JP2007518409A - 新規なキャノーラタンパク質単離物 - Google Patents

Abstract

大部分が２Ｓキャノーラタンパク質からなり、溶解特性が改善されている新規なキャノーラタンパク質単離物は、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しており、かつ７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している。新規なキャノーラタンパク質単離物は、キャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿による上澄み水溶液の加熱処理によって生成させて、７Ｓタンパク質の沈殿をもたらし、この７Ｓタンパクを沈降させ除去する。

Description

（発明の分野）
本発明はキャノーラタンパク質単離物の製造に関する。

（発明の背景）
少なくとも１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラ油糧種子タンパク質単離物は、本譲受人に譲渡されている同時係属の２００２年５月３日出願の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（ＷＯ０２／０８９５９７）（その開示を参照により本明細書に組み込む）に記載の方法によって油糧種子粗粉から生成させることができる。この手順は、塩溶液を用いてキャノーラ油糧種子粗粉を抽出するステップと、得られたタンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、選択的膜技術を用いて、水溶液のタンパク質濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大させ、同時に、イオン強度を実質的に一定に保持するステップと、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水中に希釈してタンパク質ミセルの生成をもたらすステップと、タンパク質のミセルを沈降させて無定形の、付着性のある、ゼラチン状のグルテン様タンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を形成させるステップと、少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）を有するタンパク質含量を有する上澄み液からタンパク質ミセルの集団を回収するステップとを含む複数のステップのプロセスを含む。本明細書で用いるタンパク質含量は乾燥重量ベースで測定したものである。回収したＰＭＭは乾燥することができる。

本方法の一実施形態では、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄み液を処理してキャノーラタンパク質単離物を上澄み液から回収する。この手順は、最初に限外濾過膜を用いて上澄み液を濃縮し、濃縮物を乾燥することによって行うことができる。得られるキャノーラタンパク質単離物は少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する。

米国特許出願第１０／１３７，３９１号に記載の手順は基本的には回分方式による手順である。本譲受人に譲渡されている同時係属の２００２年１１月１９日出願の米国特許出願第１０／２９８，６７８号（ＷＯ０３／０４３４３９）（その開示を参照により本明細書に組み込む）では、キャノーラタンパク質単離物を作製するための連続プロセスが記載されている。これによると、キャノーラ油糧種子粗粉を塩溶液と連続的に混合し、その混合物をパイプを通して輸送し、その間にキャノーラ油糧種子粗粉からタンパク質を抽出してタンパク質水溶液を生成させ、そのタンパク質水溶液を選択的膜操作によって連続的に輸送して、イオン強度を実質的に一定に保持しながらタンパク質水溶液のタンパク質含量を少なくとも約５０ｇ／Ｌに増大させ、得られた濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルの生成をもたらし、そのタンパク質ミセルを連続的に沈降させ、同時に、沈降容器に所望の量のＰＭＭが蓄積されるまで、上澄み液を連続的にオーバーフローさせる。沈降容器からＰＭＭを回収し、これを乾燥することができる。ＰＭＭは少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有する。オーバーフローした上澄み液を処理して、上記のように、それからキャノーラタンパク質単離物を回収することができる。

キャノーラ種子は約１０〜約３０重量％のタンパク質を含むことが知られており、いくつかの異なるタンパク質成分が特定されている。これらのタンパク質には、クルシフェリンとして知られている１２Ｓグロブリン、７Ｓタンパク質およびナピンとして知られている２Ｓ貯蔵タンパク質が含まれる。本譲受人に譲渡されている同時係属の２００３年４月１５日出願の米国特許出願第１０／４１３，３７１号（ＷＯ０３／０８８７６０）（その開示を参照により本明細書に組み込む）に記載のように、濃縮タンパク質水溶液を希釈してＰＭＭを生成し、上澄み液を処理して追加のタンパク質を回収することを含む上記手順によって、異なるタンパク質プロファイルの単離物の回収がもたらされる。

この関連で、ＰＭＭ誘導のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９８重量％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５重量％の２Ｓタンパク質からなるタンパク質成分含量を有する。上澄み液誘導のキャノーラタンパク質単離物は、約６０〜約９５重量％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０重量％の７Ｓタンパク質および０〜約５重量％の１２Ｓタンパク質からなるタンパク質成分含量を有する。したがって、ＰＭＭ誘導のキャノーラタンパク質単離物は大部分７Ｓタンパク質であり、上澄み液誘導のキャノーラタンパク質単離物は大部分が２Ｓタンパク質である。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載のように、２Ｓタンパク質は約１４，０００ダルトンの分子サイズを有し、７Ｓタンパク質は約１４５，０００ダルトンの分子質量を有し、１２Ｓタンパク質は約２９０，０００ダルトンの分子サイズを有する。

キャノーラは菜種または菜種油としても知られている。

（発明の概要）
驚くべきことに、２Ｓタンパク質の割合が増大している、好ましくは少なくとも約８５重量％の２Ｓタンパク質を含み、７Ｓタンパク質の割合が減少している新規なキャノーラタンパク質単離物は、上記米国特許出願第１０／１３７，３９１号の手順にしたがって調製された上澄み液誘導のキャノーラタンパク質単離物に対して、水溶液中で優れた特性を示すことがわかった。

様々なｐＨ値で溶解性が改善されていることに加えて、本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、ソフトドリンクに溶液透明度の向上をもたらすことができ、透明なタンパク質を強化したソフトドリンクを提供することができる。

したがって、本発明の一態様では、大部分が２Ｓキャノーラタンパク質からなり、かつキャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿による上澄み水溶液から得られるキャノーラタンパク質単離物と比較して、乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しており、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している大部分が２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供する。

本発明の別の態様では、乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％(Ｎ×６．２５)のタンパク質含量を有し、単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質および約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含むキャノーラタンパク質単離物を提供する。

濃縮された上澄み液中の７Ｓタンパク質の割合を低減させ、したがって２Ｓタンパク質の割合を増大させるために、新規なキャノーラタンパク質単離物を、米国特許出願第１０／１３７，３９１号の手順による、濃縮された上澄み液の熱処理によって調製することができる。したがって本発明の別の態様では、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しているキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、（ａ）大部分が２Ｓタンパク質からなる２Ｓタンパク質および７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、（ｂ）上記水溶液を加熱処理して７Ｓキャノーラタンパク質の沈殿をもたらすステップと、（ｃ）上記水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を沈殿するステップと、（ｄ）少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しているキャノーラタンパク質単離物を回収するステップとを含む方法を提供する。

あるいは、新規なキャノーラタンパク質単離物は、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出に続いて、そのタンパク質溶液を、２Ｓタンパク質を膜を通して透過液で通過させ、同時に７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を残留液中に保持する分子量カットオフを有する膜での第１の選択的膜ステップにかける手順によって調製することができる。次いで、残留液を乾燥して、大部分が７Ｓタンパク質である第１のキャノーラタンパク質単離物を提供する。次いで、第１の選択的膜プロセスのステップからの透過液を、２Ｓタンパク質を保持し、塩、フェノール類および抗栄養物質を含む低分子量汚染物質を通過させる分子量カットオフを有する膜での第２の選択的膜ステップにかける。次いで後者の選択的膜ステップからの残留液を乾燥して大部分が２Ｓタンパク質であり、新規なタンパク質単離物である第２のキャノーラタンパク質単離物を提供する。

したがって、本発明の追加の態様では、キャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、（ａ）キャノーラ油糧種子粗粉から得られ、１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓキャノーラタンパク質を含むキャノーラタンパク質水溶液を用意するステップと、（ｂ）７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を残留液中に保持し、２Ｓタンパク質を透過液として膜通過させるのに効果的な選択的膜技術を用いて水溶液のタンパク質濃度を増大させて、濃縮タンパク質溶液を提供するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）からの残留液を乾燥させて、大部分が７Ｓキャノーラタンパク質からなり、乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を提供するステップと、（ｄ）２Ｓキャノーラタンパク質を残留液中に保持し、低分子量汚染物質を、透過液として膜通過させるのに効果的な選択的膜技術を用いて、ステップ（ａ）からの透過液の濃度を増大させるステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）からの残留液を乾燥させて、大部分が２Ｓタンパク質からなり、少なくとも約９０重量％(Ｎ×６．２５)ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を提供するステップとを含む方法を提供する。

（図面の簡単な説明）
図１はタンパク質ミセルプロセス上に載せた本発明の一実施形態によるタンパク質溶液回収プロセスの概略を示す図である。

（本発明の概略説明）
本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％(Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有し、回分プロセスまたは連続プロセスまたは半連続プロセスによってキャノーラ油糧種子粗粉から単離することができる。

本明細書で提供する新規なキャノーラタンパク質単離物は、大部分が２Ｓタンパク質からなり、かつキャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿によって上澄み液から得られ、調製の同一実験条件下で調製されるキャノーラタンパク質単離物と比較して、大部分が２Ｓタンパク質からなり、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しており、７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している。

新規なキャノーラタンパク質単離物は、少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質と約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質、好ましくは少なくとも約９０重量％の２Ｓキャノーラタンパク質と約１０重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含み、より好ましくはできるだけ高い割合の２Ｓタンパク質を含む。上記のように、そうしたキャノーラタンパク質単離物は濃縮された上澄み液の加熱処理によって得ることができ、以下により詳細に述べる。濃縮された上澄み液の加熱処理によって７Ｓタンパク質の沈殿がもたらされ、これを、遠心分離などの任意の好都合な手段によって、加熱処理した上澄み液から除去することができる。２Ｓタンパク質は加熱処理の影響を受けることはなく、したがって、加熱処理は、７Ｓタンパク質の割合を低減させることによって、存在する２Ｓタンパク質の割合を増大させる。

新規キャノーラタンパク質単離物は広い範囲のｐＨ値にわたって水溶液中に可溶性であり、一般に、大部分が２Ｓタンパク質からなり、かつ調製の同一実験条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿による上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物より高い溶解性を有している。さらに、市販されているものなどの炭酸ソフトドリンクを含むソフトドリンク中の新規キャノーラタンパク質単離物の水溶液は、大部分が２Ｓタンパク質からなり、かつ調製の同一実験条件下でのキャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿による上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物から作製されるそうした水溶液より高い透明度を有している。

ソフトドリンク中の溶液を含む水溶液中のキャノーラタンパク質単離物の濃度は、対象とする溶液の使用に応じて変えることができる。一般に、タンパク質濃度は約０．１〜約３０重量％、好ましくは約１〜約５重量％の範囲である。

キャノーラタンパク質単離物を提供するプロセスの最初のステップは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質材料を可溶化させることを含む。キャノーラ種子粗粉から回収されたタンパク質材料はキャノーラ種子中に天然に由来するタンパク質であってよく、あるいは、そのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改変されてはいるが、天然タンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性は保有しているタンパク質であってよい。キャノーラ粗粉は、様々なレベルの非変性タンパク質を有するキャノーラ油糧種子からのキャノーラオイルの除去によって得られた、例えば、熱ヘキサン抽出または冷オイル押出法によって得られた任意のキャノーラ粗粉であってよい。キャノーラ油糧種子からのキャノーラオイルの除去は、通常、本明細書で述べるタンパク質単離物回収手順とは別個の操作として行われる。

塩の存在は油糧種子粗粉からの可溶性タンパク質の除去を増進させるので、タンパク質可溶化は、食品グレードの塩溶液を用いることによって最も効果的に行われる。キャノーラタンパク質単離物を食品以外に使用しようとする場合、非食品グレードの化学品を使用することができる。塩は通常塩化ナトリウムであるが、塩化カリウムなどの他の塩も使用することができる。相当量のタンパク質の可溶化を実施可能にするために、塩溶液は、少なくとも約０．０５、好ましくは少なくとも約０．１０のイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増大するにしたがって、油糧種子粗粉中のタンパク質の可溶化の程度は最初増大し、次いで最大値に達する。その後、イオン強度がどんなに増加しても、可溶化タンパク質全体を増大させることはない。最大のタンパク質可溶化をもたらす食品グレード塩溶液のイオン強度は、当該の塩および選択された油糧種子粗粉に応じて変わる。

イオン強度が増大すると、タンパク質の沈殿のために、より高い希釈度が求められることを考慮して、通常約０．８未満のイオン強度値、より好ましくは約０．１〜約０．１５の値を用いることが好ましい。

回分プロセスでは、タンパク質の塩可溶化を、少なくとも約５℃、好ましくは最大で約３５℃の温度で、可溶化時間を短縮するために（通常約１０〜約６０分間である）好ましくは撹拌を伴って実施する。全体としての高い製造収率を得るために、油糧種子粗粉から実質的にできるだけ多くのタンパク質を抽出するように可溶化を実施することが好ましい。

それより低いと可溶化が実際的ではないほど遅くなるので、温度の下限は約５℃を選択し、他方、回分様式ではそれより高くなるとプロセスが非経済的になるので、温度の上限は約３５℃を選択する。

連続プロセスでは、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出は、キャノーラ油糧種子粗粉からのタンパク質の連続的抽出を行うのに合致した任意の方式で実施する。一実施形態では、キャノーラ油糧種子粗粉を食品グレード塩溶液と連続的に混合し、ある長さを有するパイプまたは導管を通して、本明細書で述べるパラメータによる所望の抽出を行うのに十分な滞留時間をもたらす流速でその混合物を輸送する。そうした連続的手順では、塩可溶化ステップを、好ましくは、実質的にできるだけ多くのタンパク質をキャノーラ油糧種子から抽出するように可溶化を行うために、迅速に、最大で約１０分の時間で実施する。連続的手順での可溶化は、高温で、好ましくは少なくとも約３５℃、一般に約６５℃またはそれ以上で実施することが好ましい。

食品グレードの塩水溶液は、一般に約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２のｐＨを有し、塩溶液のｐＨは、抽出ステップで使用するために、必要に応じて好都合な任意の酸、通常塩酸、あるいはアルカリ、通常水酸化ナトリウムを用いて約５〜約６．８の範囲内の任意の所望の値に調節することができる。

可溶化ステップの際の食品グレードの塩溶液中の油糧種子粗粉の濃度は広い範囲にわたる。典型的な濃度値は約５〜約１５％ｗ／ｖである。

塩水溶液を用いたタンパク質抽出ステップは、キャノーラ粗粉中に存在する可能性のある脂肪を可溶化させる追加の効果を有しており、したがって、それによって脂肪が水相中に存在する結果となる。

抽出ステップから得られたタンパク質溶液は、一般に約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。

塩水溶液は酸化防止剤を含むことができる。酸化防止剤は亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの好都合な任意の酸化防止剤でよい。用いる酸化防止剤の量は溶液の約０．０１〜約１重量％の範囲でよく、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、タンパク質溶液中でフェノール類の酸化を抑制する働きをする。

次いで、抽出ステップから得られた水相を、好都合な任意の方式で、例えば、デカンター型遠心分離機に続いて、ディスク型遠心分離および／または濾過を用いて残留粗粉を除去することによって、残留するキャノーラ粗粉から分離することができる。分離した残留粗粉を乾燥して処分することができる。

最終キャノーラタンパク質単離物の色は、粉末の活性炭または他の色素吸着剤を、分離したタンパク質水溶液と混合し、続いて吸着剤を、好都合には濾過で除去してタンパク質溶液を提供することによって、薄い色(light colour)でより淡い黄色(less intense yellow)に改善することができる。色素を除去するためにダイアフィルトレーションを用いることもできる。

そうした色素除去のステップは、一般に分離したタンパク質水溶液の周囲温度で、好都合な任意の条件下、適切な色素吸着剤を用いて実施することができる。粉末状活性炭は、約０．０２５％〜約５重量／容積％、好ましくは約０．０５％〜約２重量／容積％の量で使用する。

本譲受人に譲渡されている米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号（その開示を参照により本明細書に組み込む）に記載のように、キャノーラ種子粗粉が相当量の脂肪を含有する場合、分離したタンパク質水溶液および以下に述べる濃縮タンパク質水溶液に対して上記特許に記載の脱脂ステップを施すことができる。色を改善するステップを実施する場合、そのステップは第１の脱脂ステップの後に実施することができる。

塩水溶液を用いた油糧種子粗粉の抽出の代わりとして、水だけを用いて抽出を行うことができる。しかし、水だけの使用では塩水溶液の場合より油糧種子粗粉からのタンパク質の抽出がより少ない傾向にある。そうした代替法を用いる場合、以下に述べる濃縮ステップの間、タンパク質を溶液中に保持するために、残留油糧種子粗粉から分離した後に、先に論じた濃度で塩をタンパク質溶液に加えることができる。第１の脱脂除去ステップを行う場合、通常そうした操作が完了した後で塩を加える。

別の代替手順は、約６．８を超える比較的高いｐＨ値、一般に最大で約９．９で、食品グレードの塩溶液を用いて油糧種子粗粉を抽出するものである。水酸化ナトリウム水溶液などの好都合な任意の食品グレードアルカリを用いて、食品グレード塩溶液のｐＨを所望のアルカリ値にｐＨを調節することができる。あるいは、油糧種子粗粉を、約ｐＨ５未満の比較的低いｐＨ、一般に最小で約ｐＨ３で、塩溶液を用いて抽出することができる。そうした代替法を用いる場合、次いで、好都合な任意の方式で、例えば、デカンター型遠心分離機に続いてディスク型遠心分離および／または濾過を用いて残留粗粉を除去することによって、油糧種子粗粉抽出ステップから得られる水相を、残留するキャノーラ粗粉から分離する。分離した残留粗粉は乾燥して処分することができる。

次いで、その高ｐＨ抽出または低ｐＨ抽出のステップから得られたタンパク質水溶液を、以下で述べるさらなる処理にかける前に、先に論じた約５〜約６．８、好ましくは約５．３〜約６．２にｐＨ調節する。そうしたｐＨ調節は、任意の好都合な酸、例えば塩酸など、あるいは必要に応じて水酸化ナトリウムなどのアルカリを用いて行うことができる。

タンパク質水溶液は、新規なキャノーラタンパク質単離物を生成するように処理するために、７Ｓリッチなタンパク質ミセルの集団を沈殿させて上澄み液を残すか、あるいは、タンパク質水溶液を二膜操作によってタンパク質ミセルの集団を沈殿させることなく処理して新規なキャノーラタンパク質単離物を得るかによる２つの代替手順で処理することができる。

第１の代替手順では、タンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増大させ、同時にそのイオン強度を実質的に一定に保持する。そうした濃度は通常、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を提供するように実施する。

濃縮ステップは、例えば、異なる膜材料および構造を考慮して約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンなどの適切な分子量カットオフを有する中空繊維膜または螺旋巻型膜(spiral wound membrane)等の膜を用いた限外濾過またはダイアフィルトレーションなどの好都合な任意の選択的膜技術を用いるなどの回分操作または連続操作に合致した好都合な任意の方式で実施することができる。連続操作のためには、タンパク質水溶液が膜を通過する際に、所望の程度の濃度が可能になるような寸法にする。

次いで、濃縮タンパク質溶液を抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液を用いてダイアフィルトレーションステップにかけることができる。そうしたダイアフィルトレーションは、約２〜約２０容のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いて実施することができる。ダイアフィルトレーション操作において、膜を通して透過液を通過させてタンパク質水溶液からさらなる量の汚染物質を除去する。さらなる有意の量のフェノール類および目視できる色が透過液中に存在しなくなるまでダイアフィルトレーション操作行うことができる。そうしたダイアフィルトレーションは濃縮ステップ用と同一の膜を使用して実施することができる。しかし、望むなら、ダイアフィルトレーションステップは、異なる分子量カットオフを有する分離膜、例えば、異なる膜材料および構造を考慮して約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を使用して実施することができる。

ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤を存在させることができる。酸化防止剤は亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの好都合な任意の酸化防止剤でよい。ダイアフィルトレーション媒体中で使用する酸化防止剤の量は用いる材料に依存し、約０．０１〜約１重量％の範囲で変わり、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、濃縮されたキャノーラタンパク質単離物溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制する働きをする。

濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、好都合な任意の温度、一般に約２０℃〜約６０℃、好ましくは約２０〜約３０℃で、所望の程度の濃縮を行える時間で実施することができる。用いる温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うための膜装置および溶液の所望のタンパク質濃度の影響を受ける。

このステップでタンパク質溶液を、好ましい約２００ｇ／Ｌを超える濃度まで濃縮すると、乾燥タンパク質単離物として回収された抽出タンパク質の割合に関して、工程収率を約４０％超、好ましくは約８０％超のレベルに増大させるだけでなく、乾燥後の最終タンパク質単離物の塩濃度を低減させる。塩濃度の変動が特定の食品用途における機能特性および感覚特性に影響を及ぼす単離物の応用分野では、単離物の塩濃度を制御できる能力が重要である。

周知の通り、限外濾過および類似の選択的膜技術は、低分子量の種を通過させ同時により高分子量の種が通過するのを阻止する。低分子量種には、食品グレード塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素および抗栄養要素などの供給材料から抽出された低分子量材料、ならびに任意の低分子量形態のタンパク質も含まれる。膜の分子量カットオフは通常、相当な割合のタンパク質を溶液中に確実に保持し、同時に汚染物質を通過させるように異なる膜材料および構造を考慮して選択される。

濃縮され、場合によりダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液は、必要に応じ、米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載のようにしてさらなる脱脂操作にかけることができる。

濃縮され、場合によりダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液を、上記の色除去操作の代替法としての色除去操作にかけることができる。本明細書では、粉末状活性炭も顆粒状活性炭（ＧＡＣ）と同様に使用することができる。色吸収剤として使用できる他の材料はポリビニルピロリドンである。

色吸収剤処理ステップは、好都合な任意の条件下、一般にキャノーラタンパク質溶液の周囲温度で実施することができる。粉末状活性炭は、約０．０２５％〜約５重量／容積％、好ましくは約０．０５％〜約２重量／容積％の量を使用することができる。色吸収剤としてポリビニルピロリドンを使用する場合、約０．５％〜約５重量／容積％、好ましくは約２％〜約３重量／容積％の量を使用することができる。色吸収剤は濾過などの好都合な任意の手段でキャノーラタンパク質溶液から除去することができる。

貯蔵またはそれ以外の結果、元の粗粉中に存在しており、かつ、抽出ステップでその粗粉からキャノーラタンパク質単離物溶液中へ抽出された可能性のあるバクテリアを殺すために、任意選択の色除去ステップから得られた濃縮され、任意選択でダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液に低温殺菌を施すことができる。そうした低温殺菌は所望の任意の低温殺菌条件下で実施することができる。一般に、濃縮され、任意選択でダイアフィルトレーションされたタンパク質溶液を、約５５℃〜約７０℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃の温度で、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に述べるさらなる処理のために、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に冷却することができる。

濃縮ステップおよび任意選択のダイアフィルトレーションステップで用いた温度と、低温殺菌ステップを行ったかどうかとに応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０℃、最大で約６０℃、好ましくは約２５℃〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を低下させて、続く希釈ステップおよびミセル生成の遂行を容易にすることができる。濃縮タンパク質溶液は、それを超えると冷水で希釈してもミセル生成が起こらないような温度以上に加熱すべきではない。

次いで、濃縮ステップ、ならびに任意選択のダイアフィルトレーションステップ、任意選択の色除去ステップ、任意選択の低温殺菌ステップおよび任意選択の脱脂ステップから得られた濃縮タンパク質溶液を、濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を達成するのに必要な容積を有する冷水と混合することによって、希釈してミセルを生成させる。ミセル経路で得ようとするキャノーラタンパク質の割合、および上澄み液からの割合に応じて、濃縮タンパク質溶液の希釈度を変えることができる。より高い希釈レベルでは、一般に、より高い割合のキャノーラタンパク質が水相に残留する。

ミセル経路によって、最も高い割合のタンパク質を望む場合、濃縮タンパク質溶液を約１５倍以下、好ましくは約１０倍以下で希釈する。

濃縮タンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般に約３℃〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度を有する。その理由は、用いた希釈倍率では、このより冷たい温度で、タンパク質ミセルの集団の形態のタンパク質単離物が高い収率で得られるからである。

回分操作では、上記のように所望の容積を有する冷水の静止状の本体(static body)に、濃縮タンパク質溶液のバッチを加える。濃縮タンパク質溶液の希釈と、続くイオン強度の低下によって、ミセル状の離散したタンパク質液滴の形態の高度に会合したタンパク質分子の雲状の集団を生成する。回分式手順では、タンパク質ミセルが冷水の本体中で沈降して、凝集し、合体した密な無定形の付着性グルテン様タンパク質ミセルの集団（ＰＭＭ）が生成する。遠心分離などによって沈降を助けることができる。そうした誘発による沈降によってタンパク質ミセルの集団の液体含量が減少し、それによって水分含量を、一般に全ミセルの集団の約７０重量％〜約９５重量％から、一般に約５０重量％〜約８０重量％の値に減少させる。この仕方でミセルの集団の水分含量が減少すると、ミセルの集団の吸蔵塩含量、したがって乾燥単離物の塩含量も低下する。

あるいは、濃縮タンパク質溶液をＴ字形パイプの一方の入口に連続的に通過させ、同時に、希釈水をＴ字形パイプの他方の入口に供給してパイプ中で混合させることによって、希釈操作を連続的に行うことができる。希釈水は、濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な割合でＴ字形パイプ中に供給する。

濃縮タンパク質溶液と希釈水のパイプ内での混合によって、タンパク質ミセルの生成が開始され、混合物はＴ字形パイプの出口から沈降容器中へ連続的に供給され、満杯になったらそこから上澄み液をオーバーフローさせる。混合物は、液体の本体内の乱れを最少にする方式で、沈降容器中の液体の本体内に供給するのが好ましい。

連続的な手順では、タンパク質ミセルを沈降容器中で沈降させて、凝集し、合体した密な無定形の付着性グルテン様タンパク質ミセルの集団（ＰＭＭ）を形成させ、所望の量のＰＭＭが沈降容器の底部に蓄積されるまでこの手順を続行し、次いで蓄積されたＰＭＭを沈降容器から取り出す。沈殿による沈降の代りに、ＰＭＭを遠心分離で連続的に分離することができる。

タンパク質溶液を少なくとも約２００ｇ／Ｌの好ましいタンパク質含量へ濃縮させるプロセスパラメータの組合せと、約１５未満の希釈倍率の使用によって、上記米国特許で論じた既知の従来技術のいずれかのタンパク質単離物生成手順を用いて達成された場合より、元の粗粉抽出物からのタンパク質ミセルの集団の形態のタンパク質の回収に関してより高い収率、しばしば著しく高い収率がもたらされ、かつ、タンパク質含量に関して、ずっと高い純度の単離物がもたらされる。

回分プロセスと比べて、キャノーラタンパク質単離物の回収に連続プロセスを利用することによって、同一レベルのタンパク質抽出について、最初のタンパク質抽出ステップの時間が著しく短縮され、かつ、抽出ステップで相当高い温度を用いることが可能になる。さらに連続操作では、回分手順の場合より汚染の機会が少なくなり、それによってより高い製品品質が得られ、プロセスをより小型の装置で実施するようになる。

沈降した単離物は、例えば、沈降した集団からの残留水相のデカンテーションかまたは遠心分離によって、残留水相または上澄み液から分離する。ＰＭＭは、湿潤した形態で使用することも、また噴霧乾燥または凍結乾燥などの好都合な任意の技術で乾燥して乾燥形態で使用することもできる。乾燥ＰＭＭは、約９０重量％を上回るタンパク質、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（Ｋｊｅｌｄａｈｌ Ｎ×６．２５として計算して）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定で測定して）。必要に応じて米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を用いた場合、油脂種子粗粉から単離された乾燥ＰＭＭも低い残留脱脂含量を有する。それは約１重量％未満であってよい。

上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載されているように、ＰＭＭは大部分が、約６０〜９８重量％の７Ｓタンパク質、約１〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質および０〜約２５重量％の２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する７Ｓキャノーラタンパク質からなる。

ＰＭＭ生成および沈降ステップからの上澄み液は、希釈ステップで沈殿しなかった相当量のキャノーラタンパク質を含み、これを処理してキャノーラタンパク質単離物を回収する。上記米国特許出願第１０／４１３，３７１号に記載されているように、上澄み液から得られるキャノーラタンパク質単離物は大部分が、約６０〜約９５重量％の２Ｓタンパク質、約５〜約４０重量％の７Ｓタンパク質および０〜約５重量％の１２Ｓタンパク質のタンパク質成分含量を有する２Ｓキャノーラタンパク質からなる。

ＰＭＭの除去に続いて、希釈ステップからの上澄み液を濃縮してそのタンパク質濃度を増大させる。そうした濃縮は、タンパク質供給材料から抽出された塩および他の非タンパク質低分子量材料を含む低分子量種を膜通過させ、同時に、キャノーラタンパク質を溶液中に保持する適切な分子量カットオフを有する膜を用いる限外濾過などの好都合な任意の選択的膜技術を用いて実施する。異なる膜材料および構造を考慮して約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方法での上澄み液の濃縮によって、乾燥してタンパク質を回収するのに必要な液体の容積も低減される。上澄み液は一般に、乾燥の前に、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。そうした濃縮操作は、タンパク質溶液濃縮ステップについて上記したように、回分様式または連続操作で実施することができる。

次いで、濃縮された上澄み液を、水を用いてダイアフィルトレーションステップにかけることができる。そうしたダイアフィルトレーションは、約２〜約２０容のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いて実施することができる。ダイアフィルトレーション操作においては、透過液を膜通過させることによって、さらなる量の汚染物質が上澄み水溶液から除去される。ダイアフィルトレーション操作は、透過液中にそれ以上の有意の量のフェノール類および目視できる色が存在しなくなるまで行うことができる。そうしたダイアフィルトレーションは濃縮ステップ用と同じ膜を使用して行うことができる。しかし、所望により、ダイアフィルトレーションは、異なる膜材料および構造を考慮して約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜などの分離膜を用いて行うことができる。

ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在していてもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの好都合な任意の酸化防止剤でよい。ダイアフィルトレーション媒体中で用いる酸化防止剤の量は用いる材料に依存し、約０．０１〜約１重量％の範囲でよく、好ましくは約０．０５重量％である。酸化防止剤は、濃縮されたキャノーラタンパク質単離物溶液中に存在するフェノール類の酸化を抑制する働きをする。

本発明によれば、濃縮され、任意選択でダイアフィルトレーションされた上澄み液を加熱処理し、７Ｓタンパク質を沈殿させ除去することによって、溶液中に存在する７Ｓタンパク質の量を低減させ、それによって濃縮された上澄み液中に存在するキャノーラタンパク質中の２Ｓタンパク質の割合を増大させることができる。

そのような加熱処理は、濃縮された上澄み液中に存在する７Ｓの割合を低減させる、好ましくは７Ｓタンパク質の割合を相当な程度に低減させるのに十分な温度と時間のプロファイルを用いて実施することができる。一般に、加熱処理によって、上澄み液の７Ｓタンパク質含量を少なくとも約５０重量％、好ましくは少なくとも約７５重量％減少させる。一般に、加熱処理は、約７０℃〜約１００℃、好ましくは約７５〜約９５℃の温度で、約２〜約３０分間、好ましくは約５〜約１５分間実施することができる。沈殿した７Ｓタンパク質は遠心分離または濾過などの好都合な任意の方式で除去することができる。

分解した７Ｓタンパク質を遠心分離などによって除去した後、濃縮された加熱処理した上澄み液を、噴霧乾燥または凍結乾燥などの好都合な任意の技術で乾燥した形態に乾燥して、本発明によるキャノーラタンパク質単離物を提供することができる。そのような新規なキャノーラタンパク質単離物は、約９０重量％を上回る、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（Ｋｊｅｌｄａｈｌ Ｎ×６．２５として計算して）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定で測定して）。

そのような新規なキャノーラタンパク質単離物は、高い割合の２Ｓタンパク質、好ましくは単離物中のキャノーラタンパク質の少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも約９５重量％を含む。

新規なキャノーラタンパク質単離物を作製するための代替の手順では、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を残留液中に保持し、２Ｓタンパク質を膜通過させるのに十分な分子量カットオフを有する中空繊維膜または螺旋巻型膜などの膜を用いた第１の限外濾過ステップによって、キャノーラ油糧種子タンパク質粗粉の抽出によって作製されたタンパク質水溶液を濃縮してそのタンパク質濃度を増大させ、同時に、そのイオン強度を実質的に一定に保持する。膜のための適切な分子量カットオフ範囲は、約３０，０００〜約１５０，０００ダルトン、好ましくは約５０，０００〜約１００，０００ダルトンである。連続操作のためには、膜を、タンパク質水溶液が膜を通過する際に、所望の濃縮度になるような寸法にする。

第１の限外濾過ステップを、タンパク質水溶液を約４〜約２０倍にして、少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２００ｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮するように行うことができる。

次いで、濃縮タンパク質溶液を、抽出溶液と同じモル濃度とｐＨの塩水溶液を用いてダイアフィルトレーションステップにかけることが好ましい。濃縮されたキャノーラタンパク質単離物溶液中のフェノール類の酸化を抑制するために、ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤を存在させることができる。酸化防止剤は亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの好都合な任意の酸化防止剤でよい。ダイアフィルトレーション媒体中で用いる酸化防止剤の量は使用する材料に依存し、約０．０１〜約１重量％の範囲であり、好ましくは約０．０５重量％である。

ダイアフィルトレーションステップは、約２〜約２０容のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いて実施することができる。ダイアフィルトレーション操作の間に、他の低分子量成分と一緒に２Ｓタンパク質のフェノール類および目視できる色成分を、透過液を膜通過させることによって、濃縮タンパク質溶液から除去することができる。

ダイアフィルトレーションステップは、濃縮ステップに使用したものと同じ膜を用いて行うことができる。

濃縮ステップおよびダイアフィルトレーションステップは、好都合な任意の温度、一般に約２０℃〜約６０℃、好ましくは約３０℃未満で、所望の程度の濃縮および洗浄を実現する時間で実施することができる。用いる温度および他の条件は、ある程度、濃縮を行うために使用する膜装置と溶液の所望のタンパク質濃度に依存する。

第１の限外濾過ステップで使用する膜は、相当な割合の２Ｓタンパク質を、食品グレード塩のイオン種、炭水化物、フェノール類、色素および抗栄養要素を含む他の低分子量種と一緒に透過液中へ通過させる。分子量カットオフは、通常相当な割合の７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を残留液中に確実に保持し、同時に、２Ｓタンパク質および汚染物質を通過させるように異なる膜材料および構造を考慮して選択される。

次いで、濃縮ステップおよび任意選択のダイアフィルトレーションステップからの残留液を、噴霧乾燥または凍結乾燥などの好都合な任意の技術によって乾燥して乾燥形態にする。乾燥したタンパク質は、約９０重量％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００重量％タンパク質（Ｎ×６．２５）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定で測定して）。乾燥したタンパク質単離物は、大部分キャノーラ７Ｓタンパク質からなり、若干の１２Ｓタンパク質と可能的に少量の２Ｓタンパク質を有する。一般に、乾燥キャノーラタンパク質単離物は：
約６０〜約９５重量％の７Ｓタンパク質
約２〜約１５重量％の１２Ｓタンパク質
０〜約３０重量％の２Ｓタンパク質
を含む。

好ましくは、乾燥キャノーラタンパク質単離物は：
約７０〜約９０重量％の７Ｓタンパク質
約５〜約１０重量％の１２Ｓタンパク質
０〜約２０重量％の２Ｓタンパク質
を含む。

濃縮ステップおよび任意選択のダイアフィルトレーションステップからの透過液を、２Ｓタンパク質を保持するが、塩、フェノール類、色成分および抗栄養要素を含む低分子量種を膜通過させる適切な分子量カットオフを有する中空繊維膜または螺旋巻型膜などの膜を用いて第２の限外濾過ステップで濃縮する。異なる膜材料および構造を考慮して約３，０００〜約３０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。透過液は、一般に、乾燥する前に少なくとも約５０ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約４００ｇ／Ｌ、より好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮する。そうした濃縮操作は、上記タンパク質溶液濃縮ステップで述べたように、回分様式または連続操作で実施することができる。

濃縮された透過液を、水を用いてダイアフィルトレーションステップにかけることができる。濃縮された透過液中のフェノール類の酸化を抑制するために、ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部の間、ダイアフィルトレーション媒体中に酸化防止剤が存在してもよい。酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸などの好都合な任意の酸化防止剤でよい。ダイアフィルトレーション媒体中で使用する酸化防止剤の量は用いる材料に依存し、約０．０１〜約１重量％の範囲であり、好ましくは約０．０５重量％である。

ダイアフィルトレーションステップは、２〜２０容のダイアフィルトレーション溶液、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いて実施することができる。ダイアフィルトレーション操作では、フェノール類および目視できる色成分を含むさらなるの量の汚染物質を、ダイアフィルトレーション膜を通過させることによって、濃縮された透過液から除去する。さらに相当な量のフェノール類と目視できる色成分が透過液中に除去されなくなるまでダイアフィルトレーション操作を行うことができる。

ダイアフィルトレーションステップは、濃縮ステップで使用するものと同じ膜を用いて実施することができる。あるいは、異なる膜材料および構造を考慮して約３０００〜約５０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する分離膜を使用することができる。

濃縮され、任意選択でダイアフィルトレーションされた透過液は、噴霧乾燥または凍結乾燥などの好都合な任意の技術によって乾燥して、乾燥した形態にする。乾燥したタンパク質は、約９０重量％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定で測定して）。乾燥キャノーラタンパク質単離物は、大部分がキャノーラ２Ｓタンパク質からなり、７Ｓタンパク質は少量である。一般に、乾燥キャノーラタンパク質単離物は：
約８５〜約１００重量％の２Ｓタンパク質
０〜約１５重量％の７Ｓタンパク質、
好ましくは約９０〜約１００重量％の２Ｓタンパク質
０〜約１０重量％の７Ｓタンパク質
を含む。

所望により、第１の限外濾過ステップからの濃縮されたキャノーラタンパク質単離物の部分と、第２の限外濾過ステップからの濃縮された透過液の部分とを一緒にし、続いて一緒にしたストリームを好都合な任意の技術で乾燥して、一緒にしたキャノーラタンパク質単離組成物を提供することができる。一緒に混合されたタンパク質材料の相対的割合は、所望の２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓタンパク質プロファイルを有する生成キャノーラタンパク質単離組成物を提供するように選択することができる。あるいは、乾燥したタンパク質単離物を所望の任意の割合で一緒にして、混合物における所望の任意の特定の２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓタンパク質プロファイルを提供することができる。一緒にしたキャノーラタンパク質単離組成物は、約９０重量％を上回る、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５として計算して）の高いタンパク質含量を有し、実質的に変性していない（示差走査熱量測定で測定して）。

この方式で操作することによって、多くのキャノーラタンパク質単離物を、第１の限外濾過誘導のキャノーラタンパク質単離物と第２の限外濾過誘導のキャノーラタンパク質単離物との様々な重量割合、一般に重量で約５：９５〜約９５：５の乾燥混合物として回収することができる。これは、組成物中の異なる割合の２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓタンパク質を基にした異なる官能特性および栄養特性を得るために望ましいことである。

（好ましい実施形態の説明）
図１を参照すると、ミセル経路によるキャノーラタンパク質単離物（ＣＰＩ）の生成と比較して、本発明の一態様により提供される新規な二膜プロセスが示されている。

図から分かるように、限外濾過およびダイアフィルトレーションステップを含んでよい第１の限外濾過段階（限外濾過＃１）からの保持液(retentate)を、２つのうちの１つの方法で処理する。本発明の二膜プロセスでは、残留液を噴霧乾燥して大部分が７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供する。

上記米国特許出願第１０／１３７，３２１号の手順では、残留液は希釈ステップへ進み、そこでキャノーラタンパク質単離物がタンパク質ミセルの集団として沈殿する。タンパク質ミセルの集団を噴霧乾燥して、大部分が７Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供する。

本発明の二膜プロセスでは、第１の限外濾過ステップからの透過液を、限外濾過およびダイアフィルトレーションを含んでよい第２の限外濾過ステップ（限外濾過＃２−Ａ）にかける。第２の限外濾過ステップからの残留液を噴霧乾燥して、大部分が２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を提供する。

米国特許第１０／１３７，３２１号の手順では、タンパク質ミセルの集団の沈殿による上澄み液を限外濾過およびダイアフィルトレーションを含んでよい限外濾過ステップ限外濾過＃２−Ｂ）にかける。限外濾過ステップからの残留液を噴霧乾燥して、大部分が２Ｓタンパク質であるキャノーラタンパク質単離物を提供する。

上記のように、後者の限外濾過ステップからの残留液を加熱処理して、残留液中の７Ｓタンパク質の割合を低減させ、本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物を提供することができる。

(実施例)
実施例１：
この実施例では、本発明の一実施形態による新規なキャノーラタンパク質単離物の作製について説明する。

「ａ」ｋｇのキャノーラ粗粉を周囲温度で「ｂ」Ｌの０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液に加え、３０分間撹拌してタンパク質水溶液を得た。残留するキャノーラ粗粉を除去し、得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過で清澄化して、「ｄ」重量％のタンパク質含量を有する「ｃ」Ｌの濾過されたタンパク質溶液を得た。

一定分量「ｅ」Ｌのタンパク質抽出溶液を、５，０００ダルトンの分子量カットオフを有するポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜で濃縮して容積を「ｆ」Ｌに低減させ、次いで同じ膜で、「ｇ」Ｌの０．１Ｍ ＮａＣＩ溶液を用いてダイアフィルトレーションした。次いでダイアフィルトレーションした保持液を６０℃で１０分間低温殺菌した。得られた低温殺菌した濃縮タンパク質溶液は「ｈ」重量％のタンパク質含量を有していた。

「ｉ」℃の濃縮された溶液を「ｊ」の比で「ｋ」℃の温度の冷ＲＯ水中に入れて希釈した。直ちに白色の雲状物が生成し、これを沈降させた。上部希釈水を除去し、沈殿した粘性の付着性集団（ＰＭＭ）を、容器の底部から濾過タンパク質溶液の「ｌ」重量％の収率で回収した。乾燥ＰＭＭ誘導のタンパク質は「ｍ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有することがわかった。この生成物を「ｎ」Ｃ３００と表示した。

２つの実験についてのパラメータ「ａ」〜「ｎ」を以下の表Ｉに示す。

１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を用いた限外濾過で、除去した上澄み液の容積を「ｏ」Ｌに低減させ、次いで濃縮物を、同じ膜で「ｐ」Ｌの水でダイアフィルトレーションした。次いで、ダイアフィルトレーションされた濃縮物を６０℃で１０分間低温殺菌した。低温殺菌した濃縮物は「ｑ」重量％のタンパク質を含有していた。上澄み液から回収した追加のタンパク質を合わせて、濾過したタンパク質溶液の全体のタンパク質回収率は「ｒ」重量％であった。低温殺菌した濃縮物を等量で２分割した。その一方の部分を噴霧乾燥して最終生成物を得た。これを「ｎ」Ｃ２００と表示した。これは「ｓ」％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有していた。

２つの実験についてのパラメータ「ｎ」〜「ｓ」を以下の表ＩＩに示す。

低温殺菌され、濃縮された上澄み液の他方の部分を８５℃で１０分間加熱し、次いで遠心分離機にかけて沈殿したタンパク質を除去した。次いで得られた濃縮物を噴霧乾燥して最終生成物を得た。これを「ｎ」Ｃ２００Ｈと表示した。「ｔ」％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有していた。２つの実験についてのパラメータ「ｎ」および「ｔ」を以下の表ＩＩＩに示す。

実施例２：
この実施例は、濃縮上澄み液から得られたキャノーラタンパク質単離物のタンパク質プロファイルに対する加熱温度と時間の影響を示す。

実施例１に記載のようにして調製したバッチＳＡ０３５−Ｊ１４−０４ＡからのＣ２００キャノーラタンパク質単離物の溶液を、逆浸透精製水中で調製して５重量％のタンパク質濃度を得た。磁気撹拌子を用いてタンパク質と水を１時間室温で撹拌して溶液を調製した。

温度制御した水浴の中で、遠心分離管中のタンパク質溶液（２５ｍｌ）のサンプルを加熱した。サンプルを７５℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃の温度で１０分間加熱した。サンプルの内部温度が所望のレベルの１℃以内になったら時間計測を開始し、加熱の過程を通して、サンプルを絶えず撹拌した。加熱処理後、サンプルを８，０００ｇで１０分間遠心分離機にかけ、上澄み液をタンパク質プロファイルについてサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。

得られた結果を以下の表ＩＶに示す。

表ＩＶに示した結果から分かるように、加熱処理を施したものはすべて、サンプルより７Ｓタンパク質が大幅に低減される結果となった。９０℃での処理において７Ｓのレベルが最も低い結果となり、温度を９５℃に上げてもそれ以上の改善は得られなかった。サイズ排除ＨＰＬＣ分析によって、２Ｓのピーク面積に対して加熱処理は殆んど影響を及ぼしていないと判断された。これは、加熱処理によって、２Ｓタンパク質の損失は最少の結果であったことを意味している。

タンパク質溶液（８０ｍｌ）のサンプルを、９０℃の温度に設定した循環型水浴に取りつけられたジャケット付き容器中で加熱し、サンプルを磁気撹拌子で撹拌した。５、１０および１５分間の加熱時間後に一定分量の加熱した溶液を取り出した。サンプル温度が８５℃に達するまで時間計測を開始しなかった。加熱処理後、収集したサンプルを８，０００ｇで１０分間遠心分離機にかけ、上澄み液を分析した。

得られた結果を以下の表Ｖに示す。

表Ｖに示した結果から分かるように、試験したいずれの時間においても、サンプル中の７Ｓタンパク質のレベルに有意の差はなかった。

この実施例に示した結果から明らかなように、広範囲な加熱条件にわたって、濃縮された上澄み液中の７Ｓタンパク質の大幅な低減が得られる。

実施例３：
この実施例は、実施例１によって作製されたキャノーラタンパク質単離物についてのタンパク質プロファイルの評価を含む。

サイズ排除ＨＰＬＣを用いて、実施例１の手順によって作製した濃縮上澄み液および改変された濃縮上澄み液のタンパク質プロファイルを評価した。ＨＰＬＣ分析の前に、噴霧乾燥した生成物を０．１Ｍ ＮａＣｌ中に１重量％レベルで溶解させた。

得られた結果を以下の表ＶＩに示す。

表ＶＩに示した結果から分かるように、濃縮された上澄み液の加熱処理は、そうした加熱処理を行わない場合と比較して、噴霧乾燥キャノーラタンパク質単離物中の７Ｓタンパク質の量が大幅に低減された結果となっている。

実施例４：
この実施例は実施例１で作製したキャノーラタンパク質単離物の溶解性の評価を含む。

実施例１の手順によって作製した噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）および改変された濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）の溶解性を、ＭｏｒｒらのＪ．Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．５０：１７１５〜１７１８頁の手順の修正版を用いて測定した。

０．５ｇのタンパク質を供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量りとり、次いで少量の逆浸透（ＲＯ）精製水を加え、滑らかなペーストが得られるまで混合物を撹拌した。次いで追加の水を加えて容積を約４５ｍｌにした。次いでビーカーの内容物を、磁気撹拌機を用いて６０分間緩やかに撹拌した。タンパク質を分散させた後、直ちにｐＨを測定し、ＮａＯＨまたはＨＣｌで適切なレベル（４、５、６または７）に調節した。サンプルはｐＨ調節する前の元のｐＨでも調製した。ｐＨ調節したサンプルについて、ｐＨを測定し６０分間の撹拌の間に２回修正した。６０分間の撹拌後、ＲＯ水でサンプルを５０ｍｌの全容積にし、１重量／容積％のタンパク質分散液を得た。一定分量のタンパク質分散液を、Ｌｅｃｏ ＦＡ２８窒素測定器(Nitrogen Determinator)を用いたＬｅｃｏ分析によるタンパク質含量測定用に保存した。サンプルの別の取り分を８０００ｇで１０分間遠心分離機にかけた。これによって未溶解の材料がすべて沈殿し、透明な上澄み液が得られた。次いで上澄み液のタンパク質含量をＬｅｃｏ分析で測定した。

溶解性（％）＝(上澄み液タンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度)×１００
得られた結果を以下の表ＶＩＩに示す。

表ＶＩＩの結果から分かるように、改変した濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）からの乾燥単離物は、濃縮された上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物より、様々なｐＨ値で水に著しく可溶性が高い。

実施例５：
この実施例は、実施例１で作製したキャノーラタンパク質単離物のソフトドリンク中の溶解性の評価を含む。

実施例１の手順で作製した噴霧乾燥した濃縮上澄み液および改変した濃縮上澄み液のソフトドリンク中での溶解性を、ＭｏｒｒらのＪ．ＦｏｏｄＳｃｉ．５０：１７１５〜１７１８頁の手順を修正したものを用いて測定した。

１．０ｇのタンパク質を供給するのに十分なタンパク質粉末をビーカーに量りとり、次いで少量の無色透明の市販の炭酸ソフトドリンクを加え、その混合物を滑らかなペーストが得られるまで撹拌した。次いでソフトドリンクを追加して容積を約４５ｍｌにした。次いでビーカーの内容物を、磁気撹拌機を用いて６０分間緩やかに撹拌した。６０分間撹拌した後、ソフトドリンクでサンプルを５０ｍｌの全容積にし、２重量／容積％のタンパク質分散液を得た。一定分量のタンパク質分散液をＬｅｃｏ分析によるタンパク質含量測定用に保存した。サンプルの別の取り分を８０００ｇで１０分間遠心分離機にかけた。これによって未溶解の材料がすべて沈殿し、透明な上澄み液が得られた。次いで、上澄み液のタンパク質含量をＬｅｃｏ分析で測定した。

溶解性（％）＝(上澄み液タンパク質濃度／元の分散液のタンパク質濃度)×１００
得られた結果を以下の表ＶＩＩＩに示す。

表ＶＩＩＩの結果から分かるように、改変した濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）および濃縮上澄み液（Ｃ２００）からの乾燥単離物はソフトドリンク中で同じような溶解度を有していた。

しかし、以下の実施例６の結果から分かるように、改変した濃縮上澄み液からの乾燥単離物で調製した溶液の透明度は遥かに優れていた。

実施例６：
この実施例は、ソフトドリンク中に溶解した、実施例１で作製した噴霧乾燥単離物の溶液中の透明度の評価を含む。

実施例１で記載のようにして作製した改変した濃縮上澄み液および濃縮上澄み液からの噴霧乾燥単離物ソフトドリンクの溶液中の透明度を測定した。透明度は、無色透明の市販の炭酸ソフトドリンク中の２重量／容積％のタンパク質の溶液で、６００ｎｍで可視光の吸光度を測定することによって評価した。吸光度の読みがより低いほど、より光が透過しており、溶液の透明度はより良好であった。

得られた結果を以下の表ＩＸに示す。

表ＩＸに示した結果から分かるように、改変した濃縮上澄み液（Ｃ２００Ｈ）からの噴霧乾燥した単離物で調製した溶液の透明度は、噴霧乾燥した濃縮上澄み液（Ｃ２００）から調製したものより遥かに優れていた。

実施例７：
この実施例は、本発明の新規なキャノーラタンパク質単離物を生成する代替方法を示す（図１）。

３５０Ｌ抽出槽中の０．０５重量％アスコルビン酸を含む１００Ｌ（１５重量／容積％）の０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液に、周囲温度で１５ｋｇのキャノーラ油糧種子粗粉を加え、この混合物を３０分間撹拌して２０ｇ／Ｌの濃度を有するキャノーラタンパク質溶液を得た。４００メッシュのバグを備えたバスケット型遠心分離機を用いてバルク残留粗粉を除去し、分離したバルク粗粉を廃棄した。キャノーラタンパク質溶液を、６００メッシュのバグを用いてバスケット型遠心分離機に再度かけて懸濁している微粒子を除去した。２μｍの濾過充てん物を有するフィルタープレスを用いて、得られたキャノーラタンパク質溶液の仕上げ処理をした(polished)。

清澄化したキャノーラタンパク質溶液を、周囲温度で１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する螺旋巻型ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜を用いた限外濾過ステップにかけて、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質溶液を、４．３Ｌの容積、１８８ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮した。限外濾過ステップからの透過液は他の低分子量種と一緒に２Ｓタンパク質を含んでいた。

次いで、濃縮されたキャノーラタンパク質溶液（保持液）を、限外濾過用と同じ膜を使用して、０．０５重量％のアスコルビン酸を含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いてダイアフィルトレーションステップにかけた。透過液が膜から取り出されるのと同じ流速で、ダイアフィルトレーション媒体を残留液に加えた。ダイアフィルトレーションを５保持液容のダイアフィルトレーション媒体で実施した。

限外濾過およびダイアフィルトレーション操作からの１．２５Ｌの分量の残留液を噴霧乾燥して、９９．１重量％(Ｎ×６．２５、窒素値％はＬｅｃｏ ＦＰ５２８窒素測定器を用いて測定した)ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、１８．２１重量％の２Ｓタンパク質、７４．５５重量％の７Ｓタンパク質および７．２４重量％の１２Ｓタンパク質を含む、大部分が７Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得た。

限外濾過およびダイアフィルトレーション操作からの透過液を、５０００ダルトンの分子量カットオフを有する螺旋巻型ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を用いた限外濾過ステップにかけて、２Ｓタンパク質を保持させ、低分子量汚染物質は膜を通して廃棄した。この限外濾過ステップを周囲温度で実施して、第１の限外濾過ステップからの２Ｓ含有透過液を３Ｌ、１２５ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮した。

次いで、濃縮されたキャノーラ２Ｓタンパク質溶液（保持液）を、濾過した水道水をダイアフィルトレーション媒体として用いて、限外濾過用と同じ膜を用いたダイアフィルトレーションステップにかけた。透過液が膜から取り出されるのと同じ流速で、水を残留液に加えた。ダイアフィルトレーションを５保持液容のダイアフィルトレーション媒体で実施した。

ダイアフィルトレーションステップからの残留液を噴霧乾燥して、１０５．８重量％(Ｎ×６．２５)ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、９６．７重量％の２Ｓタンパク質、３．３重量％の７Ｓタンパク質および０．０４重量％の１２Ｓタンパク質を含む、大部分が２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得た。

実施例８：
この実施例では実施例７の方法を繰り返す。ただし、より大きなスケールで実施する。

１５０ｋｇのキャノーラ油糧種子粗粉を、１０，０００Ｌ抽出槽中で、０．０５重量％のアスコルビン酸を含む１０００Ｌ（１５重量／容積％）の０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液に周囲温度で加え、混合物を３０分間撹拌して、２０．７ｇ／Ｌの濃度を有するキャノーラタンパク質溶液を得た。バルク残留粗粉を真空ベルトフィルターを用いて除去し、分離した粗粉を廃棄した。ディスク型遠心分離機を用いてキャノーラタンパク質溶液を清澄化し、脱スラッジされた固形分を廃棄した。得られたキャノーラタンパク質溶液を、２μｍの濾過充てん物を有するフィルタープレスを用いて仕上げ処理し、続いて０．２μｍの濾過充てん物を有する別のフィルタープレスで仕上げ処理した。

清澄化したキャノーラタンパク質溶液を、１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する２つの螺旋巻型ＰＶＤＦ膜を用いて限外濾過にかけて、７Ｓおよび１２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質溶液を４１．１Ｌ、２２１ｇ／Ｌのタンパク質濃度に濃縮した。限外濾過ステップからの透過液は他の低分子量種と一緒に２Ｓタンパク質を含んでいた。

限外濾過操作からの３Ｌの分量の残留液を噴霧乾燥して、９５．１重量％(Ｎ×６．２５)ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、２６．８６重量％の２Ｓタンパク質、６６．２２重量％の７Ｓタンパク質および６．９２重量％の１２Ｓタンパク質を含む、大部分が７Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得た。

限外濾過操作からの透過液を、５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する２つの螺旋巻型ＰＶＤＦ膜を用いた限外濾過ステップにかけて２Ｓタンパク質を保持させ、低分子量汚染物質を膜通過させて廃棄した。この限外濾過ステップを周囲温度で実施して、第１の限外濾過ステップからの２Ｓ含有透過液を２５Ｌに濃縮した。そのタンパク質濃度は２４．２ｇ／Ｌであった。

限外濾過ステップからの残留液を噴霧乾燥して、４７．９４重量％(Ｎ×６．２５)ｄ．ｂ．のタンパク質濃度を有し、９４．６４重量％の２Ｓタンパク質、５．３６重量％の７Ｓタンパク質および０重量％の１２Ｓタンパク質を含むダイアフィルトレーションされていないキャノーラタンパク質生成物を生成した。

後者のキャノーラタンパク質生成物のタンパク質含量が低いのは、塩および他の不純物を除去するためのダイアフィルトレーションステップを行っていないためである。後で行ったこの生成物を用いたベンチダイアフィルトレーションでは、ダイアフィルトレーション後のキャノーラタンパク質単離物の生成を示す結果であった。

実施例９：
この実施例は、実施例７の手順によって調製されたキャノーラタンパク質単離物生成物とミセル経路で調製されたキャノーラタンパク質単離物生成物とを比較するものである。

実施例７で述べた第１の限外濾過ステップからの３４Ｌの分量の残留液を２９．８℃に加温し、保持液の容積当たり１０容の水の比率で温度３．７℃の冷水に注加した。直ちにタンパク質ミセルの白色雲状物が生成した。終夜かけてミセルを会合させ、沈降させた。蓄積されたタンパク質ミセルの集団を上澄み液から分離し、噴霧乾燥して１０７．４重量％(Ｎ×６．２５)ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、３．８０重量％の２Ｓタンパク質、８５．８８重量％の７Ｓタンパク質および１０．３２重量％の１２Ｓタンパク質を含むキャノーラタンパク質単離物を得た。

ＰＭＭ−沈降ステップ（３６５Ｌ）からの上澄み液を５０００ダルトンの分子量カットオフを有する螺旋巻型ＰＶＤＦ膜を用いて限外濾過ステップにかけて、２Ｓタンパク質および７Ｓタンパク質を保持し、低分子量汚染物質を膜通過させて廃棄した。この限外濾過ステップを周囲温度で実施して、上澄み液を２２Ｌに濃縮した。そのタンパク質濃度は８９．３ｇ／Ｌであった。

濃縮上澄み液を噴霧乾燥して、９５．５１重量％(Ｎ×６．２５)ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、８４．０１重量％の２Ｓタンパク質、１５．５１重量％の７Ｓタンパク質および０．４８重量％の１２Ｓタンパク質を含む、大部分が２Ｓタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物を得た。

(開示の要約)
本開示を要約すると、２Ｓタンパク質の含量が増大しており、かつ７Ｓタンパク質の含量が減少している新規なキャノーラタンパク質単離物を提供する。これは、透明な水溶液、特にソフトドリンクの製造での有用性を提供するものである。本発明の範囲内の変更形態が可能である。

タンパク質ミセルプロセス上に載せた本発明の一実施形態によるタンパク質溶液回収プロセスの概略を示す図である。

Claims (30)

1. 大部分が２Ｓキャノーラタンパク質からなり、かつキャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿によって上澄み水溶液から得られたキャノーラタンパク質単離物と比較して、乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）（Ｎ×６．２５）で少なくとも約９０重量％のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しており、かつ７Ｓキャノーラタンパク質の割合が減少している、大部分が２Ｓキャノーラタンパク質からなるキャノーラタンパク質単離物。
2. 前記上澄み水溶液を加熱処理して得られる請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
3. キャノーラ油糧種子粗粉から得られ、かつ１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓキャノーラタンパク質を含むキャノーラタンパク質水溶液に、１２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質を選択的に残留液中に保持し２Ｓタンパク質を透過液として膜を通過させる第１の選択的膜技術を施し、前記透過液に、２Ｓキャノーラタンパク質を選択的に保持し低分子量汚染物質を透過液として膜を通過させる第２の選択的膜技術を施し、第２の選択的膜技術による前記残留液を乾燥させる選択的膜手順から得られる請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
4. 少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物。
5. 乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有し、単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも約８５重量％の２Ｓキャノーラタンパク質と約１５重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含むキャノーラタンパク質単離物。
6. 単離物中に存在するキャノーラタンパク質の少なくとも約９０重量％の２Ｓキャノーラタンパク質と約１０重量％未満の７Ｓキャノーラタンパク質を含む請求項５に記載のキャノーラタンパク質単離物。
7. 少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する請求項５に記載のキャノーラタンパク質単離物。
8. ２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しているキャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
   （ａ）大部分が２Ｓタンパク質からなる、２Ｓタンパク質および７Ｓタンパク質の水溶液を用意するステップと、
   （ｂ）前記水溶液を加熱処理して７Ｓキャノーラタンパク質の沈殿するステップと、
   （ｃ）前記水溶液から沈殿した７Ｓタンパク質を除去するステップと、
   （ｄ）少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有し、２Ｓキャノーラタンパク質の割合が増大しているキャノーラタンパク質単離物を回収するステップと
   を含む方法。
9. 前記加熱処理ステップを、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも約５０重量％を沈殿するのに十分な温度と時間の条件下で実施する請求項８に記載の方法。
10. 前記加熱処理ステップが、前記７Ｓキャノーラタンパク質を、前記水溶液中に存在する７Ｓキャノーラタンパク質の少なくとも７５％沈殿する請求項９に記載の方法。
11. 前記加熱処理ステップを、約７５℃〜約９５℃の温度で約５〜約１５分間、水溶液を加熱することによって実施する請求項８に記載の方法。
12. ２Ｓおよび７Ｓキャノーラタンパク質の前記水溶液が、キャノーラタンパク質のミセルの生成および沈殿によって濃縮された上澄み液である請求項８に記載の方法。
13. 前記キャノーラタンパク質ミセルの生成を、
    （ａ）キャノーラ油糧種子粗粉を少なくとも約５℃の温度で抽出し、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化してタンパク質水溶液を形成するステップと、
    （ｂ）前記タンパク質水溶液を残留油糧種子粗粉から分離するステップと、
    （ｃ）前記タンパク質水溶液の濃度を少なくとも約２００ｇ／Ｌに増大させ、同時に、選択的膜技術によってイオン強度を実質的に一定に保持して濃縮タンパク質溶液を提供するステップと、
    （ｄ）前記濃縮タンパク質溶液を約１５℃未満の温度の冷水中に入れて希釈してタンパク質ミセルを生成させるステップと、
    （ｅ）沈降したタンパク質ミセルの集団から上澄み液を分離するステップと
    によって実施する請求項１２に記載の方法。
14. 前記加熱処理の前に、前記上澄み液を約１００〜約４００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する請求項１３に記載の方法。
15. 前記上澄み液を約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する請求項１４に記載の方法。
16. 前記濃縮ステップを、分子量カットオフ約３，０００〜約１００，０００ダルトンを有する膜を用いた限外濾過によって実施する請求項１４に記載の方法。
17. 前記加熱処理ステップの前に、限外濾過により得られた濃縮上澄み液をダイアフィルトレーションにかける請求項１６に記載の方法。
18. 約３，０００〜約１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を使用して、前記ダイアフィルトレーションステップを、約２〜約２０容、好ましくは約５〜約１０容の水を用いて実施する請求項１７に記載の方法。
19. 前記キャノーラタンパク質単離物が少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有する請求項８に記載の方法。
20. キャノーラタンパク質単離物の調製方法であって、
    （ａ）キャノーラ油糧種子粗粉から得られ、１２Ｓ、７Ｓおよび２Ｓキャノーラタンパク質を含むキャノーラタンパク質水溶液を用意するステップと、
    （ｂ）７Ｓおよび１２Ｓキャノーラタンパク質を残留液中に保持し２Ｓタンパク質を透過液として膜通過させて、濃縮タンパク質溶液を提供するのに効果的な選択的な膜技術を用いて水溶液のタンパク質濃度を増大させるステップと、
    （ｃ）ステップ（ｂ）からの残留液を乾燥させて、大部分が７Ｓキャノーラタンパク質からなり、乾燥重量ベース（ｄ．ｂ．）で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を提供するステップと、
    （ｄ）２Ｓキャノーラタンパク質を残留液中に保持し、低分子量汚染物質を膜を通して透過液中で通過させるのに効果的な選択的膜技術を用いてステップ（ａ）からの透過液の濃度を増大させるステップと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）からの残留液を乾燥して、大部分が２Ｓタンパク質からなり、少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）ｄ．ｂ．のタンパク質含量を有するキャノーラタンパク質単離物を提供するステップと
    を含む方法。
21. 前記キャノーラタンパク質水溶液を、少なくとも約５℃の温度でキャノーラ油糧種子粗粉を抽出し、前記キャノーラ油糧種子粗粉中のタンパク質を可溶化して、約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量と約５〜約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を生成するステップと、残留油糧種子粗粉から該タンパク質水溶液を分離するステップとによって提供する請求項２０に記載の方法。
22. ステップ（ｂ）を、前記水溶液を少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質含量に濃縮し、同時に、約３０，０００〜約１５０，０００ダルトン、好ましくは約５０，０００〜約１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を用いて、イオン強度を実質的に一定に保持することによって実施して濃縮タンパク質溶液を提供する請求項２１に記載の方法。
23. 前記濃縮タンパク質溶液を、約２〜約２０、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いたダイアフィルトレーションのステップにかける請求項２２に記載の方法。
24. ステップ（ｄ）を、約３，０００〜約３０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を用いて、透過液の濃度を約１００〜約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００〜約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度に増大させることによって実施して残留液を提供する請求項２３に記載の方法。
25. 前記残留液を、約２〜約２０、好ましくは約５〜約１０容のダイアフィルトレーション溶液を用いたダイアフィルトレーションのステップにかける請求項２４に記載の方法。
26. ステップ（ｃ）および（ｅ）で作製されたキャノーラタンパク質単離物の少なくとも１つが少なくとも約１００重量％のタンパク質含量を有する請求項２０に記載の方法。
27. 請求項１に記載のキャノーラタンパク質単離物の水溶液。
28. キャノーラタンパク質単離物で強化したソフトドリンクである請求項２７に記載の水溶液。
29. 請求項５に記載のキャノーラタンパク質単離物の水溶液。
30. キャノーラタンパク質単離物で強化したソフトドリンクである請求項２９に記載の水溶液。

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