CN111303277A - 一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法 - Google Patents

一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111303277A
CN111303277A CN202010101809.9A CN202010101809A CN111303277A CN 111303277 A CN111303277 A CN 111303277A CN 202010101809 A CN202010101809 A CN 202010101809A CN 111303277 A CN111303277 A CN 111303277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
immunoglobulin
virus
smallpox
inactivated
plasma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010101809.9A
Other languages
English (en)
Inventor
赵忠鹏
谷宏婧
李靖
李敏
杨晓岚
王希良
杨鹏辉
段越强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN202010101809.9A priority Critical patent/CN111303277A/zh
Publication of CN111303277A publication Critical patent/CN111303277A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法。本发明首先公开了抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，包括：用免疫原免疫动物，收集血清和/或血浆，去除血清和/或血浆中IgG的Fc段，收集F(ab′)2，即可；所述免疫原包括未灭活或灭活的痘苗病毒抗原。本发明进一步公开了上述制备方法得到的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2。本发明优化了抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的生产工艺，获得了高纯度和高效价中和天花病毒的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2，保证了产品的质量，对天花病毒的防治有特异性保护效果，可用于天花类疾病的防治，具有极大的公共卫生价值。

Description

一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术制药领域，具体涉及一种抗天花病毒的免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法。
背景技术
天花(Smallpox)是一种由天花病毒(Viriola Virus)引起的烈性传染病。天花是世界上传染性最强的疾病之一。天花病毒不仅繁殖快，能在空气中迅速传播，而且在感染后的15-20天内致死率高达30％。猴痘是一种病毒性人兽共患病，人类中出现的症状与过去在天花患者身上所看到的症状相似，属于天花类疾病。痘苗病毒天坛株是自1926年从天花患者的疱痂中分离出来的病毒经连续传代减毒而获得，自1980年WHO宣布全球消灭天花后，疫苗停止使用。至今，猴痘仍然在非洲部分地区散发。由于各国相继停止接种牛痘疫苗，目前人类已失去针对天花和猴痘的免疫力。尽管美国、中国已研发了化学治疗药物西多福韦，但针对病毒的靶点不同，并且不是天花和猴痘的特异性治疗药品，会造成很严重的肝脏和肾脏损伤，久用可能造成广泛的病毒耐药性问题。除通过疫苗接种进行预防以外，目前对于天花类疾病临床上尚无有效的生物治疗药物。根据人类历史与传染病斗争的经验，最有效而经济的手段之一是抗血清的被动免疫精准治疗，在某些重要传染病的治疗和预防上至今仍被使用，发挥着重要的作用。
传统马抗血清的优点是：(1)制备工艺成熟、简单，便于大规模生产，在应急治疗效果上是绝对有效的；(2)抗体经胃酶切割，保留了F(ab′)2功能集团，能去掉大部分引起副反应的IgG全分子和Fc片段，稳定性较高，亲和力强；(3)马血清对人的异源性要比其它动物弱等优点；传统马抗血清缺点是：免疫球蛋白F(ab′)2片段纯度低(2015年中国药典的质量标准是F(ab′)2片段占总蛋白不低于75％)、因为纯度低、中和效价不高，造成约有1％出现副作用。
目前尚没有一种抗天花病毒的免疫球蛋白上市。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何获得纯度高、中和效价高的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法。
本发明所提供的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，包括如下步骤：用免疫原免疫动物，收集血清和/或血浆，去除血清和/或血浆中IgG的Fc段，收集F(ab′)2，得到抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2；所述免疫原包括未灭活或灭活的痘苗病毒抗原。
上述制备方法中，所述痘苗病毒抗原具体的为痘苗病毒天坛株或痘苗病毒安卡拉株。
上述制备方法中，所述血清和/或血浆的中和抗体效价≥1∶3200。
本发明用免疫原免疫动物的免疫方案必须借助免疫学基本原理，合理设计候选免疫方案，免疫动物测定中和效价后确定，对抗原类型、免疫佐剂、免疫剂量、免疫次数和间隔时间进行系统地优化，最终选定。
