CN110467664A - 一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，包括：步骤一、富含球蛋白的沉淀制备：调节蛋白含量至5％；调节pH值以及温度；乙醇加入完毕后再调节PH；搅拌反应；用14.5％乙醇平衡液荡洗离心杯，离心杯预冷，制品离心，取上清液，将所述上清液降温至‑4.8～‑5.5℃后过滤，备用；步骤二、球蛋白的分离：球蛋白的制作分离；球蛋白压滤分离；步骤三、球蛋白的纯化。本发明仅对猪血浆球蛋白建立提取工艺，所得产品为单一蛋白；通过调控温度、pH等参数，综合利用乙醇沉淀和透析技术，目的蛋白具有高纯度和高提取率；采用的材料价格低廉，极大了降低成本；整个分离纯化过程不到10小时，分离效率高；猪血浆球蛋白为高附加值产品，可以显著提高猪血的利用价值。
Description
技术领域
本发明涉及球蛋白分离纯化技术领域，特别涉及一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法。
背景技术
球蛋白是一种广泛存在于人体或动物血液中的免疫蛋白，也称为免疫球蛋白。免疫系统遇到外来的入侵物时,会根据入侵物的不同而产生不同数量的球蛋白，如果入侵物比较难以消灭，免疫系统刺激淋巴后就会产生更多的球蛋白，直至入侵物被消灭。
目前，人用球蛋白主要来自健康人群的静脉血，其中丙种球蛋白制剂按蛋白质含量有10％、16％、16.5％等数种(国内制品浓度在10％以上)，其中丙种球蛋白占95％以上；另一种为胎盘血来源的丙种球蛋白(人胎盘血丙种球蛋白)，即胎盘球蛋白，制剂含蛋白质5％，其中丙种球蛋白占90％以上。胎盘球蛋白制剂因丙种球蛋白含量以及纯度均较低，其用量应相应增大。
猪血浆富含多种功能活性蛋白，其中球蛋白含量约占2％。生猪在屠宰过程中会产生大量的猪血副产物,目前猪血的开发利用主要是以全血为原料应用于食品及饲料工业中,产品附加值非常低,尤其对于血液中具有功能活性的蛋白利用率更加不足,这主要是因为血液中的功能活性蛋白的提取技术不过硬造成的。目前，提取动物血液中单一蛋白的主要方法有盐析法、层析法、色谱法和超滤法，均存在成本高昂、回收率低、产品纯度低、对生产设备和环境要求高、分离操作过程繁琐等难以突破的实际问题。因此，规模化的球蛋白制备仍存在较大的工艺优化空间。
猪血浆球蛋白具有多种用途，目前尚未见其规模化制备技术。本申请采用乙醇低温纯化法提取猪血浆中的球蛋白，通过调控蛋白浓度和pH值，使绝大部分的球蛋白沉淀，进而分离目的蛋白，具有成本低廉、回收率高、产品纯度高、操作简单的特点，同时适用于工厂规模化制备猪血浆球蛋白。
发明内容
发明的目的在于提供一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，解决了背景技术中存在的问题。
本发明是这样实现的，一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、富含球蛋白的沉淀制备：
a、调蛋白含量：通过双缩脲法测定1000mL血浆中蛋白含量，用0.9％氯化钠稀释血浆至蛋白含量为5％；
b、调pH值以及温度：检测稀释后的血浆pH值，并用1M/L柠檬酸调整PH到6.5-6.8，调节温度至1±0.5℃，加入乙醇；
c、乙醇加入完毕后再调节PH为6.6±0.1；
d、搅拌反应：温度控制在-4.5～-5.0℃，搅拌反应2小时，
e、用14.5％乙醇平衡液荡洗离心杯，离心杯预冷至-3.0℃～-4.5℃，制品离心，取上清液，将所述上清液降温至-4.8～-5.5℃后过滤，备用；
步骤二、球蛋白的分离：
a、球蛋白的制作分离：计量上清液的体积，启动搅拌系统，使温度降至-3℃～-4℃，每1L上清液加入1M氯化钠86mL，用0.5M氢氧化钠调pH＝6.6-6.8，加入温度为-25℃～-20℃的95％乙醇，控制制品中最终乙醇的浓度为18％，反应温度-5.0℃～-6.0℃，搅拌反应时间为2-4小时；
