌至溶解。加入醋酸缓冲液，调节反应液的pH值为5.40，向反应液加入95％乙醇，使反应液的乙醇浓度达19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，最终温度达-5.5℃，继续搅拌1小时，用压滤机进行加压过滤。过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+III，冷冻保存
C、分离组分II：将上步加压过滤后的上清液用1M的碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值为7.6，用浓度为95％的乙醇把反应液的乙醇浓度调整到28％，把温度调整到-10℃，继续搅拌1小时，静止2小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为人免疫球蛋白的粗制品。
D、层析法纯化：将上步获得的组分II沉淀用6倍量5℃的注射用水溶解，滤芯澄清。加入3％盐酸，调节组分II溶解液的pH值为6.7，将层析柱用pH值为6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到8％(g/ml)时，加入9倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％Hcl适量，即得静注人免疫球蛋白原液；
E、配制：透析结束后，加入麦芽糖，补加注射用水，用3％Hcl调整浓缩后蛋白液的pH值为4.4，使最终制品人免疫球蛋白含量为55g/L，麦芽糖含量为11％(g/ml)，除菌过滤，进行低pH孵育法病毒灭活，灭活结束后，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装即得成品静注人免疫球蛋白。
表3：产品的主要质量指标
Claims (8)
1.一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于：以人血浆为原料，采用压滤法分离结合层析法纯化生产静注人免疫球蛋白，生产操作压力为0.05～0.3MPa，主要包括以下生产步骤：
(a)从血浆中分离组分I+II+III；
(b)从组分I+II+III沉淀分离组分I+III；
(c)分离组分II；
(d)层析法纯化；
(e)病毒灭活；
(f)配制静注人免疫球蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(a)所述的从血浆中分离组分I+II+III，是按以下步骤进行的：从血浆中分离组分I+II+III：将冷冻血浆在不高于37℃的条件下融化，调整温度在1～4℃之间，或者把新鲜血浆直接调整温度在1～4℃之间，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节血浆pH值到5.8～6.2，加入浓度为95％的乙醇，使血浆中乙醇的最终浓度为20％～22％，使反应液的最终温度为-4～-6℃，用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+II+III沉淀。
3.根据权利要求1所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(b)所述的从组分I+II+III沉淀分离组分I+III，是按以下步骤进行的：从组分I+II+III沉淀分离组分I+III：将组分I+II+III沉淀溶解于4～6倍量预冷0～2℃的注射用水中，搅拌3小时以上，制冷反应液使其温度维持在0～2℃，搅拌至溶解。加入醋酸缓冲液，调节反应液pH值为5.1～5.4，向反应液加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为17％～19％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-4.5～-5.5℃，继续搅拌1小时，用压滤机进行加压过滤。过滤后的清液入另一个反应罐，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分I+III，冷冻保存组分I+III沉淀留作他用。
4.根据权利要求1所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤(c)所述的分离组分II，是按以下步骤进行的：将上步加压过滤后的上清液用1M的碳酸氢钠溶液调节溶液的pH值为7.0～7.6，加入95％的乙醇，使反应液乙醇的最终浓度为25％～28％，在加入乙醇过程中，冷却反应液，使其最终温度为-8～-10℃，继续搅拌1小时，静止2小时后用压滤机进行加压过滤，过滤后的清液做回收乙醇处理，过滤完成时用压缩空气将压滤机吹干，打开压滤机，收取组分II沉淀，组分II沉淀即为人免疫球蛋白的粗制品。
5.根据权利要求1所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤d所述的层析法纯化，采用的是阴离子交换层析介质：二乙氨乙基交联葡聚糖凝胶装填层析柱层析。将上步获得的组分II沉淀用3～6倍量0～5℃的注射用水溶解，过滤澄清。加入3％盐酸，调节组分II溶解液pH值在6.5～6.7之间，用5％氯化钠溶液调节溶液的电导为1.30～1.50ms/m，将层析柱用pH值为6.5～6.7的0.03M磷酸盐缓冲液平衡至出液的pH值为6.5～6.7后，上样，收集流出的蛋白峰，上样结束后，用0.03M磷酸盐缓冲液冲洗凝胶上的残余蛋白，合并上述两项蛋白液称重，将调整好的蛋白液抽至清洁的反应罐中，启动超滤器，开始预浓缩，蛋白浓度达到6％～8％(g/ml)时，加入9倍2℃注射用水进行透析，透析过程中注意补加3％Hcl适量，即得静注人免疫球蛋白原液。
6.根据权利要求1所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤e所述的病毒灭活，是在透析结束后，加入麦芽糖，补加注射用水，用3％Hcl调整浓缩后蛋白液的pH值为3.9～4.4，使最终制品人免疫球蛋白含量为53～55g/L，麦芽糖含量为9％～11％(g/ml)，除菌过滤，进行低pH孵育法病毒灭活。
7.根据权利要求1所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于步骤f所述的配制：是在灭菌灭活结束后，再用纳米膜过滤法进行病毒去除处理，然后进行除菌分装既得成品静注人免疫球蛋白。
8.根据权利要求2所述的一种生产静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于在加压过滤时，加入1％～2％(g/ml)的硅藻土做助滤剂。
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