上述制备方法中，所述免疫原由抗原和佐剂组成。佐剂的作用为增强抗原的免疫原性，大幅度提高中和效价。因此筛选合适的佐剂有助于提高中和效价。本发明所述佐剂可以为完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、白油佐剂等，具体的为白油佐剂。
上述制备方法中，所述灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，以灭活的痘苗病毒的蛋白质量计，每次免疫的免疫剂量依次为2μg/kg、4μg/kg、4μg/kg、4μg/kg；
所述未灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，每次免疫的免疫剂量依次为1×105PFU/kg、1.2×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg。
上述制备方法中，进一步还包括在去除血清和/或血浆中IgG的Fc段前对收集的血清和/或血浆采用S/D病毒灭活溶液进行外源病毒灭活得到灭活的血清和/或血浆的步骤，所述S/D病毒灭活溶液为Triton X-10010％，TNBP3％，溶剂为PBS。
上述制备方法中，进一步还包括将所述灭活的血清和/或血浆按照如下方法去除血清和/或血浆中IgG的Fc段：
1)采用胃蛋白酶切割；
2)采用包括硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析和分子筛层析的步骤进行纯化。
本发明利用硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析和分子筛层析的联合方法进行纯化，大幅度提高了F(ab′)2的纯度和中和效价，F(ab′)2片段纯度从传统的75％提升至85％以上，中和效价从1∶3200提升至1:12800以上。
在本发明具体的实施方式中，所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE(阴离子交换树脂，公司GE，货号17-0500-01)，所采用的洗脱程序包括如下步骤洗脱：第一步用洗脱缓冲液(溶质为0.1mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第二步用洗脱缓冲液(溶质为0.2mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/LTris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第三步用洗脱缓冲液(溶质为0.3mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；余类推至第十步用洗脱缓冲液(溶质为1.0mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积。
在本发明具体的实施方式中，所述分子筛层析所采用的洗脱程序用2倍柱体积的PBS缓冲液(pH值为7.4，公司BI，货号02-024-1ACS)进行洗脱。
上述制备方法中，所述动物为马、牛、羊或骆驼等大型动物。
上述制备方法中，所述灭活的痘苗病毒抗原的制备方法如下：采用真核细胞培养生产痘苗病毒；采用甲醛溶液灭活痘苗病毒；用蔗糖密度梯度离心结合阴离子交换柱层析或者透析方法或者分子筛层析纯化灭活痘苗病毒，最终得到纯化后的灭活痘苗病毒抗原。该抗原经SDS-PAGE后薄层扫描法和HPLC法检测，纯度超过85％。
具体的，所述灭活是将痘苗病毒培养液和甲醛溶液进行混合得到甲醛体积含量为0.01％的液体，在20～25℃放置72h进行灭活。
具体的，所述蔗糖密度梯度的蔗糖浓度梯度为28％，32％，36％，40％，44％5个梯度。
具体的，所述阴离子交换柱层析中所采用的阴离子交换基团是DEAE，所采用的洗脱程序包括如下步骤洗脱：第一步用洗脱缓冲液(溶质为0.1mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第二步用洗脱缓冲液(溶质为0.2mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第三步用洗脱缓冲液(溶质为0.3mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；余类推至第十步用洗脱缓冲液(溶质为1.0mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积。
具体的，所述分子筛层析所采用的洗脱程序用2倍柱体积的PBS(pH值为7.4，公司BI，货号02-024-1ACS)进行洗脱。
具体的，所述真核细胞包括鸡胚成纤维细胞、Vero、MRC-5等支持痘苗病毒生长的细胞。
由上述制备方法制备得到的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2也是本发明保护的范围。
本发明通过上述制备方法得到的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2经SDS-PAGE薄层扫描法测定F(ab′)2占85％以上和HPLC法测定F(ab′)2占95％以上。
上述的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2在制备治疗和/或预防由痘病毒引发的疾病的产品中的应用也是本发明保护的范围。
为解决上述技术问题，本发明进一步还提供了一种产品。
本发明所述产品的活性成分为抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
上述产品可以为注射剂，也可以为冻干粉针剂，也可以为喷雾剂，也可以为别的剂型。
上述产品可以为疫苗或试剂盒或药物。
上述抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2或产品在治疗和/或预防由痘病毒引发的疾病中的应用也是本发明保护的范围。