b、球蛋白压滤分离：干净的离心杯用18％平衡液荡洗一次，离心杯预冷至温度-4.0℃～-5.5℃，装入制品开启离心机，离心温度保持在-4.0℃～-6.0℃，离心至上清液澄清，弃上清，得离心沉淀，备用；
步骤三、球蛋白的纯化；溶解所述离心沉淀，用1M醋酸调PH为3.8-4.5，澄清过滤后脱醇，用0.5M盐酸调制品pH为3.60-3.70，制品蛋白浓度浓缩至6-8％，用7-8℃注射用水连续等体积透析，至电导率小于0.8ms/cm，制品按蛋白含量5.20-5.5％稀释，PH调节至3.8-4.4，加入山梨醇或葡萄糖4-6％加入，除菌分装。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤一中加入乙醇前，事先预冷却至乙醇温度为-15℃～-10℃的作为冷却液，以保证溶液温度控制在-2℃～-3℃范围，加入乙醇时，所述乙醇为95％乙醇，每升制品加95％的乙醇量267mL，控制最终乙醇浓度为20％。加入乙醇时，乙醇含量在30％以前会释放大量热，前期乙醇加入需缓慢，降温应及时以防止蛋白变性。可用事先预冷却至-10℃左右的乙醇作为冷却液，以保证溶液温度一直控制在-2℃至-3℃范围，否则蛋白会变性或溶液结冰。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤一离心步骤中，离心温度保持在-3.0℃～-5.0℃，12000-15000rpm/min离心20-30min，至上清液澄清，收集富含球蛋白的上清液。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤一中的14.5％乙醇平衡液的制备方法为：在8.5L纯水中加入1.5升的95％乙醇以及氯化钠8.7g，调节pH为5.10～5.15，温度在-4.5℃～-5.5℃，所述氯化钠浓度为0.015M。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤一过滤步骤中用0.3～0.8μm滤膜过滤，过滤前需用14.5％乙醇平衡液进行平衡，过滤后用14.5％乙醇平衡液进行清洗。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤二球蛋白的制作分离中1M氯化钠的配制为：每1L反应液配制1M氯化钠90mL，所配制的氯化钠溶液含14.5％乙醇，降温至-3℃～-4℃备用。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤二球蛋白的制作分离中，需加入95％乙醇量(L)＝反应液体积(L)×3.5％÷77％。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤二球蛋白的制作分离中，所述18％平衡液制备方法为：8.1L注射用水加95％乙醇和氯化钠，所述乙醇的加入量为1.9L，所述氯化钠加入量为48.6g，调pH为6.7-6.9，温度为-5.0℃～-6.0℃。
本发明的进一步技术方案是：所述步骤三为：用5倍沉淀量的2-4℃注射用水溶解，1M醋酸调pH＝3.8-4.5，澄清过滤；
所述脱醇采用中空纤维超滤柱超滤脱醇；
所述透析为用7-8℃注射用水连续等体积6倍透析。
本发明的有益效果：
1、对猪(动物)血浆中的单一蛋白建立提取工艺，所得产品为单一蛋白，而不是多种蛋白，提高了产品质量；
2、综合利用温度、pH、乙醇沉淀和透析技术分离目的蛋白，最大限度保证了目的蛋白的高纯度和高提取率；
3、避免了使用昂贵的层析柱、离子树脂等分离介质，采用的材料(乙醇)价格低廉，极大降低了成本；
4、工艺、设备比较简单，整个分离纯化过程不到10小时，分离效率高于其它方法，适合工厂化规模制备；
5、本发明充分的利用了猪血浆，对猪血浆进行了深度开发利用，增加了猪血浆的产品附加值。
6、采用环保型分离纯化材料乙醇，易挥发，无污染，避免了采用其他分离纯化材料对产品品质的影响和对环境的破坏。
