CN101648998B - 一种从组分ⅰ+ⅲ或组分ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从组分I+III或组分III中提取人免疫球蛋白的方法，可有效解决从组分I+III或组分III中提取人免疫球蛋白，以满足人们对免疫球蛋白的需求问题，是由以下步骤实现：①组分I+III或组分III沉淀的溶解；②去除组分I；③分离组分III；④分离组分II；⑤组分II沉淀溶解过滤；⑥超滤、透析、浓缩；⑦组分II加温提纯；⑧纯化；⑨超滤透析，本发明方法先进，工艺简单，可以有效的从组分I+III或组分III中分离出组分II进而制成人免疫球蛋白成品，对缓解国内原料血浆供应紧张的局面具有十分重要的现实意义，既充分实现了对原料的充分利用，又防止了对环境的污染，经济和社会效益巨大。
Description
一、技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别是一种从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法。
二、背景技术
免疫球蛋白是一组具有抗体活性的蛋白质，经输注后，能迅速提高受者血液中的IgG水平，增强机体的抗感染能力和免疫调节功能。人免疫球蛋白传统的分离工艺是E.J.Cohn教授创立的低温乙醇分级沉淀技术，该技术通过有效控制蛋白质沉淀的五个因素：pH值、温度、蛋白质浓度、离子强度、乙醇浓度来逐级沉淀血浆中的不同蛋白质，一般分离人免疫球蛋白的步骤为先从血浆提取人血白蛋白过程中产生的Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ组分或Ⅱ+Ⅲ组分中分离组分Ⅱ，组分Ⅱ经过纯化得到人免疫球蛋白，提取人免疫球蛋白后会产生组分Ⅰ+Ⅲ沉淀或产生组分Ⅲ沉淀，被作为废物处理。由于分级沉淀过程中的影响因素很多，传统的生产工艺中，组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ沉淀中夹杂有大量未能被分离的组分Ⅱ，也被同时弃去，造成材料的浪费，也为制造人免疫球蛋白原料造成紧缺，于国于民都不利，因此，如何能够从废弃的沉淀中回收组分Ⅱ进而制成人免疫球蛋白成品，对缓解国内原料血浆供应紧张的局面具有十分重要的现实意义。那么，如何解决这一技术难题呢？
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，可有效解决从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白，以满足人们对免疫球蛋白的需求问题，其解决的技术方案是由以下步骤实现：
①组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ沉淀(物)的溶解；
②去除组分Ⅰ：调整溶解液pH至4.8～5.1，降温，加入乙醇至乙醇浓度为8～9％，复测并校正pH至4.8～5.1，搅拌反应降温至-2.0℃～2.5℃，之后，每千升(KL)反应液中加入硅藻土4kg和珍珠岩4kg，搅拌反应，之后，压滤分离组分Ⅰ，收集上清液弃去沉淀(若沉淀为组分Ⅲ不做该步骤)；
③组分Ⅲ的分离：计量上清液体积，调整上清液pH5.05～5.25，加入乙醇至乙醇浓度为13～15％，调整加乙醇后的溶液pH5.05～5.25，控制温度-2.0℃～-4.0℃，搅拌反应2小时以上，之后，每千升(KL)反应液中加入硅藻土3kg和珍珠岩3kg，搅拌后，压滤分离组分Ⅲ，收集上清液，弃去沉淀；
④组分II的分离：计量上清液体积，加入氯化钠至浓度4.5～5.5g/L，调pH6.8～7.2，加入95％乙醇至乙醇浓度为17～19％，降温至-5.0～-6.0℃，搅拌反应2小时以上，压滤分离组分Ⅱ，收集压滤机上的沉淀；
⑤组分II沉淀溶解过滤：组分Ⅱ沉淀用5～10倍沉淀重量2～8℃注射用水溶解，校正pH值至4.9～5.2，溶解后板框过滤；
