CN111499736B - 一种静注covid-19人免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种静注COVID‑19人免疫球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)COVID‑19康复者恢复期血浆、或经新型冠状病毒疫苗(SARS‑CoV‑2疫苗)免疫的健康人血浆、或经病毒灭活后的康复者恢复期血浆或免疫血浆；(2)低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀(FⅡ沉淀)；(3)组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤；(4)超滤液经配制、除菌过滤后得COVID‑19人免疫球蛋白(IgG)原液，原液经低pH孵放、纳滤、除菌过滤分装后，即得所述静注COVID‑19人免疫球蛋白。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一种静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019，COVID-19)是一种由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)感染引起的急性传染性疾病。SARS-CoV-2是具有包膜的单股正链RNA病毒，冠状病毒科β属的冠状病毒，是目前感染人类冠状病毒家族中的第七个成员，主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播，也可能通过气溶胶和消化道粪-口等途径传播。 COVID-19临床以发热、干咳、乏力为主要表现，部分患者可出现呼吸困难、腹泻等症状，可进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克和出凝血功能障碍等症状，严重者可致患者死亡。
各国正在开展COVID-19的治疗药物和抗病毒疫苗的临床实验。根据COVID-19临床症状分为：轻型、普通型、重型以及危重型四种类型。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第六版)》中，康复者恢复期血浆治疗正式列为重型和危重型病例的治疗方法，主要适用于病情进展较快、重症和危重症新冠肺炎患者。
COVID-19康复者恢复期血浆中存在较高滴度SARS-CoV-2特异性免疫球蛋白，能够中和新型冠状病毒，是治愈COVID-19患者关键所在。静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)含有高效价SARS-CoV-2中和抗体，其对SARS-CoV-2感染者治疗的作用机制包括：
(1)抗SARS-CoV-2中和抗体中和体内SARS-CoV-2病毒，使其失去感染性，缓解病毒对机体损伤；参与体液免疫和细胞免疫；
(2)IgG封闭了巨噬细胞Fc受体抑制炎症介质释放，减轻炎症反应；
(3)激活补体促进细胞吞噬功能，有效地抵抗病毒严重感染；
(4)含有多种抗体形成的复杂免疫网络，具有免疫替代和免疫调节的双重作用。
从COVID-19康复者恢复期血浆中提取制备静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)，避免直接使用 COVID-19康复者恢复期血浆进行临床治疗需要进行血型配型试验，并且是纯度高、贮存运输使用更高效的制品。抗体谱广，对抗其它致病原，缓解并发症。
本发明提供的静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)的制备工艺，不仅能够为COVID-19的治疗提供特异性的药物和将来作为制备产业化的COVID-19人免疫球蛋白的技术储备，制备的制品可以在患者救治及高风险人群的预防中发挥作用。减轻民众对COVID-19的恐慌、畏惧，对稳定社会具有十分重要的意义
发明内容
本发明首先涉及一种静注COVID-19人免疫球蛋白(IgG)的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)血浆原料包括：COVID-19康复者恢复期血浆(或经病毒灭活后)、经新型冠状病毒疫苗 (SARS-CoV-2疫苗)免疫的健康人血浆；
(2)低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀(FⅡ沉淀)；
(3)组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤；
(4)超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液；
(5)所述人免疫球蛋白原液经低pH孵放、纳滤(滤膜孔径20nm)、除菌过滤后，分装即得所述静注 COVID-19人免疫球蛋白。
步骤(2)所述低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀的步骤如下：
1)醋酸缓冲液调整血浆pH值至5.97±0.50，缓慢加入95％乙醇至乙醇浓度20％，乙醇处理温度控制在-4.0±2.0℃，搅拌至少2小时，处理完毕后以小于0.2MPa压滤得组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分I+Ⅱ+Ⅲ上清，其中组分I+Ⅱ+Ⅲ上清经处理后废弃或冻存以备用；优选的，调整血浆pH值时，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟，最优选的，醋酸缓冲液的添加速度为：每千克血浆2ml/分钟。
2)用组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀重量10～30倍注射用水的溶解并稀释组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀，调整pH至5.30±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度14％，乙醇处理反应温度控制在-2.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后的上清为组分I+Ⅲ上清，沉淀为组分I+Ⅲ沉淀，其中组分I+Ⅲ沉淀经处理后废弃；
3)加入组分I+Ⅲ上清重量的1/40～1/60的1mol/L氯化钠溶液量，用1mol/L碳酸氢钠调整pH至7.20±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度25％，乙醇处理反应温度控制在-6.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后沉淀为组分Ⅱ沉淀，上清为组分Ⅱ上清，组分Ⅱ上清经处理后废弃；
步骤(3)所述的组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤的步骤为：
1)用组分Ⅱ沉淀的3至10倍量的注射用水使组分Ⅱ沉淀充分溶解，用1mol/L HCL调整至pH 4.1±0.3，随后反应液温度控制控制在0～4℃内，搅拌至少2小时，用深层滤器控制滤过压力小于0.2MPa的条件下过滤，收集澄清液；
2)选用孔径30kD或50kD的超滤膜，用5～10个制品体积的注射用水进行超滤透析，超滤液温度控制在0～15℃，超滤后控制蛋白含量在50～60g/L，pH控制在4.1±0.3；
步骤(4)所述的超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液的步骤为：
1)原液配制：在超滤后滤液中加入麦芽糖，麦芽糖含量为90～110g/L；
2)蛋白原液除菌过滤后制品得COVID-19人免疫球蛋白(IgG)原液。
3)原液经低pH孵放、纳滤(滤膜孔径20nm)、除菌过滤后，分装即得所述静注COVID-19人免疫球蛋白。
本发明还涉及以所述的静注COVID-19人免疫球蛋白(IgG)的制备方法制备获得的抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白(IgG)产品。
本发明还涉及所述的静注COVID-19人免疫球蛋白(IgG)的制备方法在制备抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白(IgG)产品中的应用。
附图说明
图1、静注COVID-19人免疫球蛋白制品纯度检测(醋酸纤维素薄膜电泳法)
图2、静注COVID-19人免疫球蛋白制品的分子大小(HPLC)
图3、静注COVID-19人免疫球蛋白制备工艺流程图
具体实施方式
主要缓冲液配方
1、醋酸缓冲液：配制10㎏ pH4.0醋酸-醋酸钠溶液计算，所需醋酸钠量1.089㎏，冰醋酸量为2.4L，补加注射用水至10kg；
2、1mol/L氯化钠：配制10㎏ 1mol/L氯化钠溶液计算，所需氯化钠量0.585㎏，补加注射用水至10kg；
3、1mol/L碳酸氢钠：按配制10㎏ 1mol/L碳酸氢钠溶液计算，所需碳酸氢钠量：0.84㎏，补加注射用水至10kg。
4、1mol/L HCL：配制10.0L 1.0mol/LHCL，所需HCL量为834ml，补加注射用水至10L；
实施例1、静注COVID-19人免疫球蛋白制品的制备
1、将COVID-19康复者恢复期血浆经亚甲蓝光化学法病毒灭活，将灭活血浆过滤至血浆储存袋内即为原料血浆，冰冻保存或直接进行后续的低温乙醇制备工作。
2.20％乙醇处理血浆样本得组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀：
2.1pH值：测定血浆原pH值，用醋酸缓冲液调整血浆pH值至5.97±0.50，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟。
2.2预处理乙醇浓度：缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度20％。
2.3乙醇处理反应温度：反应温度控制在-4.0±2.0℃，搅拌至少2小时。
2.4压滤：压滤后沉淀为组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀，上清为组分I+Ⅱ+Ⅲ上清，控制压滤过程的压力小于0.2MPa；其中组分I+Ⅱ+Ⅲ上清经处理后废弃或冻存以备用。
在本方法的初试阶段，制备的人免疫球蛋白原液中IgG分子分布集中度较低，单体与二聚体的和约为 97.5％(初试时，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度8ml/min)，药典要求IgG单体与二聚体含量之和应不低于 95.0％，数据虽达标，但仍有提升空间；
经全流程优化后，测试结果显示，在20％乙醇处理原料血浆的步骤中，酸碱缓冲液添加速度对制品中 IgG分子分布集中度分布影响最大。由此，最终确定本体系下，20％乙醇低温处理原料血浆的步骤中，每千克血浆醋酸缓冲液加入速度应小于3ml/分钟，优选为2ml/分钟。
检测结果显示：按优选方案制备的静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)分子大小分布99.33％，其他各项质量指标均符合国家药典标准(见后文实施例2部分)。
3. 14％乙醇处理组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀得组分I+Ⅲ上清：
3.1组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀的溶解：用沉淀重量10～30倍注射用水稀释，调整pH至5.30±0.50。
3.2乙醇浓度：缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度14％。
3.3温度：反应温度控制在-2.0±2.0℃，搅拌至少2小时。
3.4压滤：压滤后的上清为组分I+Ⅲ上清，沉淀为组分I+Ⅲ沉淀，控制压滤过程的压力小于0.2MPa；其中组分I+Ⅲ沉淀经处理后废弃。
4. 25％乙醇处理组分I+Ⅲ上清得组分Ⅱ沉淀
4.1 1mol/L氯化钠量：加入1mol/L氯化钠溶液量为组分I+Ⅲ上清重量的1/40～1/60。
4.2 pH值：测定上清液pH值，用1mol/L碳酸氢钠调整pH至7.20±0.50。
4.3乙醇浓度：缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度25％。
4.4温度：反应温度控制在-6.0±2.0℃，搅拌至少2小时。
4.5压滤：压滤后沉淀为组分Ⅱ沉淀，上清为组分Ⅱ上清，控制压滤过程的压力小于0.2MPa；组分Ⅱ上清经处理后废弃。
5.组分Ⅱ沉淀的精制过滤：
5.1组分Ⅱ沉淀的溶解：注射用水量为组分Ⅱ沉淀的3至10倍，搅拌使组分Ⅱ沉淀充分溶解。
5.2pH值：测其溶解液pH值，用1mol/L HCL调整至pH 4.1±0.3，
5.3温度：反应液温度控制控制在0～4℃内。
5.3组分II深滤：用深层滤器过滤，收集澄清液，控制滤过压力小于0.2MPa。
6.超滤：
6.1超滤膜：选用孔径30kD或50kD的超滤膜。
6.2超滤：用5～10个制品体积的注射用水进行超滤透析，超滤液温度控制在0～15℃，超滤后蛋白含量在50～60g/L，pH控制在4.1±0.3。
6.3原液配制：在超滤后滤液中加入辅料麦芽糖，含量应为90～110g/L，复测pH应为4.1±0.3，蛋白含量应为50～60g/L。
7、原液低pH孵放、纳滤、除菌过滤及分装：
超滤后的蛋白原液用不超过0.22微米的微孔滤膜(绝对孔径)除菌过滤，除菌过滤后制品即为原液，即完成静注COVID-19人免疫球蛋白(pH4)制品原液的制备。
随后将所述静注COVID-19人免疫球蛋白制品原液依次经过低pH孵放(pH4.1±0.3、24℃±1℃、21天)、纳米膜过滤(滤膜孔径小于20nm)、除菌过滤及分装，即得所述静注COVID-19人免疫球蛋白制品。
实施例二、静注COVID-19人免疫球蛋白的质量检定
1、原液SARS-CoV-2中和抗体效价
静注COVID-19人免疫球蛋白原液(pH4)含SARS-CoV-2中和抗体，对于阻断病毒入侵细胞起主要作用。SARS-CoV-2中和抗体效价情况，体现了其抑制病毒入侵细胞的能力，是静注COVID-19人免疫球蛋白 (pH4)的质量控制重要指标。
通过中和试验，检测市售静注人免疫球蛋白(pH4)、原料混合血浆及实施例1制备的静注COVID-19 人免疫球蛋白原液(pH4)的SARS-CoV-2中和抗体效价。具体结果如表1：
表1 SARS-CoV-2中和抗体效价
采用中和试验，静注COVID-19人免疫球蛋白原液(pH4)的SARS-CoV-2中和抗体价为1879。结果显示，本方法制备的静注COVID-19人免疫球蛋白制品(pH4)具有较高的SARS-CoV-2中和抗体效价，表明其能在抵抗病毒入侵中发挥显著效果。
2、制品蛋白纯度及分子大小分布
蛋白纯度、分子大小分布是评价人免疫球蛋白类制品蛋白质量的关键性指标。采用本方法制备的静注 COVID-19人免疫球蛋白制品，检测其纯度及分子大小分布。检测结果如图1、图2所示。
图1为静注COVID-19人免疫球蛋白制品的醋酸纤维素薄膜电泳结果，结果显示，采用本方法制备的人免疫球蛋白制品，蛋白纯度为97.3％，高于国家药典标准；
图2为静注COVID-19人免疫球蛋白制品的HPLC图谱，结果显示，原液中，IgG单体为99.2％，高于国家药典标准。
最后需要补充的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)血浆原料包括：COVID-19康复者恢复期血浆、或经新型冠状病毒疫苗(SARS-CoV-2疫苗)免疫后的健康人血浆、或经病毒灭活后的康复血浆或免疫血浆；
(2)低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀；
(3)组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤；
(4)超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白原液；
(5)所述人免疫球蛋白原液依次经低pH孵放、纳滤、除菌过滤后，分装即得所述静注COVID-19人免疫球蛋白；
步骤(2)所述低温乙醇法梯度处理灭活血浆得组分Ⅱ沉淀的步骤如下：
1)醋酸缓冲液调整血浆pH值至5.97±0.50，缓慢加入95％乙醇至乙醇浓度20％，乙醇处理温度控制在-4.0±2.0℃，搅拌至少2小时，处理完毕后以小于0.2MPa压滤得组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ上清，其中组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ上清经处理后废弃或冻存以备用；
2)用组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀重量10～30倍注射用水的溶解并稀释组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，调整pH至5.30±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度14％，乙醇处理反应温度控制在-2.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后的上清为组分Ⅰ+Ⅲ上清，沉淀为组分Ⅰ+Ⅲ沉淀，其中组分Ⅰ+Ⅲ沉淀经处理后废弃；
3)加入组分Ⅰ+Ⅲ上清重量的1/40～1/60的1mol/L氯化钠溶液量，用1mol/L碳酸氢钠调整pH至7.20±0.50，缓慢加入95％乙醇，至乙醇浓度25％，乙醇处理反应温度控制在-6.0±2.0℃，搅拌至少2小时，反应完毕后以小于0.2MPa的压力压滤，压滤后沉淀为组分Ⅱ沉淀，上清为组分Ⅱ上清，组分Ⅱ上清经处理后废弃；
步骤(3)所述的组分Ⅱ沉淀溶解、精制过滤后超滤的步骤为：
1)用组分Ⅱ沉淀的3至10倍量的注射用水使组分Ⅱ沉淀充分溶解，用1mol/L HCL调整至pH 4.1±0.3，随后反应液温度控制控制在0～4℃内，搅拌至少2小时，用深层滤器控制滤过压力小于0.2MPa的条件下过滤，收集澄清液；
2)选用孔径30kD或50kD的超滤膜，用5～10个制品体积的注射用水进行超滤透析，超滤液温度控制在0～15℃，超滤后控制蛋白含量在50～60g/L，pH控制在4.1±0.3。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，调整血浆pH值时，醋酸缓冲液的添加速度为：每千克血浆2ml/分钟。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的超滤液经配置、除菌过滤后得COVID-19人免疫球蛋白原液的步骤为：
1)原液配制：在超滤后滤液中加入麦芽糖，麦芽糖含量为90～110g/L；
2)蛋白原液除菌过滤后制品即为COVID-19人免疫球蛋白原液。
4.权利要求1-3任一所述的静注COVID-19人免疫球蛋白的制备方法制备获得的抗COVID-19病毒的人免疫球蛋白产品。
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