CN1137528A - 改良低温乙醇人血白蛋白生产工艺 - Google Patents

改良低温乙醇人血白蛋白生产工艺 Download PDF

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Abstract

一种改良低温乙醇人血白蛋白生产工艺，涉及蛋白质的分离，提纯工艺。本发明特征在于用去冷沉淀血浆为原料，首先分离出组分I+II+III，再分离组分IV，组分IV上清经深滤再分离出组分V，组分V沉淀经12％乙醇纯化获得精制白蛋白。与传统低温乙醇法相比具有白蛋白回收率高，产品质量好，生产周期短，工艺易操作及成本低等优点，并且有利于血浆的综合利用，满足市场对人血蛋白多方面的需求。

Description

改良低温乙醇人血白蛋白生产工艺
本发明涉及蛋白质的分离、提纯工艺方法，具体涉及人血白蛋白的生产工艺，特别涉及传统低温乙醇人血白蛋白生产工艺方法的改良。
自40年代的Cohn等人创立低温乙醇人血浆蛋白质分离技术以来，血浆蛋白质的工业化大生产取得了长足发展。Cohn氏5法和Cohn氏6法已成为大规模生产人血白蛋白的常规工艺。Cohn氏法的目的是在分离白蛋白和丙种球蛋白等主产品的同时，尽可能多地分离出其它血浆蛋白质副产品，以利于血浆的综合利用。由于多数厂家对市场上没有销路的产品不感兴趣，而且工艺越简单白蛋白的回收率越高，所以工艺趋于简化，出现了Nitschmann改良法、Hao简化法、Hink法、Schneid-er法等多种简化工艺。随着医学科学的发展，近年来对血浆蛋白成份的生理功能和临床作用有了更深入的认识，除白蛋白和两种球蛋白外，人们对其它血浆蛋白制品的需求越来越多，于是生产工艺又由简到繁的方向发展。传统的低温乙醇工艺存在着白蛋白回收率偏低、生产周期长，成本较高、产品质量不够好等问题，因此有必要对传统工艺进行改良。
本发明的目的在于寻求一种既能提高白蛋白回收率，又不影响血浆综合利用的改良的低温乙醇人血白蛋白生产工艺。
通过反复实验和长期生产实践，认识到PH值、乙醇浓度、温度、离子强度、蛋白质浓度五因素是影响白蛋白回收率及质量与综合利用效果的主要因素，寻找到一条达到本发明目的的工艺路线及工艺参数。该工艺过程用去冷沉淀血浆为原料，首先分离出组分I+II+III，再分离出组IV，得到的组分IV上清液经深滤后再分离出组分V，组分V经2％乙醇纯化获得精制蛋白。其具体工艺过程为：
A、分离组分I+II+III的条件为：去冷沉淀血浆1倍重量盐水稀释，PH值6.8±0.1，乙醇20％，温度-4±0.5℃，离子强度0.12，蛋白浓度2.5％，经离心分离得组分I+II+III上清及组分I+II+III沉淀。
B、分离组分IV的条件为：组分I+II+III上清，调PH值6.2-6.3，乙醇40％，温度-4±0.5℃，离子强度0.09，蛋白质1.25％，经离心分离得组分IV上清及组分IV沉淀。
C、组分IV上清深滤的条件为：降温至-9～-10℃，0.25％硅藻土，深层过滤得滤液。
D、分离组分V的条件为：滤液PH4.8±0.1，乙醇42％，温度-10--12℃，离子强度0.10，蛋白质0.85％，经离心分离得组分V沉淀及组分V上清。
E、溶解深滤组分V沉淀的条件为：组分V沉淀用6倍冰水溶解，乙醇12％，PH4.5-4.7，温度-2--3℃，蛋白质3％，离子强度0.01，硅藻±0.25％，静置2小时后深滤。
F、超滤的条件：滤液PH6.6-6.8，透析，浓缩。
G、超滤液调PH6.8±0.1，加入辛酸钠0.15mmol/g蛋白质，NaCL150mmol/L。
F、巴化消毒的条件为：60℃保温10小时。
I、除菌过滤。
J、分装：20％的蛋白液。
图面说明：
图1为本发明工艺流程图。
图2为本发明白蛋白层析图谱。
本发明的制品经电泳纯度分析及气相液相色谱等各项分析，与传统工艺对比，结果列于表1，表2及图2。
表1：电泳分析结果
    项    目   本发明   Cohn6法
  电泳纯度(％)     ＞99     ＞96
  57℃水溶热稳定时间(小时)     ＞400     ＜200
  吸收度(403nmOD值)     ＜0.03     ＜0.10
  多聚体含量(％)     ＜1.5       2.0-3.5
表2：加收认及提取率对比
分离方法     白    蛋    白
  回收率％ 提取率(克/升)
Kistler-Nitschmann法 总蛋白的47％     25.0
Hao简化法         93     27.1
本发明       90.3     26.4
总之本发明工艺具有以下特点：1、白蛋白回收率高达90％，提取率为26.4克/升血装。2、产品质量好，电泳纯度在99％以上，热稳定性非常好，3、生产用期短，从投料到超滤的分离工序只需三天时间。4、易掌握，本工艺操作难度小，工艺参数容易掌握，批次重复性好。5、成本低，本工艺的综合生产成本较传统方法低。6、有利于血浆的综合利用。
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1：
(1)500升血浆加入等倍生理盐水，用PH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液调整PH至6.8±0.1，搅拌、降温，至0℃时开始加入95％乙醇，最终控制在温度-4±0.5℃、乙醇浓度20％，95％乙醇用量为266.6升。继续搅拌2小时后用管式离心机离心。(2)收集离心上清液约1230升，用PH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液调PH至6.2-6.3，搅拌下缓慢加入95％乙醇447.3升至40％浓度，温度维持在-4±0.5℃，之后继续搅拌2小时静置过夜。(3)管式离心机离心，得上清液(即组分V上清液)约1640升，按0.25％加入硅藻土，同时降温至-9--10℃过滤，滤液用2M醋酸调整PH至4.8±0.1，补加95％乙醇至42％浓度，控制温度在-10℃，继续搅拌2小时后静放过夜。(4)离心，得粗制白蛋白(组分沉淀)约56公斤，用6倍体积冰水溶解，加入乙醇至12％浓度，用1MNaHCO3调整PH值至4.5-4.7，降温至-2--3℃，按0.25％加入硅藻土深滤。(5)滤液用1MNaHCO3调整PH至6.7±0.1，进行超滤脱醇，脱盐和浓缩，得20.3％浓度白蛋白73.8升。按0.15mmol/g蛋白质和150mmol/L分别加入辛酸钠和Nacl，60℃保温10小时巴氏消毒，之后过滤除菌，按每瓶10克白蛋白进行分装。
下面用表3说明用实施例1工艺生产4批白蛋白回收率及纯度。
   表3：本发明工艺生产的45批白蛋白回收率
批次    血浆体积  血浆总蛋白    纯度       提取率     分装收率    回收率(批)      (升)      (克/升)     (％)       (克/升)    (克/升)    (克/升)
  8    8400     54.2±2.3   98.8±0.30   27.3±0.8  26.8±0.2  91.7±1.58    7680     52.8±1.6   99.2±0.40   25.7±0.5  25.3±0.1  87.8±1.66    6300     48.4±2.0   99.0±0.15   24.2±1.2  23.1±0.2  89.3±0.69    9700     50.6±1.6   98.5±0.18   25.2±0.9  24.1±0.3  89.1±1.77    7300     54.8±2.4   99.0±0.35   27.9±0.6  26.9±0.3  91.7±2.32    1180     54.5        99.4         27.4       26.1       90.85    2500     54.6±2.0   99.0±0.31   27.8±0.7  27.0±0.2  91.8±2.0
45  43060    52.7±3.1    99.0±0.39   26.5±1.63 25.6±1.5  90.3±2.3
从表3可知，本工艺经受生产的考验，说明本工艺是稳定的，其回收率及纯度都优于传统工艺。

Claims (5)

1.一种改良低温乙醇人血白蛋白生产工艺，本发明的特征在于：用去冷沉淀血浆为原料，首先分离出组分I+II+III，再分离出组分III，得到的组分IV上清液经深滤后再分离出组分V，组分V沉淀经12％乙醇纯化获得精制白蛋白。
2、根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：分离出组分I+II+III的工艺条件为：用去冷沉淀血浆为原料，加1倍生理盐水稀释，调PH值至6.8±0.1，加95％乙醇调整乙醇浓度至20％，控制温度至-4±0.5℃，离子强度0.12，蛋白浓度2.5％。
3、根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：分离出组分IV的工艺条件为：用组分I+II+III上清液调整PH值6.2-6.3，乙醇浓度40％，温度-4±0.5℃，离子强度0.09 ，蛋白质1.25％。
4、根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，分离出组分V的工艺条件为：用组分IV上清液降温至-9-10℃，加入硅藻土(0.25％)深层过滤，把滤液调整至PH4.8±0.1，乙醇42％，再降温至-10--12℃，控制离子强度0.10，蛋白质0.85％。
5、根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，纯化组分V的工艺条件为：把组分V沉淀用6倍冰水溶解、调整乙醇浓度至12％，控制PH4.5-4.7，温度-2--3℃，蛋白质3％，离子强度0.10，硅藻土(0.25％)静置2小时后深滤，其滤液调整PH至6.6-6.8，透析，浓缩。
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