⑥超滤、透析、浓缩：过滤液用截流分子量为50KD超滤器进行浓缩、透析，后浓缩至蛋白浓度60～80g/L，调整pH至4.80～5.10，添加山梨醇，山梨醇添加量为40～60g/L，用注射用水调整的蛋白浓度在40～60g/L；
⑦组分Ⅱ加温提纯：将步骤⑥中的溶液温度升至51～53℃恒温3小时，恒温结束后降至室温；
⑧纯化：用0.01M的磷酸氢二钠缓冲液稀释溶液，校正溶液pH5.10～5.20，降温至0～1℃，加入95％乙醇至乙醇浓度14％～15％，加入NaCl使其含量为1.5～1.8g/L，继续降温至-4.0℃～-5.0℃，静置上清液抽至反应罐中，压滤，收集压滤液；
⑨超滤透析：将压滤液用7～8倍2～8℃注射用水连续透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L，再进行病毒灭活步骤后，即可进行除菌分装。
本发明方法先进，工艺简单，可以有效的从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中分离出组分Ⅱ进而制成人免疫球蛋白成品，对缓解国内原料血浆供应紧张的局面具有十分重要的现实意义，既充分实现了对原料的充分利用，又防止了对环境的污染，经济和社会效益巨大。
作为一种生产静注人免疫球蛋白或肌注人免疫球蛋白的中间品，其质量符合以下要求：
①蛋白质含量应为60～80g/L；
②pH值应为6.0～7.0；
③残余乙醇含量：应不高于0.025％；
④人免疫球蛋白纯度：按《中国药典》(三部)(2005年版)的方法进行检测，应不低于95％；
⑤抗补体活性：按中国药典的要求进行检测，应不高于50％。
四、具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明是由以下步骤实现的：
①组分Ⅰ+Ⅲ沉淀(物)的溶解，方法是，将组分Ⅰ+Ⅲ用15倍沉淀量的5℃的0.01M磷酸氢二钠溶液充分溶解；
②组分Ⅰ分离：方法是，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节pH值为4.90～5.00，降温至0～1℃，加入95％乙醇至乙醇浓度为8.5％，复测pH值在4.90～5.10之间，搅拌反应降温至-1.8～2.2℃，搅拌反应时间为2.5小时，之后，每千升反应液中加入硅藻土4Kg和珍珠岩4Kg，搅拌30分钟，再用8.5％平衡液500L，加硅藻土4kg对压滤机上滤板循环清洗，平衡后压滤，出液温度-1.0℃～-2.0℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板35分钟，用8.5％平衡液500L清洗滤板2次，回收洗液，与压滤液合并，收集上清液，弃去沉淀；
所说的8.5％平衡液是含以体积计：乙醇8.5％、磷酸氢二钠0.005mol/L及余量为水制成，pH4.90～5.10，温度-1.5～-2.5℃的溶液；
③组分Ⅲ的分离：计量步骤②中收集的上清液体积，用1mol/L NaOH调整溶液pH为5.10～5.20，再加入95％乙醇至乙醇浓度为14％，控制温度-3℃，搅拌反应2.5小时，之后，每千升反应液中加入硅藻土3Kg和珍珠岩3Kg，搅拌30分钟，然后，用14％平衡液500L，加硅藻土5Kg对压滤机上滤板循环，用预冷洁净空气吹干滤板，平衡后压滤，出液温度-2.0℃～-3.0℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，用14％平衡液500L清洗滤板2次，回收洗液，与压滤液合并，收集上清液，弃去沉淀；
所说的14％平衡液是含以体积计：乙醇14％、磷酸氢二钠：0.005mol/L及余量为水制成，pH5.05～5.25，温度-3.0℃～-4.0℃的溶液(以下同)；
④组分II的分离：方法是，计量步骤③中收集的上清液体积，按5g/L量加入氯化钠，用0.5M氢氧化钠调pH6.80～7.20，加入95％乙醇至终乙醇浓度为18％，降温至-5.0～-6.0℃，搅拌反应2小时以上，再用18％平衡液400～600L，加硅藻土5～6Kg，对压滤机上滤板循环清洗，用预冷洁净空气吹干滤板，清洗后压滤，出液温度-3.5℃～-4.5℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，再用18％平衡液500L清洗滤板，用预冷洁净空气吹干滤板35分钟，收集压滤机上的沉淀(物)；
所说的18％平衡液是含以体积计：乙醇18％、磷酸氢二钠：0.005mol/L、氯化钠6g/L及余量为水制成，pH6.8～7.2，温度-5.0℃～-6.0℃的溶液(以下同)；
⑤组分II沉淀溶解过滤：方法是，将步骤④中收集压滤机上的沉淀物用8倍沉淀物重量的2～8℃注射用水溶解，再用pH4.0的醋酸缓冲液校正pH值至5.00～5.10，搅拌溶解5小时，板框过滤，过滤后，用2～8℃注射用水冲洗板框，冲洗液并入到过滤液中；
⑥超滤、透析、浓缩：方法是，将步骤⑤中收集的过滤液用6倍的2～8℃注射用水连续透析，透析后浓缩至蛋白浓度60～80g/L，再用0.5mol/L HCl或0.5mol/L NaOH调pH至4.90～5.00，添加山梨醇，山梨醇添加量为40～60g/L，用注射用水调整蛋白浓度为40～50g/L；
⑦组分Ⅱ加温提纯：方法是，先将步骤⑥中得到的浓度为40～50g/L的蛋白液升温至52℃，恒温3小时后，降温至室温(18～25℃)，再用0.01M的磷酸氢二钠缓冲液稀释，蛋白浓度至15～20g/L，用pH4.0缓冲液校正溶液pH至5.10～5.20，降温至0～1℃，加入95％乙醇调至乙醇在溶液中的浓度为14.5％，再加入NaCl使NaCl在溶液中的含量为1.65g/L，继续降温至-4.0～-5.0℃后，再加入珍珠岩，珍珠岩加入量为3g/L，搅拌1～2小时，静置后，抽上清液至反应罐中，再用14.5％的平衡液平衡压滤机后将上清液压滤，收集压滤液；
所说的14.5％平衡液是含以体积计：14.5％的乙醇、1.8g/L氯化钠及余量为水制成，pH为5.1～5.2，温度-4.0～-5.0℃的溶液(以下同)；
⑧超滤透析：方法是，将步骤⑦中收集的压滤液用8倍2～8℃注射用水连续透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L，病毒灭活后，分装即可。
实施例2
本发明还可由以下步骤实现：
①组分Ⅲ沉淀(物)的溶解：将组分Ⅲ沉淀(物)用15倍沉淀量的5℃的0.01M磷酸氢二钠溶液充分溶解；
②组分Ⅲ的分离：方法是，计量步骤①中溶解液的体积，用1mol/L NaOH调整溶液pH为5.10～5.20后，再加入95％乙醇，调乙醇至在溶液中的浓度为14％，在温度-2.0℃～-4.0℃搅拌反应2小时以上后，每千升反应液中加入硅藻土3Kg和珍珠岩3Kg，搅拌30分钟，用14％平衡液500L，加硅藻土5Kg对压滤机上滤板循环清洗，平衡后压滤，出液温度为-2.0℃～-3.0℃，压滤后，用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，再用14％平衡液500L清洗滤板2次，回收洗液，与压滤液合并，收集上清液，弃去沉淀物；
③组分II的分离：方法是，计量步骤②中收集的上清液体积，按5g/L量加入氯化钠，用0.5M氢氧化钠调pH6.90～7.10，加入95％乙醇至终乙醇浓度为18％，降温至-5.0～-6.0℃，搅拌反应2小时以上，再用18％平衡液500L，加硅藻土5Kg，对压滤机上滤板循环清洗，用预冷洁净空气吹干滤板，平衡后压滤，出液温度-3.5℃～-4.5℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，再用18％平衡液500L清洗滤板，用预冷洁净空气吹干滤板35分钟，收集压滤机上的沉淀(物)；
④组分II沉淀溶解过滤：方法是，将步骤③中收集压滤机上的沉淀物用8倍沉淀物重量的2～8℃注射用水溶解，再用pH4.0的醋酸缓冲液校正pH值至5.00～5.10，搅拌溶解4小时以上，板框过滤，过滤后，用2～8℃注射用水冲洗板框，冲洗液并入到过滤液中；
⑤超滤、透析、浓缩：方法是，将步骤④中收集的过滤液用6倍的2～8℃注射用水连续透析，透析后浓缩至蛋白浓度60～80g/L，再用0.5mol/L HCl或0.5mol/L NaOH调pH至4.90～5.00，添加山梨醇，山梨醇添加量为40～60g/L，用注射用水调整蛋白浓度为40～50g/L；
⑥组分Ⅱ加温提纯：方法是，先将步骤⑤中得到的浓度为40～50g/L的蛋白升温至52℃，恒温3小时后，降温至室温(18～25℃)，再用0.01M的磷酸氢二钠缓冲液稀释，蛋白浓度至15～20g/L，用pH4.0缓冲液校正溶液pH至5.10～5.20，降温至0～1℃，加入95％乙醇调至乙醇在溶液中的浓度为14.5％，再加入NaCl使NaCl在溶液中的含量为1.65g/L，继续降温至-4.0～-5.0℃后，再加入珍珠岩，珍珠岩加入量为3g/L，搅拌1～2小时，静置后，抽上清液至反应罐中，再用14.5％的平衡液平衡压滤机后将上清液压滤，收集压滤液；
⑦超滤透析：方法是，将步骤⑥中收集的压滤液用8倍2～8℃注射用水连续透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L，病毒灭活后，分装即可。
由上述情况可以看出，本发明采用多步乙醇沉淀法并通过调整离子强度、pH值、蛋白质含量、温度等参数去除杂蛋白，提纯人免疫球蛋白，多步乙醇沉淀能够有效的去除杂蛋白，减少免疫球蛋白的共沉，提高成品收率，减小免疫球蛋白的变性，增加成品的稳定性。该方法克服了亲和色谱法提取人免疫球蛋白的处理量小，填充料获得困难等缺点，是一种可以用于大规模生产的可靠方法，该发明每次投料量可达500Kg组分Ⅰ+Ⅲ，可回收人免疫球蛋白6～8Kg，能有效的降低血液制品生产中的原料血浆的成本，提高血浆的综合利用，是提取人免疫球蛋白上的创造，具有巨大的经济和社会效益。
Claims (3)
1.一种从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，其特征在于，由以下步骤实现：
①组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ沉淀的溶解；
②去除组分Ⅰ：调整溶解液pH至4.8～5.1，降温，加入乙醇至乙醇浓度为8～9％，复测并校正pH至4.8～5.1，搅拌反应降温至-2.0℃～2.5℃，之后，每千升反应液中加入硅藻土4kg和珍珠岩4kg，搅拌反应，之后，压滤分离组分Ⅰ，收集上清液弃去沉淀；
③组分Ⅲ的分离：计量上清液体积，调整上清液pH5.05～5.25，加入乙醇至乙醇浓度为13～15％，调整加乙醇后的溶液pH5.05～5.25，控制温度-2.0℃～-4.0℃，搅拌反应2小时以上，之后，每千升反应液中加入硅藻土3kg和珍珠岩3kg，搅拌后，压滤分离组分Ⅲ，收集上清液，弃去沉淀；
④组分II的分离：计量上清液体积，加入氯化钠至浓度4.5～5.5g/L，调pH6.8～7.2，加入95％乙醇至乙醇浓度为17～19％，降温至-5.0～-6.0℃，搅拌反应2小时以上，压滤分离组分Ⅱ，收集压滤机上的沉淀；
⑤组分II沉淀溶解过滤：组分Ⅱ沉淀用5～10倍沉淀重量2～8℃注射用水溶解，校正pH值至4.9～5.2，溶解后板框过滤；
⑥超滤、透析、浓缩：过滤液用截流分子量为50KD超滤器进行浓缩、透析，后浓缩至蛋白浓度60～80g/L，调整pH至4.80～5.10，添加山梨醇，山梨醇添加量为40～60g/L，用注射用水调整的蛋白浓度在40～60g/L；
⑦组分Ⅱ加温提纯：将步骤⑥中的溶液温度升至51～53℃恒温3小时，恒温结束后降至室温；
⑧纯化：用0.01M的磷酸氢二钠缓冲液稀释溶液，校正溶液pH5.10～5.20，降温至0～1℃，加入95％乙醇至乙醇浓度14％～15％，加入NaCl使其含量为1.5～1.8g/L，继续降温至-4.0℃～-5.0℃，静置上清液抽至反应罐中，压滤，收集压滤液；
⑨超滤透析：将压滤液用7～8倍2～8℃注射用水连续透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L，再进行病毒灭活步骤后，即可进行除菌分装。
2.根据权利要求1所述的从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，其特征在于，由以下步骤实现：
①组分Ⅰ+Ⅲ沉淀的溶解，方法是，将组分Ⅰ+Ⅲ用15倍沉淀量的5℃的0.01M磷酸氢二钠溶液充分溶解；
②组分Ⅰ分离：方法是，用pH值为4.0的醋酸缓冲液调节pH值为4.90～5.00，降温至0～1℃，加入95％乙醇至乙醇浓度为8.5％，复测pH值在4.90～5.10之间，搅拌反应降温至-1.8～2.2℃，搅拌反应时间为2.5小时，之后，每千升反应液中加入硅藻土4Kg和珍珠岩4Kg，搅拌30分钟，再用8.5％平衡液500L，加硅藻土4kg对压滤机上滤板循环清洗，平衡后压滤，出液温度-1.0℃～-2.0℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板35分钟，用8.5％平衡液500L清洗滤板2次，回收洗液，与压滤液合并，收集上清液，弃去沉淀；
所说的8.5％平衡液是含以体积计：乙醇8.5％、磷酸氢二钠0.005mol/L及余量为水制成，pH4.90～5.10，温度-1.5～-2.5℃的溶液；
③组分Ⅲ的分离：计量步骤②中收集的上清液体积，用1mol/L NaOH调整溶液pH为5.10～5.20，再加入95％乙醇至乙醇浓度为14％，控制温度-3℃，搅拌反应2.5小时，之后，每千升反应液中加入硅藻土3Kg和珍珠岩3Kg，搅拌30分钟，然后，用14％平衡液500L，加硅藻土5Kg对压滤机上滤板循环，用预冷洁净空气吹干滤板，平衡后压滤，出液温度-2.0℃～-3.0℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，用14％平衡液500L清洗滤板2次，回收洗液，与压滤液合并，收集上清液，弃去沉淀；
所说的14％平衡液是含以体积计：乙醇14％、磷酸氢二钠：0.005mol/L及余量为水制成，pH5.05～5.25，温度-3.0℃～-4.0℃的溶液；
④组分II的分离：方法是，计量步骤③中收集的上清液体积，按5g/L量加入氯化钠，用0.5M氢氧化钠调pH6.80～7.20，加入95％乙醇至终乙醇浓度为18％，降温至-5.0～-6.0℃，搅拌反应2小时以上，再用18％平衡液400～600L，加硅藻土5～6Kg，对压滤机上滤板循环清洗，用预冷洁净空气吹干滤板，清洗后压滤，出液温度-3.5℃～-4.5℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，再用18％平衡液500L清洗滤板，用预冷洁净空气吹干滤板35分钟，收集压滤机上的沉淀；
所说的18％平衡液是含以体积计：乙醇18％、磷酸氢二钠：0.005mol/L、氯化钠6g/L及余量为水制成，pH6.8～7.2，温度-5.0℃～-6.0℃的溶液；
⑤组分II沉淀溶解过滤：方法是，将步骤④中收集压滤机上的沉淀物用8倍沉淀物重量的2～8℃注射用水溶解，再用pH4.0的醋酸缓冲液校正pH值至5.00～5.10，搅拌溶解5小时，板框过滤，过滤后，用2～8℃注射用水冲洗板框，冲洗液并入到过滤液中；
⑥超滤、透析、浓缩：方法是，将步骤⑤中收集的过滤液用6倍的2～8℃注射用水连续透析，透析后浓缩至蛋白浓度60～80g/L，再用0.5mol/L HCl或0.5mol/L NaOH调pH至4.90～5.00，添加山梨醇，山梨醇添加量为40～60g/L，用注射用水调整蛋白浓度为40～50g/L；
⑦组分Ⅱ加温提纯：方法是，先将步骤⑥中得到的浓度为40～50g/L的蛋白液升温至52℃，恒温3小时后，降温至18～25℃，再用0.01M的磷酸氢二钠缓冲液稀释，蛋白浓度至15～20g/L，用pH4.0缓冲液校正溶液pH至5.10～5.20，降温至0～1℃，加入95％乙醇调至乙醇在溶液中的浓度为14.5％，再加入NaCl使NaCl在溶液中的含量为1.65g/L，继续降温至-4.0～-5.0℃后，再加入珍珠岩，珍珠岩加入量为3g/L，搅拌1～2小时，静置后，抽上清液至反应罐中，再用14.5％的平衡液平衡压滤机后将上清液压滤，收集压滤液；
所说的14.5％平衡液是含以体积计：14.5％的乙醇、1.8g/L氯化钠及余量为水制成，pH为5.1～5.2，温度-4.0～-5.0℃的溶液；
⑧超滤透析：方法是，将步骤⑦中收集的压滤液用8倍2～8℃注射用水连续透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L，病毒灭活后，分装即可。
3.根据权利要求1所述的从组分Ⅰ+Ⅲ或组分Ⅲ中提取人免疫球蛋白的方法，其特征在于，由以下步骤实现：
①组分Ⅲ沉淀的溶解：将组分Ⅲ沉淀用15倍沉淀量的5℃的0.01M磷酸氢二钠溶液充分溶解；
②组分Ⅲ的分离：方法是，计量步骤①中溶解液的体积，用1mol/L NaOH调整溶液pH为5.10～5.20后，再加入95％乙醇，调乙醇至在溶液中的浓度为14％，在温度-2.0℃～-4.0℃搅拌反应2小时以上后，每千升反应液中加入硅藻土3Kg和珍珠岩3Kg，搅拌30分钟，用14％平衡液500L，加硅藻土5Kg对压滤机上滤板循环清洗，平衡后压滤，出液温度为-2.0℃～-3.0℃，压滤后，用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，再用14％平衡液500L清洗滤板2次，回收洗液，与压滤液合并，收集上清液，弃去沉淀物；
③组分II的分离：方法是，计量步骤②中收集的上清液体积，按5g/L量加入氯化钠，用0.5M氢氧化钠调pH6.90～7.10，加入95％乙醇至终乙醇浓度为18％，降温至-5.0～-6.0℃，搅拌反应2小时以上，再用18％平衡液500L，加硅藻土5Kg，对压滤机上滤板循环清洗，用预冷洁净空气吹干滤板，平衡后压滤，出液温度-3.5℃～-4.5℃，压滤完后用预冷洁净空气吹干滤板15分钟，再用18％平衡液500L清洗滤板，用预冷洁净空气吹干滤板35分钟，收集压滤机上的沉淀；
④组分II沉淀溶解过滤：方法是，将步骤③中收集压滤机上的沉淀物用8倍沉淀物重量的2～8℃注射用水溶解，再用pH4.0的醋酸缓冲液校正pH值至5.00～5.10，搅拌溶解4小时以上，板框过滤，过滤后，用2～8℃注射用水冲洗板框，冲洗液并入到过滤液中；
⑤超滤、透析、浓缩：方法是，将步骤④中收集的过滤液用6倍的2～8℃注射用水连续透析，透析后浓缩至蛋白浓度60～80g/L，再用0.5mol/L HCl或0.5mol/L NaOH调pH至4.90～5.00，添加山梨醇，山梨醇添加量为40～60g/L，用注射用水调整蛋白浓度为40～50g/L；
⑥组分Ⅱ加温提纯：方法是，先将步骤⑤中得到的浓度为40～50g/L的蛋白升温至52℃，恒温3小时后，降温至18～25℃，再用0.01M的磷酸氢二钠缓冲液稀释，蛋白浓度至15～20g/L，用pH4.0缓冲液校正溶液pH至5.10～5.20，降温至0～1℃，加入95％乙醇调至乙醇在溶液中的浓度为14.5％，再加入NaCl使NaCl在溶液中的含量为1.65g/L，继续降温至-4.0～-5.0℃后，再加入珍珠岩，珍珠岩加入量为3g/L，搅拌1～2小时，静置后，抽上清液至反应罐中，再用14.5％的平衡液平衡压滤机后将上清液压滤，收集压滤液；
⑦超滤透析：方法是，将步骤⑥中收集的压滤液用8倍2～8℃注射用水连续透析，浓缩至蛋白浓度60～80g/L，病毒灭活后，分装即可。
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