CN104231075A - 一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征是制备工艺如下：采用高于标准的血浆，通过低温乙醇法及压滤法分离得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，经溶解、压滤得到精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，再经溶解、调整反应参数、压滤、深层过滤、超滤、透析步骤，调整蛋白液参数，使用DEAE SepharoseFastFlow弱阴离子交换凝胶进行上柱层析纯化，经超滤、调整pH为4.05～4.15，加入麦芽糖作为保护剂；经低pH孵放病毒灭活及DV20滤芯除病毒，二次超滤，控制麦芽糖残留量不高于2g/L，再加入甘氨酸作为保护剂等，制备出纯度在99.0%以上、IgG单体及二聚体总含量在98.0%以上、效价不低于100IU/ml的特异性乙型肝炎人免疫球蛋白。本发明收得率较传统低温乙醇法可提高7.5~10%。

Description

一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，属于生物制药领域。

背景技术

乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）是由乙型肝炎疫苗免疫健康献浆员采集的乙型肝炎表面抗体效价较高的血浆，经分离、提纯、病毒灭活而制备的特异性免疫球蛋白，具有特异性被动免疫作用，能够中和体内表面抗原并将病毒清除。

乙型肝炎人免疫球蛋白在临床上可从以下几方面发挥重要的功能：1、阻断乙肝母婴垂直传播。乙型肝炎病毒可经母婴垂直传播感染新生儿，大多数婴儿是在分娩过程中吸入母血、羊水或阴道分泌物受到感染。婴儿一旦感染乙肝病毒，80～90%会成为慢性携带者。因此，阻断乙肝病毒的母婴传播非常重要。产前和产后用HBIG联合阻断HBsAg、HBeAg阳性孕妇的母婴传播，其有效保护率达到94%，能明显减少宫内感染的发生，获得目前最大限度的提高对HBsAg、HBeAg阳性母亲HBV母婴传播的阻断作用。2、预防特殊情况下的乙肝病毒感染。乙肝易感者在某种场合意外地遇到乙肝病毒感染的危险时，可以单独使用乙肝免疫球蛋白。例如医生、护士和检验人员等在给乙肝表面抗原携带者做治疗、护理或取血检验过程中，不慎手指被针尖刺破，或被手术刀割伤，患者带有乙肝病毒的血液就可以通过皮肤创伤进入上述人员的体内。在这种情况下，应立即（12h之内）给受感染人员静注乙肝免疫球蛋白1支，1个月后再重复注射1次，可起到预防感染的效果。3、能够显著提高肝移植患者的存活率和存活期。肝癌早期患者在肝移植手术后，必须长期使用人乙肝免疫球蛋白。如果没有，三个月就会感染，一年就会死亡。而在术后联合使用静注人乙肝免疫球蛋白和拉米呋定，再感染率就可从30~40%降至5~10%，大幅度提高肝移植患者的存活率和存活期。另外HBIG还有预防输血后乙型肝炎病毒感染及治疗慢性乙肝病毒携带者的功效。

目前市场上主要存在两种剂型的乙型肝炎人免疫球蛋白，分别是静脉滴注HBIG及肌肉注射HBIG，但是临床使用静脉滴注HBIG产生的不良反应明显要高一些。静脉滴注HBIG有可能发生恶心、皮疹、风疹、红斑、关节病、注射部位疼痛和过敏，用抗组胺药物和普通止痛药配合使用，能有效控制以上症状。相关报道证实，肝移植术后在给予静滴HBIG的第3天，患者出现偏执、说话困难，但神经检查正常。2d后，虽然理解力正常，但说话变得缓慢并含糊不清。9d后出现双手震颤等症状。查验汞浓度，发现已高出正常水平10倍。

现有技术中如《静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备方法》CN200810302536.3，该方法包括融化血浆、组分分离、过滤、沉淀溶解、滤液沉淀、层析、超滤、病毒灭活、成品配制及分装等步骤。该方法制备的注射用乙型肝炎人免疫球蛋白相对而言，质量好、收率与纯度高、病毒安全性高，具有广阔的应用前景。