本发明中痘病毒包括痘苗病毒和/或天花病毒。所述由痘病毒引发的疾病可以为天花。
本发明优化了抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的生产工艺(包括抗原的纯化方式、免疫方案和去除Fc段等等)，获得了高纯度和高效价中和天花病毒的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2，每批样品SDS-PAGE薄层扫描测定F(ab′)2纯度均达到85％以上，HPLC测定F(ab′)2纯度可以达到95％以上，保证了产品的质量，使副作用从1％左右降低到0.01％左右，对包括天花病毒和痘苗病毒在内的痘病毒的防治有特异性保护效果，可用于天花类疾病的防治，具有极大的公共卫生价值。
附图说明
图1为HPLC测定纯化未灭活的天坛株病毒纯度。
图2为SDS-PAGE测定制备马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2电泳图；其中，1-3为马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2；4为传统工艺生产的破伤风抗毒素。
图3为马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2HPLC上样结果。
图4为马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2治疗实验小鼠平均体重变化图。
图5为马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2预防实验小鼠平均体重变化图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1痘苗病毒天坛株纯化抗原的制备及检验
一、天坛株病毒的放大培养
取一定量的9～11日龄SPF鸡胚，无菌条件下取出鸡胚，去除内脏，用Eargle液清洗三次，剪碎，加入用DMEM培养液配制的0.25％胰酶，在37℃消化30分钟，室温下静置，待组织块沉淀后，将上层胰蛋白酶液倒出，用吸管吹打三次，将组织块全部分散，吹打后上层细胞悬液合并，计数，加入细胞培养瓶中，并加入适量DMEM培养液，37℃培养24～28小时，待细胞长满后接种中国疾病预防控制中心(CDC)病毒病所提供的天坛株痘苗病毒(记载于非专利文献“阮力.痘苗病毒天坛株载体研究与应用概述[J].微生物与感染,2013,8(01):2-8.”)，接种量为0.1MOI，37℃培养96～120小时，在细胞全病变后24小时内收获天坛株病毒培养液，暂放2～8℃备用。
二、天坛株病毒灭活
将步骤一得到的天坛株病毒培养液和甲醛溶液(甲醛溶液中甲醛的体积分数为37％)进行混合得到甲醛体积含量为0.01％的液体，将该液体在20～25℃放置72h进行灭活，得到灭活后的天坛株病毒液。
三、灭活后的天坛株病毒液的纯化
配制28％，32％，36％，40％，44％5个梯度浓度的蔗糖溶液，依从高到低的顺序，缓缓加入到离心管底部，封口后放置4℃冰箱过夜，形成28～44％蔗糖梯度溶液。
取灭活后的天坛株病毒液加入预先制备好的28～44％蔗糖梯度溶液的上层，4℃，13500rpm(17000g)离心45min，可见离心管中下1/3处有明显白色条带。吸取管中上层肉眼可见白色条带的液体(在紫外线照射下愈加明显)，用分子筛层析或者透析方法或者阴离子交换柱层析脱糖及浓缩病毒，得到纯化后的灭活天坛株病毒。本发明下述试验用到的纯化后的灭活天坛株病毒为利用阴离子交换柱层析得到的纯化后的灭活天坛株病毒。
其中，分子筛层析具体为：(1)装柱：取Sepharose 6FF(公司GE，货号17-0159-01)或者4FF(公司GE，货号17-0149-01)装入清洗后的层析柱中；(2)平衡Sepharose柱：用2倍柱体积的再生缓冲液(0.1N氢氧化钠，0.9％氯化钠溶液)冲洗层析柱，流速控制在2cm/min，用4倍柱体积的注射用水冲洗层析柱，流速控制在2cm/min，用3倍柱体积的PBS(pH值为7.4，公司BI，货号02-024-1ACS)冲洗层析柱，流速控制在2cm/min；(3)上样：样品充分摇匀，并应用恒流泵入层析柱中，流速控制在1cm/min；(4)样品洗脱：用2倍柱体积的PBS(pH值为7.4，公司BI，货号02-024-1ACS)洗涤，洗涤流速控制在2cm/min，收集流出的病毒蛋白(第一蛋白峰)，此为过柱纯化的病毒。
透析方法具体为：(1)MD77透析袋放纯水中煮沸并自然冷却至室温；(2)将分子筛方法获取的样品装入透析袋，扎紧后放入至少20倍样品体积的PBS中，每4小时更换1次PBS，3～5次；(3)用PEG20000(期间可以不断添加和更换PEG20000)将缓冲液浓缩10～20倍，即为透析浓缩后的病毒样品。
阴离子交换柱层析具体为：(1)装柱：取DEAE Sepharose F.F(阴离子交换树脂，公司GE，货号17-0500-01)装入清洗后的层析柱中；(2)平衡DEAE Sepharose F.F柱：用2倍柱体积的DEAE再生缓冲液(pH为8.0，含0.1mol/L氢氧化钠，0.5mol/L氯化钠，0.1mol/LTris-HCl溶液)冲洗层析柱，流速控制在2cm/min，用4倍柱体积的注射用水冲洗层析柱，流速控制在2cm/min，用3倍柱体积的DEAE凝胶平衡缓冲液(pH为8，0.02mol/L Tris-HCl缓冲液)冲洗层析柱，流速控制在2cm/min；(3)上样：样品首先加入起始缓冲液(pH为8，0.2mol/LTris-HCl缓冲液)，充分摇匀，使要层析的制品中的Tris-HCl缓冲液的最终浓度为0.02mol/L。将样品应用恒流泵入层析柱中，流速控制在1cm/min；(4)样品洗脱：第一步用洗脱缓冲液(溶质为0.1mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第二步用洗脱缓冲液(溶质为0.2mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第三步用洗脱缓冲液(溶质为0.3mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；余类推至第十步用洗脱缓冲液(溶质为1.0mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积，洗涤流速控制在2cm/min，收集通过蛋白检测仪及记录仪记录的各个蛋白峰，收集流出的蛋白峰，SDS-PAGE检测含病毒的蛋白峰(含0.2mol/L NaCl中)，此为过柱纯化的病毒。