具体实施方式
实施例一：
一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、富含球蛋白的沉淀制备：
a、调蛋白含量：通过双缩脲法测定1L血浆中的蛋白含量，用0.9％氯化钠稀释血浆至蛋白含量为5％；
b、调pH值以及温度：检测稀释后的血浆pH值，并用1M/L柠檬酸调整PH到6.5，调节温度至1℃，加入乙醇；
c、乙醇加入完毕后再调节PH为6.6；
d、搅拌反应：温度控制在-4.5℃，搅拌反应2小时；
e、用14.5％乙醇平衡液荡洗离心杯，离心杯预冷至-3.0℃，制品离心，取上清液，将所述上清液降温至-4.8℃后过滤，备用；
步骤二、球蛋白的分离：
a、球蛋白的制作分离：计量上清液的体积，启动搅拌系统，使温度降至-3℃，每1L上清液加入1M氯化钠86mL，用0.5M氢氧化钠调pH＝6.6，加入温度为-25℃的95％乙醇，控制制品中最终乙醇的浓度为18％，反应温度-5.0℃，搅拌反应时间为2小时；
b、球蛋白压滤分离：干净的离心杯用18％平衡液荡洗一次，离心杯预冷至温度-4.0℃，装入制品开启离心机，离心温度保持在-4.0℃，离心至上清液澄清，弃上清，得离心沉淀，备用；
步骤三、球蛋白的纯化；溶解所述离心沉淀，用1M醋酸调PH为3.8，澄清过滤后脱醇，用0.5M盐酸调制品pH为3.60，制品蛋白浓度浓缩至6％，用7℃注射用水连续等体积透析，至电导率小于0.8ms/cm，制品按蛋白含量5.20％稀释，PH调节至3.8，加入山梨醇或葡萄糖4％加入，除菌分装。
所述步骤一中加入乙醇前，事先预冷却至乙醇温度为-15℃℃的作为冷却液，以保证溶液温度控制在-2℃℃范围，加入乙醇时，所述乙醇为95％乙醇，每升制品加95％的乙醇量267mL，控制最终乙醇浓度为20％。
所述步骤一离心步骤中，离心温度保持在-3.0℃，12000rpm/min离心20min，至上清液澄清，收集富含球蛋白的上清液。
所述步骤一中的14.5％乙醇平衡液的制备方法为：在8.5L纯水中加入1.5升的95％乙醇以及氯化钠8.7g，调节pH为5.10，温度在-4.5℃℃，所述氯化钠浓度为0.015M。
所述步骤一过滤步骤中用0.3μm滤膜过滤，过滤前需用14.5％乙醇平衡液进行平衡，过滤后用14.5％乙醇平衡液进行清洗。
所述步骤二球蛋白的制作分离中1M氯化钠的配制为：每1L反应液配制1M氯化钠90mL，所配制的氯化钠溶液含14.5％乙醇，降温至-3℃备用。
所述步骤二球蛋白的制作分离中，需加入95％乙醇量(L)＝反应液体积(L)×3.5％÷77％。
所述步骤二球蛋白的制作分离中，所述18％平衡液制备方法为：8.1L注射用水加95％乙醇和氯化钠，所述乙醇的加入量为1.9L，所述氯化钠加入量为48.6g，调pH为6.7，温度为-5.0℃。
所述步骤三为：用5倍沉淀量的2℃注射用水溶解，1M醋酸调pH＝3.8，澄清过滤；
所述脱醇采用中空纤维超滤柱超滤脱醇；
所述透析为用7℃注射用水连续等体积6倍透析。
实施例一中的实验结果为：球蛋白最终获得率为30％，达到5.2g/L，产品纯度为99.6％，分离过程耗时8小时45分。
实施例二：一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一、富含球蛋白的沉淀制备：
a、调蛋白含量：通过双缩脲法测定1000mL血浆中蛋白含量，用0.9％氯化钠稀释血浆至蛋白含量为5％；
b、调pH值以及温度：检测稀释后的血浆pH值，并用1M/L柠檬酸调整PH到6.6，调节温度至1.5℃，加入乙醇；
c、乙醇加入完毕后再调节PH为6.7；
d、搅拌反应：温度控制在-4.6℃，搅拌反应2小时，
e、用14.5％乙醇平衡液荡洗离心杯，离心杯预冷至-4.0℃，制品离心，取上清液，将所述上清液降温至-5.0℃后过滤，备用；
步骤二、球蛋白的分离：