目前随着HBIG在临床方面的广泛应用，该制品的需求逐年增多。近几年，虽然有不少单克隆抗体、基因工程抗体，包括人源化抗体、小分子抗体的研制开发，但由于基因工程抗体是一种新开发的技术，现在仅用于临床诊断和肿瘤治疗，此种抗体的效果如何，有待实践来证实。因此，人源特异性免疫球蛋白（包括HBIG）仍然是一种简便易行且有实用价值的特异性制剂。今后相当长的时期内，临床上仍将主要使用由人源血分离的天然血液制品。同时能够大大地提高血液制品的附加值，综合利用率得到进一步的提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用低温乙醇法结合层析法，制备出纯度在99%以上、IgG单体及二聚体总含量在98.0%以上、效价不低于100IU/ml的特异性乙型肝炎人免疫球蛋白。

本发明的目的是这样实现的：采用乙型肝炎疫苗免疫健康献浆员后采集的乙型肝炎表面抗体效价较高的血浆，血浆通过低温乙醇法及压滤法分离得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，经溶解、压滤得到精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，再经溶解、调整反应参数、压滤、深层过滤、超滤、透析步骤，调整蛋白液参数至蛋白浓度为3～6%，pH为6.4～6.6，电导率为0.175～0.205s/m，使用DEAE  Sepharose Fast Flow弱阴离子交换凝胶进行上柱层析纯化，经超滤、调整pH为4.05～4.15，加入麦芽糖作为保护剂；经低pH孵放病毒灭活及DV20滤芯除病毒，二次超滤，控制麦芽糖残留量不高于2g/L，加入甘氨酸作为保护剂，调整pH为6.6～7.2、抗-HBs效价≥100IU/ml，稀配、分装、灯检、包装、入库。

本发明是在传统免疫球蛋白的制备工艺的基础上，以乙型肝炎表面抗体效价较高的血浆为原料，提取过程中采用压滤法代替离心法，增加一步精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，采用弱阴离子交换层析技术，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度；针对临床需求，选择甘氨酸作为保护剂，麦芽糖含量控制在很低的范围内，既可以应用于一般乙型肝炎患者，又可以应用于糖尿病乙型肝炎患者；制备出纯度在99.0%以上、IgG单体及二聚体总含量在98.0%以上、效价不低于100IU/ml的特异性乙型肝炎人免疫球蛋白。

优选方案为：

按《中国药典》2010年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原料血浆，在预融间，用75%乙醇消毒、再用低于35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋。破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-HBs和微生物限度等检查；经过滤或离心，离心速度控制在4Kg/min/台，出液温度控制在0～4℃，分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产。去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、细菌内毒素检测，输送至蛋白分离反应罐或（输送至PCC吸附罐升温至10～20℃进行凝胶吸附，吸附物用于PCC生产）。将血浆的温度控制在1～3℃之间，取样滴定计算需加pH 4.0缓冲液量，按不超过1.0升/分钟的流速加入缓冲液调节pH值为6.80～7.00；加-15℃以下的95％或50％乙醇，流速不超过1.5升/分，使乙醇终浓度至8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值应为6.80～7.20。搅拌30分钟以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4Kg/min/台，出液温度控制在-1～-3℃，离心得组分I沉淀和组分I上清液。组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产。

组分I上清液取样进行滴定，计算需加pH 4.0缓冲液量，控制流速不超过1.0升/分钟，加入缓冲液调节pH值为6.80～6.85；加-15℃以下的95％乙醇至乙醇浓度为20％（V/V），温度控制在-4～-6℃；加完乙醇后pH应为6.80～7.00。搅拌120分钟以上后，静置60分钟以上，开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，上清液继续人血白蛋白生产。

接取10～15倍组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L。开启搅拌，降温至3℃～5℃时，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解。待沉淀完全溶解，取样用pH 4.0醋酸缓冲液滴定至pH5.80～5.85，计算缓冲液消耗量并折算反应液所需总缓冲液用量。在搅拌过程中以≤0.5升/分钟的流量缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.80～5.85，反应液温度为0～-1℃，加完缓冲液，继续搅拌至少10分钟。开启制冷循环，加-15℃以下的95%乙醇，控制流速≤1.5升/分钟，使反应液最终的乙醇浓度为19%。反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤。先用-4℃以下的压缩空气缓慢吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10分钟以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀。

接取10～15倍精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01 mol/L。开启搅拌，降温至2～4℃时，将精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解。待沉淀完全溶解，取样用pH 4.0醋酸缓冲液滴定至pH5.17～5.23，计算缓冲液消耗量并折算反应液所需总缓冲液用量。在搅拌过程中以≤0.5升/分钟的流量缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.17～5.23，反应液温度为0～-1℃，加完缓冲液，继续搅拌至少10分钟。开启制冷循环，加-15℃以下的95%乙醇，控制流速≤1.5升/分钟，使反应液最终的乙醇浓度为17%。反应液最终温度控制在-5～-7℃，pH为5.24～5.30，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤。先用-5℃以下的压缩空气缓慢吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10分钟以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为-5～-7℃，过滤压力不超过0.2 Mpa。

压滤液上清计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为-5～-7℃，进行深层过滤，过滤出液温度控制在-5～-7℃，过滤后用1.0mol/L的HCl调节pH为3.97～4.05，输入超滤透析罐中进行下道工序的脱醇、纯化。

开始超滤，浓缩至5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析。将蛋白浓度调整至3～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.4～6.6，然后加1.0mol/L磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.175～0.205 s/m（T=19℃时测），调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化，层析使用DEAE Sepharose Fast Flow（弱阴离子交换凝胶）填料。层析完毕用1.0 mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，开启超滤机浓缩至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，使乙醇含量≤0.025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将计算量的麦芽糖加入蛋白液内，用1.0 mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10±1%，pH为4.05～4.15，蛋白含量5.5±0.5％。若不能及时稀配时应密闭存放于2～8℃环境，并在6小时内稀配完毕。

配制后的蛋白液应在6小时进行除菌过滤，并应在6小时内除菌过滤完毕。除菌过滤后制品放置在低pH孵放室，经24±1℃低pH孵放21天。低pH孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤，如未及时进行除病毒过滤，应存放2～8℃环境，存放时间不得超过3天。除病毒过滤后，用2～8℃的0.85%NaCL溶液超滤，进行五倍等体积洗涤，洗涤结束后浓缩、稀配，调整甘氨酸为26～30g/L，调整制品pH值为6.6～7.2，抗-HBs效价≥100IU/ml。

二次超滤、稀配后蛋白液经0.2μm除菌滤器过滤、分装，分装时间不得超过8小时，超过8小时分装的制品应做亚批号。二次超滤、稀配后，如未及时进行分装，应存放2～8℃环境，存放时间不得超过14天。分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库。

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠。

组分I上清液及其沉淀，组分Ⅱ+Ⅲ上清液及其沉淀均为所属技术领域的通用分类方法；在本发明中也是按通用分类方法分类后物质的名称，并不是指单纯的序号。

通过人血浆经离心分离冷沉淀，分离后的离心上清液通过调节pH及温度，添加乙醇再离心得组分I上清液及其沉淀；

通过对组分I上清液调节pH及温度，添加乙醇再压滤得组分Ⅱ+Ⅲ上清液及其沉淀；

组分I沉淀主要含有纤原、FV Ⅲ、Ciq、Clr、Cls和纤维结合蛋白等；

组分I上清液主要含有：白蛋白、IgG、IgA、IgM、F Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、α、β球蛋白、铜蓝蛋白、α1-抗胰蛋白酶、IgM、AT-Ⅲ补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等；

组分Ⅱ+Ⅲ沉淀主要含有IgG、IgA、IgM、F Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、α、β球蛋白和铜蓝蛋白等；

组分Ⅱ+Ⅲ上清液主要含有：白蛋白、α、β球蛋白、铜蓝蛋白、α1-抗胰蛋白酶、IgM、AT-Ⅲ补体成分、转铁蛋白、触珠蛋白等。

本发明的积极效果：

1、本发明中采用DV20滤芯去除病毒，能够有效的去除人类B19微小病毒，而采用传统的病毒灭活去除方法均不能有效的去除该病毒，因此，该发明方法制备的产品能显著提高临床使用的安全性，并且该方法的成功应用能为其他血液制品的病毒灭活去除提供一种新的思路。

2、本发明制备所得产品以甘氨酸作为保护剂，麦芽糖含量控制在很低的范围内（＜2g/L），适用于糖尿病患者及肾功能不全者，扩大了乙型肝炎人免疫球蛋白的临床用量及临床使用范围。同时本品具有疗效明确、安全性高、可迅速控制病情、剂量小的临床使用特点。