未灭活天坛株病毒的纯化同灭活天坛株病毒的纯化步骤，操作人员必须穿戴好防护服，在BSL-3实验室(高级别实验室)条件下操作。使用GE公司购买的分子筛色谱柱，在高压液相色谱仪上，HPLC测定纯化的未灭活天坛痘苗病毒纯度，结果如图1所示，显示抗原纯度达95％以上。
四、纯化后的灭活天坛株病毒抗原的检定
透射电镜观察纯化后的灭活天坛株病毒形态，符合痘病毒的特征；根据《中国药典(2015版)》附录提供的方法，接种硫乙醇酸盐培养基、营养琼脂斜面培养基和改良马丁培养基培养进行无菌检测，无细菌污染；用鲎试剂法检测热原质，合格；用半流体和肉汤培养基检测支原体，无支原体污染；接种小鼠、鸡胚和细胞，进行外源因子检查，无外源因子污染；用SDS-PAGE和HPLC检测病毒纯度，纯度大于95％。
结果如表1所示，表明得到的纯化后的灭活天坛株病毒抗原符合中国药典的标准。
表1纯化灭活天坛株病毒抗原检定结果
Figure BDA0002387111090000071
注：“-”代表阴性
实施例2抗原免疫剂量和免疫程序的优化
一、免疫方案
选用实施例1制备得到的纯化后的灭活天坛株病毒、纯化后的未灭活的天坛株活病毒作为抗原，通过不同抗原用量、不同佐剂类型、不同免疫部位、不同免疫次数，免疫经检疫合格的4-6岁健康马匹(体重约500kg)，具体的免疫剂量、佐剂类型、免疫部位、免疫次数如表2和表3所示。
二、免疫方案的优化结果
免疫方案的优化结果如表2和表3所示，结果显示：以纯化后的灭活天坛株病毒或纯化后的未灭活的天坛株活病毒作为抗原、以完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂或白油佐剂作为佐剂组成的免疫原免疫3次或4次都能产生有效的中和抗体效价，并随着免疫次数增加及免疫剂量的增加其中和抗体效价也明显增加。当抗原为实施例1的纯化后的灭活天坛株病毒，佐剂为白油佐剂，免疫4次，间隔时间28天，每次免疫的免疫剂量依次为2μg/kg、4μg/kg、4μg/kg、4μg/kg(上述免疫剂量均是以纯化后的灭活天坛株病毒的蛋白质量计)，每次免疫的免疫部位均为淋巴结附近、背部皮下多点注射，效果最好；当抗原为实施例1的纯化后的未灭活天坛株活病毒，佐剂为白油佐剂，免疫4次，间隔时间28天，每次免疫的免疫剂量依次为1×105PFU/kg、1.2×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg，能产生较高的中和抗体效价，但没有纯化后的灭活天坛痘苗活病毒抗原效果好。
表2纯化后的灭活天坛株病毒抗原免疫方案和抗体检测结果
Figure BDA0002387111090000081
表3纯化后的未灭活天坛株活病毒抗原免疫方案和抗体检测结果
Figure BDA0002387111090000082
实施例3马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2制品原液的制备
一、原料血浆
利用实施例2中所述的免疫方案取实施例1中纯化后的灭活天坛株病毒抗原免疫马匹的血浆，血浆中无溶血、无异味、无肉眼所见的染菌，血浆中和抗体效价≥1：3200。
二、马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的生产
(1)向上述步骤一收集的血浆中加入1/10体积的S/D病毒灭活溶液(Triton X-10010％，TNBP 3％，溶剂为PBS)灭活外源病毒，得到经S/D处理的血浆；(2)经S/D处理的血浆和蒸馏水以体积比为1:2的比例混合，加入胃蛋白酶消化，胃蛋白酶加量为10U/ml；(3)硫酸铵沉淀：消化结束后，加入15％(W/V)固体硫酸铵，搅拌溶解，调pH5.4，加温至57℃；降温至45℃以下，加硅藻土(5-10g/L)，板框压滤。收集滤液，弃沉淀；滤液调pH至7.0-7.4，加固体硫酸铵，搅拌溶解，静置60分钟；加硅藻土，板框压滤，收集沉淀；明矾吸附(35℃以下，加血浆量2-4倍水溶解沉淀，加10％明矾液调pH7.8-7.9，静置90分钟)，板框压滤，弃沉淀；(4)超滤脱铵(以血浆量的3倍水补液进行超滤脱铵，浓缩至所需量，调pH6-7)，得到超滤浓缩液；(5)阴离子交换柱层析(具体方法详见实施例1)：将超滤浓缩液过DEAE Sepharose F.F柱，洗脱时，第一步用洗脱缓冲液(溶质为0.1mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第二步用洗脱缓冲液(溶质为0.2mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；第三步用洗脱缓冲液(溶质为0.3mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积；余类推至第十步用洗脱缓冲液(溶质为1.0mol/L氯化钠，溶剂为pH8、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液)洗脱1个柱体积，得到的去除Fc段的纯化马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2液(含0.3mol/L NaCl中)；(6)分子筛层析(具体方法详见实施例1)：将收集的F(ab′)2液使用GE公司购买的sepharose 6FF或者4FF填料，用2倍柱体积的PBS缓冲液进行洗脱，收集第一峰，透析浓缩后即为原液。
现在生产马抗免疫球蛋白F(ab′)2的传统工艺，以破伤风抗毒素为例，为：(1)胃酶消化：血浆稀释3倍、调pH3.2；加入胃蛋白酶，胃蛋白酶加量为10U/ml；控制温度为30℃，消化90分钟后，终止消化，得到消化液。(2)硫酸铵沉淀：按消化液总体积添加15％(W/V)固体硫酸铵，调pH5.2，升温至58℃；静止30分钟后启动搅拌，将罐内液体温度尽速冷却至45℃以下。固液分离(离心法或压滤法)，收集上清，调pH7.2。上清中加入20％(W/V)硫酸铵，沉淀，固液分离(离心法或压滤法)，收集沉淀。(3)明矾吸附：沉淀30倍注射用水溶解，注射用水温度为31℃，加10％明矾溶液至终浓度为0.8％，用1M氢氧化钠溶液调整pH值至7.8，搅拌30分钟后，静止1小时，固液分离(离心法或压滤法)，收集上清。(4)超滤、浓缩：将上清液浓缩至原体积的1/8，用6倍注射用水超滤脱盐。(5)原液配制：调pH7.0；氯化钠0.9％，澄清、除菌滤过。
从以上过程，可以看出，增加了S/D病毒灭活溶液灭活马血清中的外源病毒，提高了制品的安全性；增加了阴离子交换柱层析和分子筛层析，大幅提高了产品的纯度。
根据《中国药典(2015版)》，添加氯化钠(等渗液)等辅料，调pH6-7，除菌过滤，得到马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2成品(液体注射剂)，也可以添加冻干保护剂(海藻糖等)，冻干后为冻干粉针剂。
其中，液体注射剂具体配制方式为：取经无菌试验、热原质试验、类A型物质检测、中和抗体效价测定(根据《中国药典(2015版)》附录所述方法)合格的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2原液，调pH7.0，0.9％氯化钠，采用0.22μm滤膜除菌，按中和抗体含量用生理盐水配制半成品，在净化万级条件下分装制备成品，每瓶装5100U/3ml，放2～8℃冷库储存。
冻干粉针剂成品具体配制方式为：取经无菌试验、热原质试验、类A型物质检测、中和抗体效价测定(根据《中国药典(2015版)》附录所述方法)合格的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2原液，调pH7.0，0.9％氯化钠，添加海藻糖至海藻糖的含量为10％，采用0.22μm滤膜除菌，按中和抗体含量用生理盐水配制半成品，在净化万级条件下分装，每瓶装5100U/3ml，冻干后(含水量低于3％)，放2～8℃冷库储存。
3.3马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2成品的检定
质量检定马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2成品(液体注射剂)，依据《中国药典(2015版)》附录进行，采用动物法或细胞法测定中和抗体效价、SDS-PAGE/HPLC测定F(ab′)2含量、凯氏定氮测定蛋白含量，其他检测项均按生物制品的要求测定。
结果如表4所示，理化性质均高于《中国生物制品规程》(现行版)对其他马抗血清的标准。图2给出了SDS-PAGE测定制备马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2和传统工艺生产的破伤风抗毒素的电泳图，结果显示，马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的纯度明显高于破伤风抗毒素，SDS-PAGE薄层扫描法测定F(ab′)2占85％以上；图3给出了马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab')2的HPLC上样结果，HPLC法测定F(ab′)2占95％以上。
表4马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2成品的质量检定结果
Figure BDA0002387111090000101
Figure BDA0002387111090000111
注：中和活性采用动物法测定，在小鼠体内中和1.6×105PFU天坛痘苗病毒所需的免疫球蛋白片段作为1个活性单位(U)。
实施例4马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2在动物体内治疗效果
一、实验材料
试制品：马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2成品(液体注射剂)，中和抗体活性5100U/3ml(免疫球蛋白比活性为34U/mg)；
病毒：天坛株病毒，病毒滴度是1.38×107PFU/ml；
动物：Balb/c小鼠，6-8周龄，体重16-18g，购于斯贝福实验动物公司。
二、马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2在动物体内治疗试验
将Balb/c小鼠20只，分5组，即实验组1、实验组2、实验组3、实验组4和对照组，4只/组，用PBS 4倍稀释天坛株病毒，每组每只小鼠静脉注射天坛株病毒0.2mL，观察小鼠至身体发痘，对照组小鼠第6天身体开始发痘；用PBS稀释配制马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2四个稀释度，分别为5.2mg/ml、2.6mg/ml、1.3mg/ml、0.65mg/ml(免疫球蛋白比活性为34U/mg)的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，于第6天静脉注射0.5ml给实验组1、实验组2、实验组3、实验组4的小鼠，其中，实验组1每只小鼠静脉注射5.2mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，实验组2每只小鼠静脉注射2.6mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，实验组3每只小鼠静脉注射1.3mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，实验组4每只小鼠静脉注射0.65mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，对照组每只小鼠静脉注射等体积的生理盐水，继续观察各组小鼠体重、出痘及死亡情况。
结果如图4所示，结果显示：实验组1、实验组2和实验组3的小鼠在分别注射浓度为5.2mg/ml、2.6mg/ml、1.3mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液后，体重慢慢恢复至实验前体重，并有所增加；而0.65mg/ml组实验小鼠体重恢复的慢，至马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液注射后的第8天身上尚有少许痘结痂；对照组的小鼠注射PBS在天坛株病毒后的第6天身体开始长痘，第8天全身都长痘，生命状态差，且至实验结束时也未见体重恢复和痘结痂的消失。
实施例5马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2在动物体内的预防效果
一、实验材料
(1)试制品：马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2，中和抗体活性5100U/3ml(免疫球蛋白比活性为34U/mg)；
(2)病毒：天坛株病毒，病毒滴度是1.38×107PFU/ml；
(3)动物：Balb/c小鼠，6-8周龄，体重16-18g，购于斯贝福实验动物公司。
二、马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2在动物体内的预防实验
选用Balb/c小鼠20只，分5组，即预防实验组1、预防实验组2、预防实验组3、预防实验组4和对照组，4只/组，体重16-18g。用PBS稀释配制马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)24个浓度，分别为5.2mg/ml、2.6mg/ml、1.3mg/ml、0.65mg/ml(免疫球蛋白比活性为34U/mg)的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，静脉注射0.5ml给预防实验组1、预防实验组2、预防实验组3、预防实验组4的小鼠，其中，预防实验组1每只小鼠静脉注射5.2mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，预防实验组2每只小鼠静脉注射2.6mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，预防实验组3每只小鼠静脉注射1.3mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，预防实验组4每只小鼠静脉注射0.65mg/ml的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液，对照组每只小鼠静脉注射等体积的生理盐水。
6天后每只小鼠静脉注射天坛痘苗病毒，观察小鼠体重变化及结痂、死亡等情况。
结果如图5所示，注射马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液的预防实验组1-4组的小鼠，预防实验组1、预防实验组2分别注射马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液的浓度为5.2mg/ml、2.6mg/ml的小鼠，在注射痘苗病毒的第6天体重降至最低，尔后又逐渐增加，恢复正常；而预防实验组3、预防实验组4分别注射马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2溶液的浓度为1.3mg/ml、0.65mg/ml的小鼠在体重降至最低后可见有上升的趋势，但不明显。由此可见，给予一定量的马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2具有良好的预防效果；而对照组，小鼠在注射痘苗病毒后的第6天四肢开始长痘，第8天全身都长出，生命状态差，且至实验结束时也未见体重恢复和结痂的消失，由此可见没有预防作用。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：用免疫原免疫动物，收集血清和/或血浆，去除血清和/或血浆中IgG的Fc段，收集F(ab′)2，得到抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2；所述免疫原包括未灭活或灭活的痘苗病毒抗原。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述免疫原由抗原和佐剂组成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂为完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、白油佐剂中任一种或多种，具体的为白油佐剂。
4.根据权利要求1-3任一所述的制备方法，其特征在于：所述灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，以灭活的痘苗病毒的蛋白质量计，每次免疫的免疫剂量依次为2μg/kg、4μg/kg、4μg/kg、4μg/kg；
