CN102311497A - 一种用低温乙醇法从组份ⅳ沉淀中回收白蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用低温乙醇法从组份Ⅳ沉淀中提起回收白蛋白的方法。现有技术回收率不高。本发明采用的技术方案至少包含以下步骤：（1）Ⅳ沉淀热处理，（2）FⅢ沉淀的制备，（3）FⅢ上清液的制备，（4）Ⅴ沉淀的制备（5）除杂（6）白蛋白制品的制备。本发明有效提高了白蛋白的总收得率，降低了生产成本，提高了企业利润；在分离过程中按各组份分步沉淀，并采用离子交换层析进行纯化，生产工艺更加精细，提高了制品的质量。
Description
技术领域
本发明属于血液制品技术领域，涉及一种用低温乙醇法从组份Ⅳ沉淀中提起回收白蛋白的方法。
背景技术
从血浆中提取白蛋白的分离提取工艺目前国内外主要采用基于Cohn6法的低温乙醇法来进行，该方法是根据血浆蛋白理化性质的差别，加入不同浓度的盐和有机溶剂，通过改变影响蛋白质稳定性的条件而分别沉淀提取出不同的蛋白质。
在低温乙醇法中影响蛋白质沉淀反应的因素主要有5个，即pH值、温度、蛋白浓度、离子强度、乙醇浓度。通过控制这些参数可以逐级沉淀血浆中的不同蛋白质成份，一般先从血浆中沉淀出组份Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，然后沉淀出组份Ⅳ，最终从组份Ⅴ中获得白蛋白制品。
然而分级沉淀过程中往往伴随着白蛋白的大量损失，其中夹杂白蛋白最多的就是组份Ⅳ沉淀，因此从组份Ⅳ中回收白蛋白是提高白蛋白提取率的重要措施。现有的从组分Ⅳ回收白蛋白一般采用低温乙醇法，在低温下以乙醇为溶剂利用白蛋白与其它杂蛋白结晶条件的不同而将白蛋白分离出来。该方法的主要问题是回收率不高，一般白蛋白回收率在0.4~1.0千克/吨血浆之间。
发明内容
本发明的目的是提供一种用低温乙醇法从组份Ⅳ沉淀回收白蛋白的方法，以解决现有技术中存在的白蛋白提取率不高的问题。
本发明所采用的技术方案是，
一种用低温乙醇法从组份Ⅳ沉淀回收白蛋白的方法，其特征在于：至少包含以下步骤：
（1）Ⅳ沉淀热处理
从冷库中取出组份Ⅳ沉淀，称重后置于洁净的不锈钢反应罐中，向反应罐中注入4～6倍体积的5℃以下的注射用水溶解沉淀，控制溶液温度在0～5℃搅拌待其完全溶解后，加入磷酸二氢钠至0.01mol/L，然后用氢氧化钠调节pH值至6.9±0.1，搅拌5～6小时，加入辛酸钠至0.025mol/L，继续搅拌至少2小时，之后将溶液加温至68.0±0.5℃，保温1～1.5小时后迅速降温至0～15℃；
（2）FⅢ沉淀的制备
将加温后的制品打入反应罐，用0.2 mol/L的盐酸调节pH值至4.5±0.05，缓慢加入95%（v/v）的乙醇，令反应液中乙醇体积浓度升至5～8%，
将制品加压过滤，得FⅢ沉淀和滤液，将滤液用注射用水超滤去除有机溶剂并浓缩至蛋白浓度≥18%；
（3）FⅢ上清液的制备
所得FⅢ沉淀用800～1000升温度在5℃以下的注射用水溶解，搅拌令其完全溶解后加入氯化钠至8～9g/L和枸橼酸钠2～3g/L，将溶解液与上述滤液混合，添加氯化钠至7±0.5g/L，枸橼酸钠4±0.5g/L；用氢氧化钠调节pH5.25±0.05，缓慢添加体积分数为95%的乙醇至体积浓度20%，同时降温至-4.5±0.5℃，压滤去除FⅢ沉淀，得FⅢ上清液；
（4）Ⅴ沉淀的制备
用0.2 mol/L的氢氧化钠调节FⅢ上清至pH6.3±0.1，保持温度在-4.5±0.5℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度38%；
压滤后得FⅢ-1上清滤液，调节pH为5.75±0.05，降温至-5.5±0.5℃，并添加乙醇至浓度40%；
将FⅢ-1上清滤液压滤后得FⅢ-2上清滤液，调节pH至4.80±0.05，继续降温至-8.0±0.1℃，压滤后获得组份Ⅴ沉淀；
（5）除杂
将组份Ⅴ沉淀用6～7倍体积的注射用水溶解，调pH至4.6±0.1，保持温度在-3～-2℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度12～14%，将溶液经深层过滤去除杂质，再调节滤过液pH值至5.20±0.05，经离子交换层析去除溶液中的杂蛋白，流出液用1mol/L的碳酸氢钠调节pH7.1±0.1，添加氯化钠至9±0.1g/L；
（6）白蛋白制品的制备
将蛋白质溶液进行超滤至蛋白质浓度≥18%，获得白蛋白制品溶液，经病毒灭活和除菌分装后获得白蛋白制品。
上述第（1）步中氢氧化钠浓度为0.1mol/L。氢氧化钠浓度太高会使白蛋白变性，太低需要加入的体积量大，不易控制。
本发明的有益效果是：
本发明采用白蛋白提取过程中产生的组份Ⅳ沉淀，通过调节蛋白质溶液的pH值、温度、蛋白浓度、离子强度、乙醇浓度，经热处理和分步压滤分离技术，有效回收了残留在组份Ⅳ沉淀中的白蛋白成份，使每吨血浆原料白蛋白的提取量增加了1.5～2.0千克。该发明有效提高了白蛋白的总收得率，降低了生产成本，提高了企业利润；在分离过程中按各组份分步沉淀，并采用离子交换层析进行纯化，生产工艺更加精细，提高了制品的质量。
具体实施方式
下面结合用具体实施方式对本发明进行详细说明。
实施例1：
（1）Ⅳ沉淀热处理
从冷库中取出组份Ⅳ沉淀，称重后置于洁净的不锈钢反应罐中，向反应罐中注入4倍体积的5℃以下的注射用水溶解沉淀，控制溶液温度在0℃搅拌待其完全溶解后，加入磷酸二氢钠至0.01mol/L，然后用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH值至6.8，搅拌5小时，加入辛酸钠至0.025mol/L，继续搅拌至少2小时，之后将溶液加温至68.5℃，保温1小时后迅速降温至0℃；
（2）FⅢ沉淀的制备
将加温后的制品打入反应罐，。用0.2 mol/L的盐酸调节pH值至4.45，缓慢加入95%（v/v）的乙醇，令反应液中乙醇体积浓度升至5%，将制品加压过滤，得FⅢ沉淀和滤液，将滤液用注射用水超滤去除有机溶剂并浓缩至蛋白浓度≥18%；
（3）FⅢ上清液的制备
所得FⅢ沉淀用800升温度在5℃以下的注射用水溶解，搅拌令其完全溶解后加入氯化钠至8g/L和枸橼酸钠2g/L，将溶解液与上述滤液混合，添加氯化钠至6.5g/L，枸橼酸钠3.5g/L；用氢氧化钠调节pH至5.20，缓慢添加体积分数为95%的乙醇至体积浓度20%，同时降温至-5℃，压滤去除FⅢ沉淀，得FⅢ上清液；
（4）Ⅴ沉淀的制备
用0.2 mol/L的氢氧化钠调节FⅢ上清至pH6.2，保持温度在-5℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度为38%；
压滤后得FⅢ-1上清滤液，调节pH为5.70，降温至-6℃，并添加乙醇至体积浓度40%；
将FⅢ-1上清滤液压滤后得FⅢ-2上清滤液，调节pH至4.75，继续降温至-8.1℃，压滤后获得组份Ⅴ沉淀；
（5）除杂
将组份Ⅴ沉淀用6倍体积的注射用水溶解，调pH至4.5，保持温度在-3℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度12%，将溶液经深层过滤去除杂质，再调节滤过液pH值至5.15，经离子交换层析去除溶液中的杂蛋白，流出液用1mol/L的碳酸氢钠调节pH7.0，添加氯化钠至8.9g/L；
（6）白蛋白制品的制备
将蛋白质溶液进行超滤至蛋白质浓度≥18%，获得白蛋白制品溶液，经病毒灭活和除菌分装后获得白蛋白制品。
实施例2：
（1）Ⅳ沉淀热处理
从冷库中取出组份Ⅳ沉淀，称重后置于洁净的不锈钢反应罐中，向反应罐中注入6倍体积的5℃以下的注射用水溶解沉淀，控制溶液温度在5℃搅拌待其完全溶解后，加入磷酸二氢钠至0.01mol/L，然后用氢氧化钠调节pH值至7.0，搅拌6小时，加入辛酸钠至0.025mol/L，继续搅拌至少2小时，之后将溶液加温至68.5℃，保温1.5小时后迅速降温至15℃；
（2）FⅢ沉淀的制备
将加温后的制品打入反应罐，用0.2 mol/L的盐酸调节pH值至4.55，缓慢加入95%（v/v）的乙醇，令反应液中乙醇体积浓度升至8%，将制品加压过滤，得FⅢ沉淀和滤液，将滤液用注射用水超滤去除有机溶剂并浓缩至蛋白浓度≥18%；
（3）FⅢ上清液的制备
所得FⅢ沉淀用1000升温度在5℃以下的注射用水溶解，搅拌令其完全溶解后加入氯化钠至9g/L和枸橼酸钠3g/L，将溶解液与上述滤液混合，添加氯化钠至7.5g/L，枸橼酸钠4.5g/L；用氢氧化钠调节pH5.3，缓慢添加体积分数为95%的乙醇至体积浓度20%，同时降温至-4℃，压滤去除FⅢ沉淀，得FⅢ上清液；
（4）Ⅴ沉淀的制备
用0.2 mol/L的氢氧化钠调节FⅢ上清至pH6.4，保持温度在-4℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度38%；
压滤后得FⅢ-1上清滤液，调节pH为5.8，降温至-5℃，并添加乙醇至浓度40%；
将FⅢ-1上清滤液压滤后得FⅢ-2上清滤液，调节pH至4.85，继续降温至-7.9℃，压滤后获得组份Ⅴ沉淀；
（5）除杂
将组份Ⅴ沉淀用7倍体积的注射用水溶解，调pH至4.7，保持温度在-2℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度14%，将溶液经深层过滤去除杂质，再调节滤过液pH值至5.25，经离子交换层析去除溶液中的杂蛋白，流出液用1mol/L的碳酸氢钠调节pH7.2，添加氯化钠至9.1g/L；
（6）白蛋白制品的制备
将蛋白质溶液进行超滤至蛋白质浓度≥18%，获得白蛋白制品溶液，经病毒灭活和除菌分装后获得白蛋白制品。
实施例3：
（1）Ⅳ沉淀热处理
从冷库中取出组份Ⅳ沉淀，称重后置于洁净的不锈钢反应罐中，向反应罐中注入5倍体积的5℃以下的注射用水溶解沉淀，控制溶液温度在3℃搅拌待其完全溶解后，加入磷酸二氢钠至0.01mol/L，然后用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH值至6.9，搅拌5.5小时，加入辛酸钠至0.025mol/L，继续搅拌3小时，之后将溶液加温至68.0℃，保温1.2小时后迅速降温至8℃；
（2）FⅢ沉淀的制备
将加温后的制品打入反应罐，用0.2 mol/L的盐酸调节pH值至4.5，缓慢加入95%（v/v）的乙醇，令反应液中乙醇体积浓度升至6%，将制品加压过滤，得FⅢ沉淀和滤液，将滤液用注射用水超滤去除有机溶剂并浓缩至蛋白浓度≥18%；
（3）FⅢ上清液的制备
所得FⅢ沉淀用900升温度在5℃以下的注射用水溶解，搅拌令其完全溶解后加入氯化钠至8.5g/L和枸橼酸钠2.5g/L，将溶解液与上述滤液混合，添加氯化钠至7g/L，枸橼酸钠4g/L；用氢氧化钠调节pH5.25，缓慢添加体积分数为95%的乙醇至体积浓度20%，同时降温至-4.5℃，压滤去除FⅢ沉淀，得FⅢ上清液；
（4）Ⅴ沉淀的制备
用0.2 mol/L的氢氧化钠调节FⅢ上清至pH6.3，保持温度在-4.5℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度38%；
压滤后得FⅢ-1上清滤液，调节pH为5.75，降温至-5.5℃，并添加乙醇至浓度40%；
将FⅢ-1上清滤液压滤后得FⅢ-2上清滤液，调节pH至4.80，继续降温至-8.0℃，压滤后获得组份Ⅴ沉淀；
（5）除杂
将组份Ⅴ沉淀用6～7倍体积的注射用水溶解，调pH至4.6，保持温度在-2.5℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度13%，将溶液经深层过滤去除杂质，再调节滤过液pH值至5.20，经离子交换层析去除溶液中的杂蛋白，流出液用1mol/L的碳酸氢钠调节pH7.1，添加氯化钠至9g/L；
（6）白蛋白制品的制备
将蛋白质溶液进行超滤至蛋白质浓度≥18%，获得白蛋白制品溶液，经病毒灭活和除菌分装后获得白蛋白制品。
本发明通过调节蛋白质溶液的pH值、温度、蛋白浓度、离子强度、乙醇浓度，经热处理和分步压滤分离技术，有效回收了残留在组份Ⅳ沉淀中的白蛋白成份，使每吨血浆原料白蛋白的提取量增加了1.5～2.0千克。该发明有效提高了白蛋白的总收得率，降低了生产成本，提高了企业利润；在分离过程中按各组份分步沉淀，并采用离子交换层析进行纯化，生产工艺更加精细，提高了制品的质量。
Claims (2)
1.一种用低温乙醇法从组份Ⅳ沉淀回收白蛋白的方法，其特征在于：至少包含以下步骤：
（1）Ⅳ沉淀热处理
从冷库中取出组份Ⅳ沉淀，称重后置于洁净的不锈钢反应罐中，向反应罐中注入4～6倍体积的5℃以下的注射用水溶解沉淀，控制溶液温度在0～5℃搅拌待其完全溶解后，加入磷酸二氢钠至0.01mol/L，然后用氢氧化钠调节pH值至6.9±0.1，搅拌5～6小时，加入辛酸钠至0.025mol/L，继续搅拌至少2小时，之后将溶液加温至68.0±0.5℃，保温1～1.5小时后迅速降温至0～15℃；
（2）FⅢ沉淀的制备
将加温后的制品打入反应罐，用0.2 mol/L的盐酸调节pH值至4.5±0.05，缓慢加入95%（v/v）的乙醇，令反应液中乙醇体积浓度升至5～8%，
将制品加压过滤，得FⅢ沉淀和滤液，将滤液用注射用水超滤去除有机溶剂并浓缩至蛋白浓度≥18%；
（3）FⅢ上清液的制备
所得FⅢ沉淀用800～1000升温度在5℃以下的注射用水溶解，搅拌令其完全溶解后加入氯化钠至8～9g/L和枸橼酸钠2～3g/L，将溶解液与上述滤液混合，添加氯化钠至7±0.5g/L，枸橼酸钠4±0.5g/L；用氢氧化钠调节pH5.25±0.05，缓慢添加体积分数为95%的乙醇至体积浓度20%，同时降温至-4.5±0.5℃，压滤去除FⅢ沉淀，得FⅢ上清液；
（5）Ⅴ沉淀的制备
用0.2 mol/L的氢氧化钠调节FⅢ上清至pH6.3±0.1，保持温度在-4.5±0.5℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度38%；
压滤后得FⅢ-1上清滤液，调节pH为5.75±0.05，降温至-5.5±0.5℃，并添加乙醇至浓度40%；
将FⅢ-1上清滤液压滤后得FⅢ-2上清滤液，调节pH至4.80±0.05，继续降温至-8.0±0.1℃，压滤后获得组份Ⅴ沉淀；
（6）除杂
将组份Ⅴ沉淀用6～7倍体积的注射用水溶解，调pH至4.6±0.1，保持温度在-3～-2℃，缓慢添加乙醇至乙醇体积浓度12～14%，将溶液经深层过滤去除杂质，再调节滤过液pH值至5.20±0.05，经离子交换层析去除溶液中的杂蛋白，流出液用1mol/L的碳酸氢钠调节pH7.1±0.1，添加氯化钠至9±0.1g/L；
（8）白蛋白制品的制备
将蛋白质溶液进行超滤至蛋白质浓度≥18%，获得白蛋白制品溶液，经病毒灭活和除菌分装后获得白蛋白制品。
2.根据权利要求1所述的一种用低温乙醇法从组份Ⅳ沉淀回收白蛋白的方法，其特征在于：所述第（1）步中氢氧化钠浓度为0.1mol/L。
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