本发明相比现有技术乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，创新点在于： 

1、本发明中增加一步精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，调整蛋白液参数至蛋白浓度为3～6%，pH为6.4～6.6，电导率为0.175～0.205s/m，使用DEAE  Sepharose Fast Flow弱阴离子交换凝胶进行上柱层析纯化，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度，制备出纯度在99.0%以上、IgG单体及二聚体总含量在98.0%以上的静注人免疫球蛋白。

2、本发明中采用阴离子交换层析技术并通过试验得到最优的柱层析工艺参数，该工艺可生产200IU/瓶的乙型肝炎人免疫球蛋白17200瓶/吨血浆，较传统的低温乙醇法可多生产1200瓶/吨血浆，收得率较传统低温乙醇法可提高7.5~10%。

3、部分厂家采用巴氏灭活工艺灭活病毒，大大降低了Fc段活性，而本发明中采用低pH孵化放结合DV20滤芯灭活、去除病毒，该方法能有效的保护Fc段活性，提高产品的生物活性，从而提高产品临床使用的有效性。

本发明方法制备的产品与《中国药典》（2010年版，三部）中描述的乙型肝炎人免疫球蛋白在关键质量指标的对比如下表。

项目	本发明	《中国药典》（2010年版，三部）
			纯度	不低于蛋白质总量的99.0%	不低于蛋白质总量的90.0%
分子大小分布	IgG单体及二聚体含量之和应≥98.0%	IgG单体及二聚体含量之和应≥90.0%
			热稳定性	57±0.5℃4小时，肉眼观察应无凝胶化或絮状物	57±0.5℃4小时，肉眼观察应无凝胶化或絮状物
蛋白质含量	应不高于180g/L	应不高于180g/L
			麦芽糖残留量	应不高于2g/L	无此项目

附图说明

  图1为本发明工艺流程图。

图2为本发明实例1中制备出样品1的分子大小分布结果扫描图。

图3为本发明实例1中制备出样品2的分子大小分布结果扫描图。

图4为本发明实例1中制备出产品的纯度结果扫描图。

图5为本发明实例1中制备出标准品S1的麦芽糖残留量结果扫描图。

图6为本发明实例1中制备出标准品S2的麦芽糖残留量结果扫描图。

图7为本发明实例1中制备出标准品S3的麦芽糖残留量结果扫描图。

图8为本发明实例1中制备出样品1的麦芽糖残留量结果扫描图。

图9为本发明实例1中制备出样品2的麦芽糖残留量结果扫描图。

具体实施方式

本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。

实施例1：以4500升血浆为例，具体制备工艺如下：

按《中国药典》2010年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原料血浆4500 L，在预融间，用75%乙醇消毒、再用低于35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋。破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-HBs和微生物限度等检查；经过滤或离心，离心速度不大于4Kg/min/台，出液温度控制在0～4℃，分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产。去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、细菌内毒素检测，输送至蛋白分离反应罐或（输送至PCC吸附罐升温至10～20℃进行凝胶吸附，吸附物用于PCC生产）。将血浆的温度控制在1～3℃之间，取样滴定计算需加pH 4.0缓冲液量，按不超过1.0升/分钟的流速加入缓冲液调节pH值为6.80～7.00；加-15℃以下的95％或50％乙醇，流速不超过1.5升/分，使乙醇终浓度至8％（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值应为6.80～7.20。搅拌30分钟以上，进行离心，离心过程中出液流速不超过4Kg/min/台，出液温度控制在-1～-3℃，离心得组分I沉淀和组分Ⅰ上清液。组分I沉淀存放于冷库或直接用于纤维蛋白原生产。

组分I上清液取样进行滴定，计算需加pH4.0缓冲液量，控制流速不超过1.0升/分钟，加入缓冲液调节pH值为6.80～6.85；加-15℃以下的95％乙醇至乙醇浓度为20％（V/V），温度控制在-4～-6℃；加完乙醇后pH应为6.80～7.00。搅拌120分钟以上后，静置60分钟以上，开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，进液压力最高不超过0.20Mpa，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀443Kg和组分Ⅱ+Ⅲ上清液，上清液继续人血白蛋白生产。

接取13倍组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水5759Kg，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L。开启搅拌，降温至3～5℃时，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解。待沉淀完全溶解，取样用pH 4.0醋酸缓冲液滴定至pH 5.80～5.85，计算缓冲液消耗量并折算反应液所需总缓冲液用量。在搅拌过程中以≤0.5升/分钟的流量缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5. 80～5.85，反应液温度为0～-1℃，加完缓冲液，继续搅拌至少10分钟。开启制冷循环，加-15℃以下的95%乙醇，控制流速≤1.5升/分钟，使反应液最终的乙醇浓度为19%。反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤。先用-4℃以下的压缩空气缓慢吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10分钟以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀418Kg。

接取13倍精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水5434Kg，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L。开启搅拌，降温至2～4℃时，将精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解。待沉淀完全溶解，取样用pH 4.0醋酸缓冲液滴定至pH5.17～5.23，计算缓冲液消耗量并折算反应液所需总缓冲液用量。在搅拌过程中以≤0.5升/分钟的流量缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.17～5.23，反应液温度为0～-1℃，加完缓冲液，继续搅拌至少10分钟。开启制冷循环，加-15℃以下的95%乙醇，控制流速≤1.5升/分钟，使反应液最终的乙醇浓度为17%。反应液最终温度控制在-5～-7℃，pH为5.24～5.30，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤。先用-5℃以下的压缩空气缓慢吹出滤器中的水，启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10分钟以上边搅拌边过滤，在过滤过程中保持出液温度为-5～-7℃，过滤压力不超过0.2Mpa。

压滤液上清计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为-5～-7℃，进行深层过滤，过滤出液温度控制在-5～-7℃，过滤后用1.0mol/L的HCl调节pH为3.97～4.05，输入超滤透析罐中进行下道工序的脱醇、纯化。

开始超滤，浓缩至5%以上得到浓缩物540升，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析。将蛋白浓度调整至5.8%，用0.5 mol/L的NaOH调pH至6.48，然后加1.0mol/L磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.195s/m（T=19℃时测），调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化，层析使用DEAE Sepharose Fast Flow（弱阴离子交换凝胶）填料。层析完毕用1.0 mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，开启超滤机浓缩至5%以上, 用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，使乙醇含量≤0.025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将计算量的麦芽糖加入蛋白液内，用1.0 mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量9.9%，pH 4.09，蛋白含量5.9％，溶液重量为430Kg。     

配制后的蛋白液在6小时进行除菌过滤完毕。除菌过滤后制品放置在低pH孵放室，经24±1℃低pH孵放21天。低pH孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤。

将过滤后蛋白液，用2～8℃的0.85%NaCl溶液超滤，进行五倍等体积洗涤，洗涤结束后蛋白浓缩至12.7%进行稀配，调整甘氨酸为28g/L，调整制品pH值为6.8，乙型肝炎抗体效价≥100IU/mL。

将稀配蛋白液161.5公斤经0.2μm滤芯进行蛋白质过滤，过滤后得蛋白液量158.3公斤；分装，分装装量为每瓶2mL；分装数量为77415瓶，分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库。

所述百分数除有限定之外，其余为质量百分数。

经本实施例制备出的产品的检定结果参见下表1~表5。

 

表1：热稳定性试验

 表2：分子大小分布测定

 表3：蛋白质含量测定

表4：纯度测定

表5：麦芽糖残留量测定

Claims (3)

1.一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于制备工艺如下：采用乙型肝炎疫苗免疫健康献浆员后采集的乙型肝炎表面抗体效价高于标准的血浆，血浆通过低温乙醇法及压滤法分离得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，经溶解、压滤得到精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀，再经溶解、调整反应参数、压滤、深层过滤、超滤、透析步骤，调整蛋白液参数至蛋白浓度为3～6%，pH为6.4～6.6，电导率为0.175～0.205s/m，使用DEAE  Sepharose Fast Flow弱阴离子交换凝胶进行上柱层析纯化，经超滤、调整pH为4.05～4.15，加入麦芽糖作为保护剂；经低pH孵放病毒灭活及DV20滤芯除病毒，二次超滤，控制麦芽糖残留量不高于2g/L，再加入甘氨酸作为保护剂，调整pH为6.6～7.2、抗-HBs效价≥100IU/ml，稀配、分装、灯检、包装、入库；制备出纯度在99.0%以上、IgG单体及二聚体总含量在98.0%以上、效价不低于100IU/ml的特异性乙型肝炎人免疫球蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的制备过程：接取10～15倍组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至3～5℃时，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5. 80～5.85，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为19%；反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀。

3.根据权利要求1所述的一种乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其特征在于制备工艺如下：

（1）组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的制备

将原料血浆融化，控制血浆温度在0～4℃，在此温度下离心去除冷沉淀，去除冷沉淀的血浆加入pH 4.0缓冲液调节pH值为6.80～7.00，加-15℃以下的95%乙醇使乙醇终浓度至8%（V/V），温度控制在-1～-3℃，加完乙醇后pH值应为6.80～7.20，在此条件下离心得到组分Ⅰ沉淀和组分Ⅰ上清液；组分Ⅰ上清液加入pH4.0缓冲液调节pH值为6.80～6.85，加-15℃以下的95%乙醇至乙醇浓度为20%（V/V），温度控制在-4～-6℃；加完乙醇后pH应为6.80～7.00，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤，压滤得组分Ⅱ+Ⅲ沉淀和组分Ⅱ+Ⅲ上清液；

（2）组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的溶解、精制

接取10～15倍组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至3～5℃时，将组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，缓慢加入pH 4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5. 80～5.85，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为19%；反应液最终温度控制在-4～-6℃，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；在过滤过程中保持出液温度为-4～-6℃，过滤压力不超过0.2 Mpa，收集精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀；

（3）精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀的溶解、精制、层析

接取10～15倍精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀量的注射用水，用氯化钠调整其钠离子浓度为0.01mol/L；开启搅拌，降温至2～4℃时，将精制组分Ⅱ+Ⅲ沉淀倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，缓慢加入pH4.0醋酸缓冲液到反应液中，调整pH为5.17～5.23，加-15℃以下的95%乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为17%；反应液最终温度控制在-5～-7℃，pH为5.24～5.30，加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上进行压缩过滤；在过滤过程中保持出液温度为-5～-7℃，过滤压力不超过0.2 Mpa；

压滤液上清计量后，启动反应罐搅拌器和制冷循环，控制温度为-5～-7℃，进行深层过滤，过滤出液温度控制在-5～-7℃，过滤后用1.0mol/L的盐酸调节pH为3.97～4.05，输入超滤透析罐中进行下道工序的脱醇、纯化；   

开始超滤，浓缩至蛋白含量5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析；将蛋白浓度调整至3～6%，用0.5mol/L的NaOH调pH至6.4～6.6，然后加1mol/L磷酸-NaOH缓冲液调节电导率为0.175～0.205 s/m（T=19℃时测），调节好后用离子交换柱进行上柱层析纯化，层析使用DEAE Sepharose Fast Flow（弱阴离子交换凝胶）填料；层析完毕用1.0mol/L的HCl调节pH为3.8～4.0，开启超滤机浓缩至蛋白含量5%以上，用5倍体积2～8℃注射用水进行透析，使乙醇含量≤0.025%，然后将蛋白液浓缩至6%以上，将计算量的麦芽糖加入蛋白液内，用1.0mol/L的HCl调节pH值，使麦芽糖含量10±1%，pH为4.05～4.15，蛋白含量5.5±0.5％；

（4）病毒灭活、去除

配制后的蛋白液应在6小时进行除菌过滤，并应在6小时内除菌过滤完毕；除菌过滤后制品放置在低pH孵放室，经24±1℃低pH孵放21天；低pH孵放结束后用DV20滤芯除病毒过滤；

（5）超滤、稀配、分装、灯检、包装、入库

除病毒过滤后，用2～8℃的0.85%NaCL溶液超滤，进行五倍等体积透析，透析结束后浓缩、稀配，调整甘氨酸为26～30g/L，调整制品pH值为6.6～7.2，抗-HBs效价≥100IU/ml；

二次超滤、稀配后蛋白液经0.2μm除菌滤器过滤、分装；分装后的制品送检、灯检，检验合格后包装、入库；

以上所述pH4.0缓冲液是有乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9ml冰乙酸和65.6g乙酸钠；以上百分比处特别说明，其余均为重量百分比。