a、球蛋白的制作分离：计量上清液的体积，启动搅拌系统，使温度降至-4℃，每1L上清液加入1M氯化钠86mL，用0.5M氢氧化钠调pH＝6.7，加入温度为-23℃的95％乙醇，控制制品中最终乙醇的浓度为18％，反应温度-5.5℃，搅拌反应时间为3小时；
b、球蛋白压滤分离：干净的离心杯用18％平衡液荡洗一次，离心杯预冷至温度-5.0℃，装入制品开启离心机，离心温度保持在-5.0℃，离心至上清液澄清，弃上清，得离心沉淀，备用；
步骤三、球蛋白的纯化；溶解所述离心沉淀，用1M醋酸调PH为4.0，澄清过滤后脱醇，用0.5M盐酸调制品pH为3.65，制品蛋白浓度浓缩至7％，用8℃注射用水连续等体积透析，至电导率小于0.8ms/cm，制品按蛋白含量5.30％稀释，PH调节至4.0，加入山梨醇或葡萄糖5％加入，除菌分装。
所述步骤一中加入乙醇前，事先预冷却至乙醇温度为-13℃的作为冷却液，以保证溶液温度控制在-3℃范围，加入乙醇时，所述乙醇为95％乙醇，每升制品加95％的乙醇量267mL，控制最终乙醇浓度为20％。
所述步骤一离心步骤中，离心温度保持在-4.0℃，13000rpm/min离心25min，至上清液澄清，收集富含球蛋白的上清液。
所述步骤一中的14.5％乙醇平衡液的制备方法为：在8.5L纯水中加入1.5升的95％乙醇以及氯化钠8.7g，调节pH为5.15，温度在-5.5℃，所述氯化钠浓度为0.015M。
所述步骤一过滤步骤中用0.5μm滤膜过滤，过滤前需用14.5％乙醇平衡液进行平衡，过滤后用14.5％乙醇平衡液进行清洗。
所述步骤二球蛋白的制作分离中1M氯化钠的配制为：每1L反应液配制1M氯化钠90mL，所配制的氯化钠溶液含14.5％乙醇，降温至-4℃备用。
所述步骤二球蛋白的制作分离中，需加入95％乙醇量(L)＝反应液体积(L)×3.5％÷77％。
所述步骤二球蛋白的制作分离中，所述18％平衡液制备方法为：8.1L注射用水加95％乙醇和氯化钠，所述乙醇的加入量为1.9L，所述氯化钠加入量为48.6g，调pH为6.8，温度为-5.5℃。
所述步骤三为：用5倍沉淀量的3℃注射用水溶解，1M醋酸调pH＝4.0，澄清过滤；
所述脱醇采用中空纤维超滤柱超滤脱醇；
所述透析为用8℃注射用水连续等体积6倍透析。
实施例二中的实验结果为：球蛋白最终获得率为35％，达到6.0g/L，产品纯度为99.8％，分离过程耗时9小时40分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤一、富含球蛋白的沉淀制备：
a、调蛋白含量：通过双缩脲法测定1000mL血浆中蛋白含量，用0.9％氯化钠稀释血浆至蛋白含量为5％；
b、调pH值以及温度：检测稀释后的血浆pH值，并用1M/L柠檬酸调整PH到6.5-6.8，调节温度至1±0.5℃，加入乙醇；
c、乙醇加入完毕后再调节PH为6.6±0.1；
d、搅拌反应：温度控制在-4.5～-5.0℃，搅拌反应2小时，
e、用14.5％乙醇平衡液荡洗离心杯，离心杯预冷至-3.0℃～-4.5℃，制品离心，取上清液，将所述上清液降温至-4.8～-5.5℃后过滤，备用；
步骤二、球蛋白的分离：
a、球蛋白的制作分离：计量上清液的体积，启动搅拌系统，使温度降至-3℃～-4℃，每1L上清液加入1M氯化钠86mL，用0.5M氢氧化钠调pH为6.6-6.8，加入温度为-25℃～-20℃的95％乙醇，控制制品中最终乙醇的浓度为18％，反应温度-5.0℃～-6.0℃，搅拌反应时间为2-4小时；
b、球蛋白压滤分离：干净的离心杯用18％平衡液荡洗一次，离心杯预冷至温度-4.0℃～-5.5℃，装入制品后开启离心机，离心温度保持在-4.0℃～-6.0℃，离心至上清液澄清，弃上清，得离心沉淀，备用；
步骤三、球蛋白的纯化；溶解所述离心沉淀，用1M醋酸调PH为3.8-4.5，澄清过滤后脱醇，用0.5M盐酸调制品pH为3.60-3.70，制品蛋白浓度浓缩至6-8％，用7-8℃注射用水连续等体积透析，至电导率小于0.8ms/cm，制品按蛋白含量5.20-5.5％稀释，PH调节至3.8-4.4，加入山梨醇或葡萄糖4-6％加入，除菌分装。