所述未灭活的痘苗病毒抗原的免疫方式为：采用淋巴结附近、背部皮下多点注射，免疫4次，每次间隔28天，每次免疫的免疫剂量依次为1×105PFU/kg、1.2×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg、1.6×105PFU/kg。
5.根据权利要求1-4任一所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括在去除血清和/或血浆中IgG的Fc段前对收集的血清和/或血浆采用S/D病毒灭活溶液进行外源病毒灭活得到灭活的血清和/或血浆的步骤。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法进一步还包括将所述灭活的血清和/或血浆按照如下方法去除血清和/或血浆中IgG的Fc段：
1)采用胃蛋白酶切割；
2)采用包括硫酸铵沉淀、阴离子交换柱层析和分子筛层析的步骤进行纯化。
7.根据权利要求1-6任一所述的制备方法，其特征在于：所述动物为马、牛、羊或骆驼。
8.由权利要求1-7任一所述的制备方法制备得到的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
9.权利要求8所述的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2在制备治疗和/或预防由痘病毒引发的疾病的产品中的应用。
10.一种产品，其特征在于：所述产品的活性成分为权利要求8所述的抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2。
CN202010101809.9A 2020-02-19 2020-02-19 一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法 Pending CN111303277A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010101809.9A CN111303277A (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010101809.9A CN111303277A (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111303277A true CN111303277A (zh) 2020-06-19

Family

ID=71145133

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010101809.9A Pending CN111303277A (zh) 2020-02-19 2020-02-19 一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111303277A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1796416A (zh) * 2004-12-29 2006-07-05 中山大学 抗禽流感病毒免疫球蛋白、制备方法和其制剂
WO2007120860A2 (en) * 2006-04-13 2007-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
WO2009048769A2 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Vaccinia virus h3l and b5r specific monoclonal antibodies and methods of making and using same
CN102827273A (zh) * 2012-02-16 2012-12-19 张小莺 抗痘苗病毒IgY抗体的制备
CN104844708A (zh) * 2014-09-30 2015-08-19 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
CN105254755A (zh) * 2014-12-01 2016-01-20 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
CN105663166A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 中国人民解放军疾病预防控制所 特异性抗天花病毒感染模型毒株的生物活性制剂及应用
CN111065406A (zh) * 2017-06-21 2020-04-24 特兰斯吉恩股份有限公司 个性化疫苗

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1796416A (zh) * 2004-12-29 2006-07-05 中山大学 抗禽流感病毒免疫球蛋白、制备方法和其制剂
WO2007120860A2 (en) * 2006-04-13 2007-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
WO2009048769A2 (en) * 2007-10-10 2009-04-16 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Vaccinia virus h3l and b5r specific monoclonal antibodies and methods of making and using same
CN102827273A (zh) * 2012-02-16 2012-12-19 张小莺 抗痘苗病毒IgY抗体的制备
CN104844708A (zh) * 2014-09-30 2015-08-19 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
CN105254755A (zh) * 2014-12-01 2016-01-20 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
CN105663166A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 中国人民解放军疾病预防控制所 特异性抗天花病毒感染模型毒株的生物活性制剂及应用
CN111065406A (zh) * 2017-06-21 2020-04-24 特兰斯吉恩股份有限公司 个性化疫苗

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
乔建军等: "FDA批准牛痘免疫球蛋白静脉注射剂治疗天花疫苗并发症", 《中国处方药》 *
管茜茜: "猴痘病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
闫莉等: "马抗天花病毒免疫球蛋白F(ab")2的制备及免疫防护效果评价", 《中国兽医学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11993634B2 (en) Recombinant varicella-zoster virus (VZV) vaccine
JP2873880B2 (ja) ポックスウイルス成分の組み合わせにもとづく類属免疫誘導剤、その製造方法
CA1142431A (en) Virus-inactivated hgi-glycoprotein capable of stimulating proliferation and differentiation of human granulocyte, for preparing same and leukopenia curative containing same
CN111471103A (zh) 一种新冠病毒（2019-nCOV）的异源抗体及其制备方法
FI73596C (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett vaccin av herpes simplex typ 1.
CN107267466A (zh) 一种大规模生产猪伪狂犬病灭活疫苗的方法
US20040253272A1 (en) Process for producing inactivated virus envelopes
CN111920944A (zh) 一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法
CN116554280A (zh) 一种防治宫颈hpv感染的18价hpv复合卵黄中和抗体及其制备方法和应用
US20220267419A1 (en) Human Immunoglobulin Against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus, Preparation Method Therefor, And Use Thereof
EP2075005A1 (en) Ipv-dpt vaccine
CN111303277A (zh) 一种抗天花病毒免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法
CN101361973A (zh) 一种治疗水痘的药物及其制备方法
CN106563125A (zh) 鸭甲肝病毒ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法
CN113425839B (zh) 猪伪狂犬病、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法
RU2143921C1 (ru) Вакцина против ящура типа а и способ ее изготовления
RU2220744C1 (ru) Вакцина против ящура типа азия-1 и способ ее изготовления
US20220088139A1 (en) Nerve growth factor mutant
RU2770425C2 (ru) Способ получения иммуноглобулина противооспенного из сыворотки крови лошадей
CN116284350B (zh) 一种猫疱疹病毒单克隆抗体及其制备方法和应用
RU2810740C1 (ru) Способ получения инактивированной вакцины против covid-19 и вакцина, полученная способом
RU2494760C1 (ru) Способ получения гипериммунной сыворотки против цирковирусной инфекции, репродуктивно-респираторного синдрома и гемофилеза свиней
CN112940112B (zh) 一种抗兔d型多杀性巴氏杆菌卵黄抗体及其制备方法
RU2221591C1 (ru) Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии
EP0308717B1 (en) Method of treating viral encephalitis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination