CN109414036A - 获得油菜籽蛋白质分离物的方法以及由此获得的蛋白质分离物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备可溶性天然油菜籽蛋白质分离物的方法和通过该方法获得的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物。
Description
技术领域
本发明涉及制备可溶性天然油菜籽(rapeseed)蛋白质分离物的方法和通过该方法获得的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物。
背景技术
蛋白质是人类营养的主要特征。其可源自动物(例如肉、鱼、蛋、乳制品)或植物。一般期望减少动物源性蛋白质的量。卵蛋白的使用通常是不期望的。例如，由于蛋过敏问题、与蛋中胆固醇水平相关的医疗问题、宗教限制/定罪、烹饪偏好(例如素食者或纯素饮食)、蛋价格成本波动、禽类制品中抗生素和激素的使用以及与禽类相关的疾病(例如禽流感)，可能期望使用替代性蛋白质。在人类营养中使用植物源性蛋白质是已知的，例如WO 2008/094434公开了在组合物中使用小麦蛋白质分离物作为使用蛋黄蛋白质的替代方案。然而，对于那些对麸质过敏的人来说，使用小麦蛋白质分离物可能不是期望的。例如在WO 2014/018922中也描述了使用大豆源性蛋白代替乳清蛋白。大豆蛋白被广泛使用，但考虑到对大豆制品的某些不耐性，需要寻找植物蛋白的其它来源。
合适的替代物包括豌豆蛋白质和油菜籽蛋白质。油菜籽种子富含油，并且含有占种子干重17-25％的相当大量的蛋白质。加工油菜籽以获得供人类消费的油会产生油菜籽粗粉(meal)(60％)作为副产物，其含有约30％至40％的蛋白质。用于此目的的油菜籽通常属于Brassica napus和Brassica juncea品种。这些品种仅含低水平的芥酸和硫代葡萄糖苷，也被称为加拿大油菜籽(Canola)。加拿大油菜籽是加拿大(Canada)和“ola”(代表“油低酸(oil low acid)”)的缩写，但现在是一个通用术语，其被定义为含有<2％芥酸和<30mmol/g硫代葡萄糖苷的油菜籽油。所产生的油菜籽粗粉目前被用作高蛋白动物饲料。
蛋白质可以以水解物、浓缩物和分离物的形式获得。水解物是通过将蛋白质暴露于热、酸或(断开连接氨基酸的键的)酶而部分分解了的蛋白质。这使得其味更苦，但也使其在消化过程中比天然(非水解的)蛋白质更快地被吸收。分离物比浓缩物更纯，这意味着其他非蛋白质组分已被部分去除以“分离”蛋白质。许多浓缩物为约80％蛋白质，这意味着：以干基计，总重量的80％是蛋白质。分离物通常为约90％蛋白质(干基)。这是使用Kjeldahl方法计算的。
在油菜籽中发现的主要储藏蛋白是十字花科植物素(cruciferins)和芸苔籽蛋白(napins)。十字花科植物素是球蛋白，是种子中的主要储藏蛋白。十字花科植物素由6个亚基构成，总分子量为约300kDa。芸苔籽蛋白是白蛋白，是分子量为约14kDa的低分子量储藏蛋白。芸苔籽蛋白更容易溶解，例如EP 1715752 B1中公开了一种方法，以分离出可溶性较强的芸苔籽蛋白级分，优选达到至少85重量％。芸苔籽蛋白被主要建议用于溶解度很关键的应用中。
根据以斯韦德贝里单位(S)计的相应沉降系数，油菜籽蛋白质也可以被分成多种级分。该系数表示大分子在离心场中的沉降速度。对于油菜籽蛋白质而言，主要报道的级分是：12S、7S和2S。十字花科植物素和芸苔籽蛋白是油菜籽中发现的两种主要的贮藏蛋白家族。芸苔籽蛋白是2S白蛋白，而十字花科植物素是12S球蛋白。此外，Schwenke和Linow(Areversible dissociation of the 12S globulin from rapeseed(Brassica napus L.)depending on ionic strength,Nahrung(1982)26,K5-K6)指出：十字花科植物素复合物在暴露于较高离子强度(μ≥0.5mS/cm)时以300kDa 12S六聚体的形式存在，在暴露于低离子强度条件时可逆地解离成150kDa的7S三聚体分子。
已经发现，高纯度油菜籽蛋白质分离物在食品中具有基础广泛的功能，在蛋白质材料中是独特的。在食品中使用源自植物的蛋白质的能力使得能够在没有任何可用替代物时，在原本使用蛋清和/或动物来源蛋白质的情况下提供真正的素食食品。
油菜籽蛋白质分离物可用于蛋白质分离物的常规应用，例如加工食品的蛋白质强化、油的乳化、烘焙食品中的成型剂(body formers)和捕获气体的产品中的发泡剂。油菜籽蛋白质分离物还具有等电沉淀物和源材料未展示出的功能。油菜籽蛋白质分离物具有某些功能，包括能够形成蛋白质纤维和能够在食品中用作增量剂或蛋白质替代品，所述食品中使用动物蛋白质或其它植物蛋白质。如本文所述，油菜籽蛋白质分离物具有另外的功能。
EP 1389921 B1公开了一种形成食品组合物的方法，该方法包括在至少5℃的温度下用水性食品级盐溶液提取油菜籽含油种子粗粉，以使蛋白质在油菜籽含油种子粗粉中溶解并形成蛋白质含量为5-30g/l、pH值为5-6.8的水性蛋白质溶液，随后通过胶团分离出两种蛋白质级分。这么做是为了提高溶解度，因为12S级分通常被认为在不存在盐的情况下在宽pH范围内难以溶解。将所得蛋白质分离物掺入所述食物组合物中以代替蛋清、乳蛋白、全蛋、肉纤维或明胶。US2010/041871中公开了类似的胶团分级方法，其导致分开的十字花科植物素级分和芸苔籽蛋白级分。DE 10 2014 005466 A1也描述了获得经纯化的十字花科植物素和芸苔籽蛋白级分的方法。在该方法中，还获得了具有55-60％芸苔籽蛋白和40-45％十字花科植物素的两者的蛋白质混合物。该蛋白质混合物的溶解度为约75％。
WO 2013/000066公开了油菜籽蛋白质产物，其具有至少约60重量％的蛋白质含量，低植酸含量，优选等份的2S和7S，伴随较低含量的12S。
EP 1720415公开了制备用于水产养殖饲料组合物的油菜籽蛋白质分离物的方法，所述油菜籽蛋白质分离物包含25-55重量％的2S油菜籽蛋白质、47-75重量％的7S油菜籽蛋白质和0-15重量％的12S油菜籽蛋白质。该方法需要使用高水平的盐，这在水产养殖中不是问题，但不适合人类营养。
与现有技术产品和方法相关的主要问题之一是高溶解性(即具有>80％、优选>85％、更优选>90％的溶解度)油菜籽蛋白质分离物只能通过分级方法获得，其中(部分的)7S级分和/或12S级分被除去。因此需要获得高溶解性油菜籽蛋白质分离物，而不必进行另外的分级步骤，所述另外的分级步骤具有部分有价值蛋白质被浪费的额外缺点。
附图说明
图1示出了应用于来自实施例1中获得的五个不同批次的油菜籽蛋白质分离物的蓝色非变性PAGE凝胶(Blue Native PAGE gels，泳道1-5)。泳道M是沿纵轴展示的用于确定分子量的标记物条带。
发明详述
传统上，对于具有相对高的油含量(基于干物质＞35％，油菜籽为～40％)的材料而言，使用机械压榨和溶剂提取的组合来有效提取油(Rosenthal等人,Enzyme andMicrobial Technology 19(1996)402-420)。提取之后，对经压榨的材料进行热处理以除去溶剂，从而产生油和蛋白质含量分别为干物质的1-5％和40-50％的粗粉(也称为饼(cake))。虽然所述粗粉具有相对高的蛋白质含量，但油提取期间所应用的苛刻条件(即，提高的温度、溶剂)显著降低了品质。这些油提取条件不利于蛋白质的品质这一认识是支持冷压技术改进的因素之一。在冷压期间，不使用溶剂(例如己烷)且在温和条件下榨出油，从而产生品质更好的油和品质更高的含油种子压榨的粗粉。这种含油种子压榨的粗粉具有相对高的油含量(基于干物质，通常>8％，例如>10％)，且是功能性得到保留的蛋白质的极好来源。可通过例如水性提取容易地从粗粉中提取这些蛋白质(Rosenthal等人,Enzyme andMicrobial Technology 19(1996)402-420,Rosenthal等人,Trans iChemE,Part C,76(1998)224-230和Lawhon等人,J.Food Sci.46(1981)912-916)。这类工艺的最大挑战之一是：在提取期间，蛋白质和油被同时提取。这导致含有显著量油的提取物，所述油在大多数情况下部分作为稳定乳剂存在，从而使其去除相当困难。WO 2014/147068公开了温和提取冷压的油菜籽粗粉以获得几乎不含脂肪的富含蛋白质的提取物。
我们发现：在我们的方法中，基于冷压的油菜籽粗粉，不需要分离出蛋白质成分，但可以在较广泛的pH范围内实现并保持前所未有的溶解度。因此，只能通过减少具有较低溶解度的蛋白质(例如十字花科植物素或12S蛋白)的量来改善油菜籽蛋白质分离物的溶解度的这一假说看起来并不是排他的，因为起始材料的性质和本发明的工艺步骤能够产生相同的有利结果。
已发现：在温和提取使用上述冷压方法获得的油菜籽油粗粉(rapeseed oilmeal)后根据本发明获得的包含十字花科植物素和芸苔籽蛋白的可溶性天然油菜籽蛋白质分离物的使用，在用于完全或部分替代其它蛋白质时产生了出乎意料好的结果。
在本发明的第一方面，提供了一种获得天然油菜籽蛋白质分离物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将冷压油菜籽油粗粉与水性液体在45-65℃的温度下混合；
ii)从步骤i)中获得的混合物中分离水性液体；
iii)将步骤ii)中获得的水性液体脱脂(decreaming)；
iv)通过加入酸或碱将步骤iii)中获得的脱脂水性液体的pH调节至中性，并与沉淀剂混合以获得沉淀物；
v)除去步骤iv)中获得的沉淀物以获得水性液体；
vi)浓缩并洗涤步骤v)中获得的水性液体；
vii)通过干燥从步骤vi)中获得的经浓缩和洗涤的水性液体中分离天然油菜籽蛋白质分离物。
所述天然油菜籽蛋白质分离物由油菜籽冷压饼/粗粉(油菜籽油生产的副产物)产生。
步骤i)至vii)优选有序进行，即按照上述顺序进行。
在步骤i)中，优选地，所述水性液体是水性盐溶液。更优选地，水性盐溶液包含氯化钠。最优选地，水性盐溶液包含1-5％的氯化钠(w/w)。优选地，提取时间在5-60分钟的范围内、更优选地在30-60分钟的范围内。优选地，在提取过程中，富含蛋白质的液相中的蛋白质:脂肪比保持大于12。优选地，将所提取的油菜籽油粗粉用水性提取液以1:2至1:30、更优选1:4至1:25、仍然更优选1:5至1:20(w/w)的比值洗涤。
在步骤ii)中，可以使用本领域已知的任何方法(包括过滤和离心)进行分离。例如，可以使用标准滤器、压滤机、带式滤器或其它滤器或离心机，优选在减压(即-0.8bar至-0.1bar)下进行。优选地，保持45-65℃的提取温度。
在一个实施方式中，可以根据WO 2014/147068中描述的重力引起的固-液提取进行步骤i)中的混合和步骤ii)中的分离。
在步骤iii)中，优选地，使用离心将含有蛋白质的水性提取液脱脂。或者，可以使用过滤。优选地，脂肪水平降低至少50％(w/v)。随着浓度的降低测量去除，同时保持体积(合理地)恒定，因为体积的约0.5％至5％作为“乳脂”被除去。
在步骤iv)中，沉淀剂可包含几种二价离子，包括镁、锌、铁和钙的盐。优选地，使用现有技术例如US 2014/256914(尽管是为了在不同的物种——豆类豌豆蛋白中沉淀)中所提倡的氯化钙水溶液。优选地，提取物中氯化钙溶液的终浓度为0.1-50g/L、更优选地0.1-40g/L、特别地0.2-30g/L、最特别地1-20g/L。与沉淀剂的混合可在pH调节之前、期间或之后进行。pH调节达到中性，优选达到pH 6.0至pH 8.0之间的值，更优选达到pH 6.2至pH 7.2之间的值。
在步骤v)中，可以通过几种方法中的任何一种除去沉淀物(例如植酸钙、植酸镁、植酸铁、植酸锌或其它植酸盐)，所述方法包括过滤、离心或加入酶如植酸酶。
在步骤vi)中，优选地，通过超滤进行浓缩以达到至少6x的浓度。优选地，使用约10倍浓缩物体积的水，通过渗滤进行洗涤。例如，如果初始体积为300L，则将液体浓缩至约50L(6x浓度)，然后用500L(10x)水洗涤。优选地，使用8-12kDa聚醚砜PES膜在45-65℃范围内的温度下进行洗涤。或者，再生纤维素也可以起作用，也可以使用冷超滤。优选地，使用0.5-2％氯化钠溶液，然后使用0.015％-0.4％氯化钠溶液进行洗涤。或者，第二次洗涤可以用蒸馏水。
在步骤vii)中，干燥优选使用标准干燥技术(例如蒸发、冻干、喷雾干燥等)进行，应用或不应用减压。优选地，使用喷雾干燥。
优选地，油菜籽蛋白质分离物是在这样的方法中获得的，所述方法不包括用于分离出十字花科植物素和芸苔籽蛋白的分级步骤。
优选地，天然油菜籽蛋白质分离物是在这样的方法中获得的，其中保持芸苔籽蛋白和十字花科植物素的水平基本恒定在要求保护的范围内(即，不有意提高芸苔籽蛋白(2S)和十字花科植物素(12S)的水平)。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物包含至少5％(基于干物质)的12S油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性PAGE验证12S的存在。更优选地，天然油菜籽蛋白质分离物包含至少10％、最优选地至少15％、特别地至少25％、最特别地至少65％(基于干物质)的12S油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性PAGE验证12S的存在。
在第二方面，本发明提供了通过根据本发明第一方面的方法获得的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含40-65％的十字花科植物素和35-60％的芸苔籽蛋白，并且当在3-10的pH范围内在23±2℃的温度下测量时，其溶解度为至少88％。
优选地，当在3-10的pH范围内在23±2℃的温度下测量时，天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％、更优选至少92％。优选地，当在6-9的pH范围内在23±2℃的温度下在水中测量时，天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度等于或为至少93％。这又称作可溶性固体指数(SSI)。
在一个实施方式中，天然油菜籽蛋白质分离物包含至少5％(基于干物质)12S油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性PAGE验证12S的存在。
为了用于人类食物消费，天然油菜籽蛋白质分离物优选包含低水平的盐。这通过电导率来测量。优选地，天然油菜籽蛋白质分离物在2-12的pH范围内在2％水溶液中的电导率小于9000μS/cm。更优选地，天然油菜籽蛋白质分离物在2.5-11.5的pH范围内在2％水溶液中的电导率小于4000μS/cm。为了比较，5g/L氯化钠水溶液的电导率为约9400μS/cm。
优选地，天然油菜籽蛋白质分离物的植酸盐水平低于0.4重量％、更优选低于0.3重量％、最优选低于0.15重量％。
优选地，基于干重计，天然油菜籽蛋白质分离物的蛋白质含量为至少90重量％(以Kjeldahl N x 6.25计算)、更优选地至少94重量％、最优选地至少96重量％、特别地至少98重量％。
优选地，天然油菜籽蛋白质分离物是未水解的。
实施例
试验方法
蛋白质含量
根据AOAC官方方法991.20牛奶中的(总)氮(AOAC Official Method991.20Nitrogen(Total)in Milk)，通过Kjeldahl方法来测定蛋白质含量，使用换算因数6.25来确定蛋白质的量(％(w/w))。
电导率
使用电导率仪：Hach sensION+EC71，测量天然油菜籽蛋白质分离物在2重量％水溶液中的电导率。
溶解度试验
以下溶解度试验改编自Morr等人(J.Food Sci.(1985)50,1715-1718)，不同之处在于使用水代替0.1M氯化钠。
将足以提供0.8g蛋白质的蛋白质粉末称量到烧杯中。向粉末中加入少量脱矿质水，并搅拌混合物直至形成光滑的糊状物。然后加入另外的脱矿质水以使总重量为40g(产生2％w/w的蛋白质分散体)。使用磁力搅拌器缓慢搅拌分散体至少30分钟。然后测定pH并用氢氧化钠或盐酸将pH调节至期望水平(2、3、4等)。测量分散体的pH并在60分钟的搅拌期间定期校正pH。搅拌60分钟后，保留一份蛋白质分散体用于蛋白质含量测定(Kjeldahl分析)。将另一部分样品以20000g离心2分钟。离心后分离上清液和沉淀。也通过Kjeldahl分析确定蛋白质含量。
蛋白质溶解度(％)＝(上清液中的蛋白质/总分散体中的蛋白质)×100。
用于测定溶解度的替代方法是可用的，在某些情况下使用缓冲剂，如WO 2011/057408中的硼酸盐-磷酸盐缓冲剂。然而，例如值与在本申请中获得的在没有缓冲剂的情况下测定的值不能比较。
通过蓝色非变性PAGE测定MW
在非变性PAGE的情况下，蛋白质电荷对电泳迁移率有影响。在蓝色非变性PAGE的情况下(与清澈(clear)非变性PAGE相反)，考马斯亮蓝染料为蛋白质复合物提供电泳分离所需的电荷。将蛋白质溶解在500mM氯化钠中。由于高盐浓度与电泳分离不相容，所以将样品用水稀释10倍(最终盐浓度：50mM)。使用G-250(SimplyBlueTM,ThermoFischer Scientific)，并利用ExQuestTM Spot Cutter(BioRad)扫描凝胶。观察进行蓝色非变性PAGE之后产生的条带。预计约14kDa的条带指示2S，约150kDa的条带指示7S，300kDa的条带指示12S蛋白质。
十字花科植物素/芸苔籽蛋白(C/N)比值
通过尺寸排阻色谱(SEC)分析来确定C/N比值。将样品溶解在500mM氯化钠盐溶液中并使用与流动相相同的溶液通过HP-SEC进行分析。通过测量280nm处的UV吸光度来进行检测。按照每种蛋白质的峰面积相对于两个峰面积总和的比值来计算十字花科植物素和芸苔籽蛋白的相对贡献(％)。
植酸盐水平
基于Ellis等人(Anal.Biochem.(1977)77,536-539)，使用方法QD495在Eurofins测量植酸盐。
实施例1
从冷压油菜籽含油种子粗粉制备油菜籽蛋白质分离物
由冷压油菜籽含油种子粗粉制备油菜籽蛋白质分离物，清洁并在75℃以下处理，所述冷压油菜籽含油种子粗粉的含油量基于干物质计小于15％。
在提取步骤中，将冷压油菜籽含油种子粗粉与水性盐溶液(1-5％氯化钠)在40-75℃的温度下混合。粗粉与水性盐溶液的比值在1:5至1:20的范围内。约30分钟至1小时后，将富含蛋白质的溶液(提取物)与不溶物质分离。将提取物的pH调节至中性，并进一步处理提取物以澄清材料并除去非蛋白质物质。在脱脂步骤中，利用离心除去残留的脂肪。通过在使植酸盐沉淀的盐(例如氯化钙)的存在下将材料的pH调节至中性来除去非蛋白质物质。通过固/液分离步骤(例如膜压滤机或离心)除去形成的沉淀物，其中杂质以固体盐形式(例如植酸钙)被除去。然后浓缩提取物并在超滤/渗滤(UF/DF)步骤中洗涤。最后，将经洗涤的浓缩物在入口温度为150-200℃且出口温度为50-100℃的喷雾干燥器中干燥，从而产生了油菜籽蛋白质分离物。准备并检测了几个批次。
所产生的天然油菜籽蛋白质分离物在2.5-11.5的pH范围内在2％溶液中的电导率小于4000μS/cm。
蓝色非变性PAGE：观察到了大致约300kDa的主要条带，在242kDa MW标记和480kDaMW标记之间(图1)。一些染色可见曳尾(smear)，因为分子量较低(150kDa及以下)。在150kDa处没有观察到清晰的条带。基于这些结果，油菜籽产物含有12S形式的十字花科植物素。
所产生的天然油菜籽蛋白质分离物包含40-65％的十字花科植物素和35-60％的芸苔籽蛋白。
所产生的天然油菜籽蛋白质分离物含有少于0.26重量％的植酸盐。
当在3-10的pH范围内在23±2℃的温度下测量时，所产生的天然油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％，如下表中关于两个批次所示。
| pH | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 样品1的溶解度(％) | 98 | 96 | 89 | 95 | 95 | 97 | 97 | 98 |
| 样品1的溶解度(％) | 102.5 | 97.5 | 94.3 | 93.9 | 97.0 | 93.0 | 94.0 | 99.8 |
Claims (15)
1.一种获得天然油菜籽蛋白质分离物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)将冷压油菜籽油粗粉与水性液体在45-65℃的温度下混合；
ii)从步骤i)中获得的混合物中分离水性液体；
iii)将步骤ii)中获得的水性液体脱脂；
iv)通过加入酸或碱将步骤iii)中获得的脱脂水性液体的pH调节至中性，并与沉淀剂混合以获得沉淀物；
v)除去步骤iv)中获得的沉淀物以获得水性液体；
vi)浓缩并洗涤步骤v)中获得的水性液体；
vii)通过干燥从步骤vi)中获得的经浓缩和洗涤的水性液体中分离天然油菜籽蛋白质分离物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述油菜籽蛋白质分离物包含40-65％的十字花科植物素和35-60％的芸苔籽蛋白，并且其中当在3-10的pH范围内在23±2℃的温度下测量时，所述油菜籽蛋白质分离物的溶解度为至少88％。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中在步骤i)中，进行所述混合，使得所述冷压油菜籽油粗粉与所述水性液体之间的比值为1:2至1:30(w/w)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤i)中，所述水性液体是包含1-5％氯化钠(w/w)的水性盐溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤iii)中，通过离心进行所述脱脂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤iv)中，所述沉淀剂是氯化钙水溶液。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在步骤vi)中，通过超滤和渗滤进行所述浓缩和洗涤。
8.一种通过权利要求1-7中任一项所述的方法获得的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含40-65％的十字花科植物素和35-60％的芸苔籽蛋白，并且当在3-10的pH范围内在23±2℃的温度下测量时，其溶解度为至少88％。
9.根据权利要求8所述的天然油菜籽蛋白质分离物，当在6-9的pH范围内在23±2℃的温度下测量时，其溶解度为至少92％。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其中所述天然油菜籽蛋白质分离物包含至少5％(基于干物质)的12S油菜籽蛋白质，其中通过蓝色非变性PAGE验证12S的存在。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其在2-12的pH范围内在2重量％的水溶液中的电导率小于9000μS/cm。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其包含基于干物质计少于20％的7S油菜籽蛋白质。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其中十字花科植物素/芸苔籽蛋白的比值为0.9-1.3。
14.根据权利要求8-13中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其植酸盐水平低于0.4重量％。
15.根据权利要求8-13中任一项所述的天然油菜籽蛋白质分离物，其蛋白质含量基于干重计为至少90重量％。
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