2.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤一中加入乙醇前，事先预冷却至乙醇温度为-15℃～-10℃的作为冷却液，以保证溶液温度控制在-2℃～-3℃范围，加入乙醇时，所述乙醇为95％乙醇，每升制品加95％的乙醇量267mL，控制最终乙醇浓度为20％。
3.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤一离心步骤中，离心温度保持在-3.0℃～-5.0℃，12000-15000rpm/min离心20-30min，至上清液澄清，收集富含球蛋白的上清液。
4.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤一中的14.5％乙醇平衡液的制备方法为：在8.5L纯水中加入1.5升的95％乙醇以及氯化钠8.7g，调节pH为5.10～5.15，温度在-4.5℃～-5.5℃，所述氯化钠浓度为0.015M。
5.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤一过滤步骤中用0.3～0.8μm滤膜过滤，过滤前需用14.5％乙醇平衡液进行平衡，过滤后用14.5％乙醇平衡液进行清洗。
6.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤二球蛋白的制作分离中1M氯化钠的配制为：每1L反应液配制1M氯化钠90mL，所配制的氯化钠溶液含14.5％乙醇，降温至-3℃～-4℃备用。
7.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤二球蛋白的制作分离中，需加入95％乙醇量(L)＝反应液体积(L)×3.5％÷77％。
8.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤二球蛋白的制作分离中，所述18％平衡液制备方法为：8.1L注射用水加95％乙醇和氯化钠，所述乙醇的加入量为1.9L，所述氯化钠加入量为48.6g，调pH为6.7-6.9，温度为-5.0℃～-6.0℃。
9.根据权利要求1所述的一种分离纯化猪血浆球蛋白的方法，其特征在于：所述步骤三为：用5倍沉淀量的2-4℃注射用水溶解，1M醋酸调pH＝3.8-4.5，澄清过滤；
所述脱醇采用中空纤维超滤柱超滤脱醇；
所述透析为用7-8℃注射用水连续等体积6倍透析。
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|---|---|---|---|---|
| CN111333718A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-26 | 贾芳苗 | 用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法及从血浆中分离免疫球蛋白的方法 |
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2019
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111333718A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-26 | 贾芳苗 | 用于沉淀血浆中免疫球蛋白的方法及从血浆中分离免疫球蛋白的方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20191119 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |