CN105663166A - 特异性抗天花病毒感染模型毒株的生物活性制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性抗天花病毒感染模型毒株的生物活性制剂及应用。本发明所提供的应用具体为生物活性制剂CH2009在如下(1)或(2)中的应用：(1)制备用于抑制痘病毒感染的产品；(2)用于抑制痘病毒感染；所述生物活性制剂CH2009是利用痘苗病毒皮内接种新西兰大白兔，经高温高压、溶剂抽提、酸碱处理、吸附、洗脱和离心浓缩等步骤，从该大白兔的炎症皮肤组织中制备获得的具有特异性抗痘病毒感染的生物活性制剂。本发明为新一代抗天花等痘类病毒感染药物的研发提供一个全新的设计策略，而获得的抗病毒药物无疑具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。
Description
技术领域
本发明属于抗病毒药物领域，涉及一种特异性抗天花病毒感染模型毒株的生物活性制剂及应用。
背景技术
痘病毒是一个既可感染人类，可感染动物的庞大家族，常引起感染者局部或全身化脓性皮肤损害，并可导致传染性疾病暴发。尤其值得注意的是天花病毒，繁殖速度快，而且可通过空气传播，传播速度极快，携带病毒的患者因其唾液中含有最大量的天花病毒，在感染后1周内最具传染性，直到病人结疤剥离后，天花病毒还可通过病人传染，曾导致人类历史上多次全球性的疫情暴发。在恶性感染情况下，天花病毒在组织层或皮肤深层造成严重的扩散性破坏，患者体内血液大量流入皮肤、喉咙、肺、肠或子宫，导致无法控制的毒血症或大出血，这样的患者不会出现典型的丘疹或水疱状突起，而只是平常的红色或紫色斑痕、瘀点或麻疹样的红斑，一情况下，患者在出现症状后10至14天内死亡，病死率高达25-30％。
随着天花灭绝和预防疫苗在世界范围内的停止接种，人群中对天花等痘病毒的易感人群所占比例日渐扩大，人类面临天花等痘病毒的生物恐怖威胁和潜在的生物战威胁日益严重，及时开展抗天花病毒药物的研制和资源储备，对于世界各国都具有十分重要的战略意义，因此，抗天花等痘类病毒药物的研究一直是国际社会的关注热点。
由于天花病毒的极度危险性，国际社会制定了非常严格的措施和公约，极大的限制了人类以天花病毒本身为对象的科学研究。目前，国际社会普遍认可的替代天花病毒感染的模型系统，主要为痘苗病毒、猴痘病毒和鼠痘病毒感染模型系统，利用此类天花病毒感染模型系统，一些化合物已被证明对包括天花病毒在内的多种痘病毒感染有抑制作用，包括缩氨硫脲类药、核苷和核苷类似物、干扰素和干扰素诱导物等。目前，研究最多的、对痘苗病毒感染抑制效果较好的物质，也主要是各种核苷类化合物及核苷类似物，其中包括：肌苷一磷酸(IMP)脱氢酶抑制剂(如利巴韦林)，S-腺苷半胱氨酸(SAH)水解酶抑制剂(如腺苷类似物A)、乳清苷一磷酸(OMP)脱羧酶抑制剂(如吡唑吠喃菌素)、胞苷三磷酸(CTP)合成酶抑制剂(如环戊烯基胞嘧啶(Ce-Cyd))、无环核苷碳磷酸盐化合物，如西多福韦(cidofovir)，但由于此类抗痘病毒化合物生物利用效率低、毒副作用大等原因，严重的限制了其全面的推广和应用。因此，新一代安全高效的抗天花等痘类病毒感染药物的研究一直是国际社会的关注热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性抗天花病毒感染模型毒株的生物活性制剂及应用。
本发明所提供的应用具体为生物活性制剂CH2009在如下(1)或(2)中的应用：
(1)制备用于抑制痘病毒感染的产品；
(2)用于抑制痘病毒感染；
所述生物活性制剂CH2009具体可按照包括如下步骤(a1)-(a6)的方法制备获得：
(a1)取离体的新西兰大白兔的炎症皮肤，放入到所取炎症皮肤自身重量3-4倍(如3.5倍)的体积百分含量为2％的苯酚水溶液中，通入氮气(如3min)，密封后2-6℃(如4℃)放置60-80h(如72h)，离心(如3000rpm离心10min)，取上清液，过滤，得到溶液I(褐色)；
(a2)向所述溶液I中通入氮气(如3min)，用1M盐酸将所述溶液I的pH调至5.0±0.2(如5.0)，水浴煮沸25-35min(如30min)，降温至28±2℃(如28℃)，离心(如3000rpm离心10min)，取上清液，过滤，得到溶液II；
(a3)向所述溶液II中通入氮气(如3min)，用1M氢氧化钠将所述溶液II的pH调至9.2±0.2(如9.2)，水浴煮沸25-35min(如30min)，降温至28±2℃(如28℃)，过滤，得到溶液III；
(a4)向所述溶液III中通入氮气(如3min)，用1M盐酸将所述溶液III的pH调至4.5±0.2(如4.5)，向所述溶液III中通入氮气(如3min)，加入活性炭，于30±2℃(如30℃)条件下持续搅拌2-6h(如4h)，停止搅拌后，静置25-35min(如30min)，抽弃上层清液，氮气环境下过滤余下物质，然后用生理盐水(pH8.0)浸泡和清洗所述活性炭，氮气环境下过滤，弃去滤液，收集和贮存所述活性炭于容器内，加入生理盐水(pH8.0)，用1M氢氧化钠将溶液pH调至11.0±0.2(如11.0)，连续搅拌2-6h(如4h)，氮气环境下过滤，弃去滤液，并用生理盐水(pH8.0)冲洗所述活性炭，得到溶液IV；
(a5)用1M盐酸将所述溶液IV的pH调至6.0±0.2(如6.0)，通入氮气后(如通入氮气5min后)，将所述溶液IV密封于容器内，加热至121±2℃(如121℃)，保持15-25min(如20min)，然后冷却至40℃以下，得到溶液V；
(a6)将所述溶液V抽入减压蒸馏器，并将所述减压蒸馏器内的空气换为氮气，60±2℃(如60℃)条件下，减压蒸馏，过滤，所得滤液即为所述生物活性制剂CH2009。
在所述方法的步骤(a1)中，所述新西兰大白兔的炎症皮肤为由于皮内接种了痘病毒而引起皮肤炎症的新西兰大白兔的皮肤。
其中，所述痘病毒具体可为痘苗病毒。所述痘病毒(如痘苗病毒)的接种量为5×106～6×106TCID50每只成熟新西兰大白兔(2.7-3.0千克)。所述皮内接种为多点皮内接种，100-120个点/兔。在接种所述痘病毒(如痘苗病毒)后饲养所述新西兰大白兔4-5天，将出痘症状良好、颜色由红润转为紫红、皮肤增厚和皮下有水肿的新西兰大白兔，安乐处死，15min内完成采皮，用塑料袋包装兔皮，立即存放在-80℃备用。
在所述方法的步骤(a1)中，所述过滤可为采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤(常压过滤)。步骤(a2)中，所述过滤可为采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤(低压过滤)。步骤(a3)中，所述过滤可为先用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤(低压过滤)，再用0.45μm滤膜进行过滤(低压过滤)。步骤(a4)中，前两次所述过滤均可为采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤(低压过滤)；第三次所述过滤可为采用0.45μm滤膜进行过滤(常压过滤)。步骤(a6)中，所述过滤可为先采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤(常压过滤)，再用0.2μm滤膜进行过滤(常压过滤)。
在所述方法中，步骤(a1)中的所述炎症皮肤的重量、步骤(a4)中的所述活性炭的重量、步骤(a4)中第一次使用的所述生理盐水的体积、步骤(a4)中第二次使用的所述生理盐水的体积，以及步骤(a6)中进行所述减压蒸馏后的液体体积的配比约为200g：40g：400ml：40ml：5ml。
在所述方法中，所述抑制痘病毒感染为如下(a)或(b)：
(a)在与痘病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述痘病毒对所述宿主或所述宿主细胞的感染；
(b)治疗痘病毒感染。
在所述方法的(1)或(2)中，所述痘病毒为能够感染哺乳动物的痘病毒；所述能够感染哺乳动物的痘病毒具体可为天花病毒、痘苗病毒或鼠痘病毒。
本发明还提供了一种用于抑制痘病毒感染的产品。
本发明所提供的用于抑制痘病毒感染的产品，为按照包括如上步骤(a1)-(a6)的方法制备获得的生物活性制剂CH2009。
本发明利用痘苗病毒皮内接种新西兰大白兔，经高温高压、溶剂抽提、酸碱处理、吸附、洗脱和离心浓缩等步骤，从该大白兔的炎症皮肤组织中，制备具有特异性抗痘病毒感染的生物活性制剂CH2009。生物制剂CH2009为含多种氨基酸和核苷酸的生物提取物，具有毒性低和吸收率高等显著优势，而且，经过进一步的浓缩提纯，其抵抗包括天花病毒在内的多种痘类病毒的效果必将大大提升。因此，本发明为新一代抗天花等痘类病毒感染药物的研发提供一个全新的设计策略，而获得的抗病毒药物无疑具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
痘苗病毒WR株(VacciniaVirusWRStrain)：记载于“SjoerdH.E.vandenWorm,KlaraKristinEriksson,JessikaC.Zevenhoven,FriedemannWeber,RolandZüst,ThomasKuri,RonaldDijkman,GuohuiChang,StuartG.Siddell,EricJ.Snijder,VolkerThiel,AndrewD.Davidson.ReverseGeneticsofSARS-RelatedCoronavirusUsingVacciniaVirus-BasedRecombination.PLoSOne.2012；7(3)”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
冠状病毒(鼠肝炎冠状病毒A59株，简称MHV-A59)：记载于“LinLei,SunYing,WuXiaoyan,SunZounan,YangYi,SuWenli,HuYi,ZhuQingyu,GuoDeyin,LiuJingmei,ChangGuohui.AttenuationofMouseHepatitisVirusbyDeletionoftheLLRKxGxKGRegionofNsp1.PLoSONE,20138(4):e61166.”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
鼠痘病毒莫斯科株(EctromeliaVirusesMoscowstrain，ECTV-MOSstrain)(ATCC,VR-1374)：记载于“KarolinaBień,Justynaowska,Piotrska,ZuzannaNowak,WandaStankiewiczandMalgorzataKrzyzowska.Fas/FasLPathwayParticipatesinRegulationofAntiviralandInflammatoryResponseduringMousepoxInfectionofLungs.MediatorsInflamm.2015:281613,doi:10.1155/2015/281613；”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
5型腺病毒(dl309株)：记载于“RadkoS,JungR,OlanubiO,PelkaP.EffectsofAdenovirusType5E1AIsoformsonViralReplicationinArrestedHumanCells.PLoSOne.2015Oct8；10(10):e0140124.doi:10.1371/journal.pone.0140124.eCollection2015.”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
肠道病毒71型Hn2株(EV71-Hn2)：记载于“ChangGuohui,LuoYanjun,WuXiaoyan,SiBingyin,LinLeiandZhuQingyu.MonoclonalantibodyinducedwithinactivedEV71-Hn2virusprotectsmiceagainstlethalEV71-Hn2virusinfection.VirologyJournal2010,7:106”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。
CV-1细胞、293细胞和Vero细胞，均为EuropeanCollectionofCellCultures(http://www.ecacc.org.uk/)产品，按常规方法传代培养。17Cl-1细胞，记载于“LinLei,SunYing,WuXiaoyan,SunZounan,YangYi,SuWenli,HuYi,ZhuQingyu,GuoDeyin,LiuJingmei,ChangGuohui.AttenuationofMouseHepatitisVirusbyDeletionoftheLLRKxGxKGRegionofNsp1.PLoSONE,20138(4):e61166.”一文，公众可从申请人处获得，仅用于重复本发明实验使用。各细胞均按常规方法传代培养。
培养液：A、细胞生长培养液：以DMEM培养基(Sigma公司产品)为母液，分别加入10％(体积分数)胎牛血清(invitrogen公司产品)，0.2mg/ml谷氨酰胺(invitrogen公司产品)，100U/ml青霉素、链霉素；B、细胞维持培养液，胎牛血清为2％(体积分数)，其余与A均相同；C、病毒增殖培养液：与细胞维持培养液相同。
动物：新西兰大白兔和Balb/c小鼠，SPF级，均为军事医学科学院动物中心产品。
西多福韦(Cidofovirhydrate)：Sigma公司产品，CAS编号：113852-37-2，分子式C8H14N3O6P·xH2O，分子量279.19，≥98％(HPLC)。溶于37℃生理盐水，配制浓度5mg/ml。
病毒滴度的测定：移取-80℃冻存病毒原液0.1ml，加入含1ml细胞维持培养液的离心管中，即为10-1病毒稀释液，震荡混匀后，吸取0.1ml病毒稀释液，加入另一含1ml细胞维持液的离心管中，即为10-2病毒稀释液，依次类推，制备病毒10倍梯度稀释液(10-1，10-2，……，10-12)。分别取各病毒稀释液0.1ml，加入生长状态为铺满80％的96孔细胞培养板中，每个病毒稀释度平行感染4个复孔，置37℃、5％CO2细胞培养箱中，培养48小时后，显微镜下观察记录细胞病变(CPE)，统计分析CPE情况，利用Behrens-Karber法，计算病毒的效价。
lgTCID50＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)×稀释度对数之间的差+lg(高于50％病变率的稀释度)。
实施例1、生物活性制剂CH2009的制备及成分鉴定
一、生物活性制剂CH2009的制备
1、从-80℃的超低温冰箱中取出刺激抗原(痘苗病毒)，放置37℃的水浴中迅速溶解后，加入适量的PBS，制备滴度为1×106TCID50/ml的接种用病毒液。
2、挑取健康成熟新西兰大白兔，重约2.7-3.0千克，剪去背部毛发，并用75％酒精棉球擦拭消毒去毛部位，皮内接种上述病毒液0.05ml/接种点，共接种100-120个位点/兔。
3、接种病毒后饲养4-5天，将出痘症状良好、颜色由红润转为紫红、皮肤增厚和皮下有水肿的新西兰大白兔，安乐处死，15min内完成采皮，兔皮大小约为20×20cm，重量约200g，随后，用塑料袋包装兔皮，立即存放在-80℃的冰柜中备用。
4、将冷冻大小约为20×20cm兔皮切成大小约为1×1cm的小块，并全部放入其自身重量3.5倍(约200g×3.5＝700g)的2％苯酚水溶液(体积百分含量，即100体积的溶液中含有2体积的苯酚和98体积的水)中，迅速通入氮气3min，然后密封，4℃条件下，放置72h，待其变为乳状液体后，3000rpm离心10min，取上清液，用5号滤纸(孔径为2.5μm)过滤(常压)，得到褐色的溶液I。
5、向溶液I通入氮气3min，用1M盐酸将溶液I的pH值调至5.0，于水浴中煮沸30分钟，立即降温至28℃，3000rpm离心10min后，用5号滤纸(孔径为2.5μm)低压过滤，得到溶液II。
6、向溶液II通入氮气3min，用1M氢氧化钠将溶液II的pH值调至9.2，于水浴中煮沸30min，立即降温至28℃，先后用5号滤纸(孔径为2.5μm)和0.45μm滤膜低压过滤，得到溶液III。
7、向溶液III通入氮气3min，用1M盐酸将滤液pH值调至4.5，向溶液III通入氮气3分钟，随后，加入40g活性炭，于30℃条件下持续搅拌4h，停止搅拌后，静置30min，抽弃上层清液，氮气环境下，用5号滤纸(孔径为2.5μm)低压过滤余下物质，然后，用注射用生理盐水(pH8.0)浸泡和清洗活性炭，氮气环境下，用5号滤纸(孔径为2.5μm)低压过滤，弃去滤液，收集和贮存所述活性炭于容器内，加入400ml注射生理盐水，用1M氢氧化钠将溶液pH调至11.0，连续搅拌4h。氮气环境下，用0.45μm滤膜过滤(常压)，并用40ml注射生理盐水充分冲洗所述活性炭，得到溶液IV。
8、用1M盐酸将溶液IV的pH调至6.0，通入氮气(充满即可)5min后，将溶液IV密封于容器内，加热至121℃，保持20min，然后冷却至40℃以下，得到溶液V。
9、将溶液V抽入减压蒸馏器，并将减压蒸馏器内的空气换为氮气，60℃条件下，减压蒸馏至体积为5ml，5号滤纸(孔径为2.5μm)过滤(常压)后，随后，用0.2μm滤膜过滤(常压)，获得体积约为5ml的生物活性制剂，命名为CH2009。
二、生物制剂CH2009成份的鉴定
1、蛋白质的定性检测
移取生物活性制剂CH2009适量，利用考马斯亮蓝法(Bradford法)，开展蛋白质的定性检测，检测蛋白质。
2、氨基酸和多肽等成份的定性检测
移取生物活性制剂CH2009适量，利用茚三酮反应法定性检测氨基酸及多肽。
3、氨基酸和核苷酸等成份的鉴定
移取生物活性制剂CH2009适量，利用液相色谱法检测氨基酸、核酸等物质的种类和含量。
结果显示：生物活性制剂CH2009为无色或淡黄色液体，pH值为7.5，在265-275nm具有紫外吸收，茚三酮反应为阳性，蛋白质检测为阴性。利用高效液相色谱技术，开展CH2009的有机成份和含量检测，结果显示，该生物活性制剂CH2009含有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等13种氨基酸类化合物，并且含有尿刊酸、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤和胸腺嘧啶等5种核酸类化合物，各种化合物的含量分别为(μg/ml)：天冬氨酸0.3、苏氨酸0.2、丝氨酸0.5、谷氨酸1.1、甘氨酸0.5、丙氨酸0.6、缬氨酸0.3、异亮氨酸0.1、亮氨酸0.3、酪氨酸0.4、苯基丙氨酸0.2、赖氨酸0.1、组氨酸0.2、尿刊酸18.2、尿嘧啶9.5、次黄嘌呤1.1、黄嘌呤8.6、胸腺嘧啶2.0。可见，生物制剂CH2009为含多种氨基酸和核苷酸的生物提取物，其作为抗病毒药物使用势必具有毒性低和吸收率高等显著优势。
实施例2、生物活性制剂CH2009的抗痘病毒活性的测定
本实施例中，将以本领域公认的天花病毒替代病毒模型——痘苗病毒和鼠痘病毒作为供试痘病毒，分别从细胞和动物水平研究生物活性制剂CH2009对天花等痘病毒的抗病毒活性。
一、生物活性制剂CH2009体外抑制痘病毒感染活性的测定
供试病毒及相应的敏感细胞：痘苗病毒WR株(VacciniaVirusWRStrain)、鼠痘病毒莫斯科株(EctromeliaVirusesMoscowstrain，ECTV-MOSstrain)、冠状病毒(鼠肝炎冠状病毒A59株，简称MHV-A59)、5型腺病毒(dl309株)、肠道病毒71型Hn2株(EV71-Hn2)。痘苗病毒和鼠痘病毒的敏感细胞为CV-1细胞；腺病毒的敏感细胞为293细胞；MHV的敏感细胞为17Cl-1细胞；EV71的敏感细胞为Vero细胞。
取单层细胞生长密度约为80％的96孔培养板，移去细胞生长培养液，依次移取100μl经过10倍梯度稀释的对应病毒液，随后，分别通过以下2种方式添加生物活性制剂CH2009：
A.与等体积的生物活性制剂CH2009溶液充分混合后，依次加入96孔细胞培养板中；
B.病毒感染24小时后，移去培养基，2×培养基与等体积的生物活性制剂CH2009溶液充分混合后，依次加入96孔细胞培养板中；
最后，于细胞培养箱中培养48小时，每组实验设置阴性对照组(不感染病毒，不加入生物活性制剂CH2009)与阳性对照组(感染等量病毒，但不加入生物活性制剂CH2009)，每日于倒置显微镜下观察，阳性对照组细胞病变为“++++”时，检测各组的病毒滴度(TCID50)，记录实验结果。
实验同时设置以美国FDA批准的抗天花病毒储备药——西多福韦为阳性对照药，具体是以等体积的浓度为5mg/ml的西多福韦替代生物活性制剂CH2009的对照。
结果显示：利用痘苗病毒、鼠痘病毒、冠状病毒、肠道病毒和腺病毒的细胞感染模型，分别在病毒感染的同时和病毒感染后24小时两种条件下，添加生物活性制剂CH2009，通过观察病毒感染导致的CPE，比较分析生物活性制剂CH2009对病毒滴度(TCID50)的影响，结果发现，生物活性制剂CH2009既可分别导致痘苗病毒的滴度降低103.3和103.1倍，也可分别引起鼠痘病毒的滴度降低103.4和103.0倍，而相应的阳性对照药品西多福韦，可分别导致痘苗病毒和鼠痘病毒的滴度降低104.3和104.0倍以及104.0和103.8倍。两种条件下，生物活性制剂CH2009对冠状病毒、肠道病毒和腺病毒的滴度均无任何影响，虽然阳性对照药物西多福韦对腺病毒的感染滴度一定的影响(病毒滴度分别减低101.4和101.1倍)，但对冠状病毒(MHV)和肠道病毒(EV71)的滴度也均无影响。结果具体如表1所示。
表1生物活性制剂CH2009抑制不同病毒感染宿主细胞的效果
注：A.病毒感染同时给药；B.病毒感染后24hrs给药；C.阴性对照；D.阳性对照。
根据上述实验结果，可见：生物活性制剂CH2009可特异性的高效抑制痘苗病毒和鼠痘病毒的感染，虽然效率稍低于对照药物西多福韦，但仍然均可显著降低病毒滴度1000倍以上，同时，生物活性制剂CH2009对冠状病毒、肠道病毒和腺病毒均无抑制效果，说明生物活性制剂CH2009确实仅对痘类病毒具有特异的抑制作用。
二、生物活性制剂CH2009的体内抗痘病毒攻击效果分析
供试病毒：鼠痘病毒莫斯科株(EctromeliaVirusesMoscowstrain，ECTV-MOSstrain)。
1、鼠痘病毒LD50的测定
3-4周龄雌性Balb/c小鼠随机分为6组，每组10只。将鼠痘病毒原液10倍梯度稀释，依次将不同稀释度的鼠痘病毒稀释液腹腔接种小鼠，剂量为100μl/只，每日观察小鼠发病状况，统计记录小鼠体重及死亡情况，利用Behrens-Karber法，计算鼠痘病毒的半数致死量(lethaldose50％,LD50)，即能够引起一半数量试验小鼠死亡的鼠痘病毒的剂量。
2、生物活性制剂CH2009的体内抗病毒攻击效果分析
3-4周龄雌性Balb/c小鼠随机分为8组，每组15只。腹腔接种剂量为100LD50鼠痘病毒感染混合液，剂量为100μl/只。分别以4种方式给药：A.感染病毒的同时给药，西多福韦的给药剂量为15mg/kg体重，体积为200μl，生物活性制剂CH2009的给药剂量为原液200μl，1次/天，200μl/次，腹腔注射，连续给药3周；B.感染病毒后24小时给药，西多福韦的给药剂量为15mg/kg体重，体积为200μl，生物活性制剂CH2009的给药剂量为原液200μl，1次/天，200μl/次，腹腔注射，连续给药3周；C.阴性对照，给药但不攻毒，西多福韦的给药剂量为15mg/kg体重，体积为200μl，生物活性制剂CH2009的给药剂量为原液200μl，1次/天，200μl/次，腹腔注射，连续给药3周；D.阳性对照，PBS代替药品，100LD50鼠痘病毒攻毒。每日观察各组小鼠发病状况，连续5周统计记录小鼠体重及死亡情况，分别计算小鼠的生存率和病死率。
结果显示：利用小鼠模型，腹腔感染滴度为100LD50的鼠痘病毒，分别在病毒感染的同时和病毒感染后24小时，分别添加生物活性制剂CH2009和对照药品西多福韦，连续观察5周后，结果发现，攻毒小鼠前2周均表现出不同程度的食欲减退、体重降低、毛发耸立和精神状态差等临床症状，随着药物的注射，从第3周开始，给药组小鼠逐渐好转，而非给药组染毒小鼠开始出现弓背、禁食等严重病症，甚至病亡情况，并在1周之内全部病亡。第5周后统计结果显示，两种给药条件(“病毒感染后24hrs给药”和“病毒感染同时给药”)下，注射生物活性制剂CH2009的攻毒小鼠存活率分别为66.67％和80％，注射对照药品西多福韦的染毒小鼠存活率分别为86.67％和93.33％，而没有给药的染毒小鼠全部死亡。结果具体如表2所示。虽然生物活性制剂CH2009对小鼠的保护效果稍低于对照药物西多福韦，但其超过半数的保护效果仍显示出极高的潜在应用价值。
表2生物活性制剂CH2009的小鼠攻毒保护效果
注：A.病毒感染同时给药；B.病毒感染后24hrs给药；C.阴性对照；D.阳性对照。
本实施例的结果显示：在细胞和动物水平，生物活性制剂CH2009均显示出对痘苗病毒和鼠痘病毒等痘类病毒特异的抑制作用，虽然其抗病毒的效率稍低于西多福韦，但是，生物活性制剂CH2009为含多种氨基酸和核苷酸的生物提取物，具有毒性低和吸收率高等显著优势，而且，经过进一步的浓缩提纯，其抵抗包括天花病毒在内的多种痘类病毒的效果必将大大提升，因此，作为目前国际上唯一的抗天花等痘类病毒的生物活性物质，具有极高商业价值。
Claims (10)
1.生物活性制剂CH2009在如下(1)或(2)中的应用：
(1)制备用于抑制痘病毒感染的产品；
(2)用于抑制痘病毒感染；
所述生物活性制剂CH2009按照包括如下步骤(a1)-(a6)的方法制备获得：
(a1)取离体的新西兰大白兔的炎症皮肤，放入到所取炎症皮肤自身重量3-4倍的体积百分含量为2％的苯酚水溶液中，通入氮气，密封后2-6℃放置60-80h，离心，取上清液，过滤，得到溶液I；
(a2)向所述溶液I中通入氮气，将所述溶液I的pH调至5.0±0.2，水浴煮沸25-35min，降温至28±2℃，离心，取上清液，过滤，得到溶液II；
(a3)向所述溶液II中通入氮气，将所述溶液II的pH调至9.2±0.2，水浴煮沸25-35min，降温至28±2℃，过滤，得到溶液III；
(a4)向所述溶液III中通入氮气，将所述溶液III的pH调至4.5±0.2，向所述溶液III中通入氮气，加入活性炭，于30±2℃条件下持续搅拌2-6h，停止搅拌后，静置25-35min，抽弃上层清液，氮气环境下过滤余下物质，然后用生理盐水浸泡和清洗所述活性炭，氮气环境下过滤，弃去滤液，收集和贮存所述活性炭于容器内，加入生理盐水，将溶液pH调至11.0±0.2，连续搅拌2-6h，氮气环境下过滤，弃去滤液，并用生理盐水冲洗所述活性炭，得到溶液IV；
(a5)将所述溶液IV的pH调至6.0±0.2，通入氮气后，将所述溶液IV密封于容器内，加热至121±2℃，保持15-25min，然后冷却至40℃以下，得到溶液V；
(a6)将所述溶液V抽入减压蒸馏器，并将所述减压蒸馏器内的空气换为氮气，60±2℃条件下，减压蒸馏，过滤，所得滤液即为所述生物活性制剂CH2009。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤(a1)中，所述新西兰大白兔的炎症皮肤为由于皮内接种了痘病毒而引起皮肤炎症的新西兰大白兔的皮肤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述痘病毒为痘苗病毒。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述痘病毒的接种量为5×106～6×106TCID50每只新西兰大白兔。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：步骤(a1)中，所述过滤为采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤；
步骤(a2)中，所述过滤为采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤；
步骤(a3)中，所述过滤为先用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤，再用0.45μm滤膜进行过滤；
步骤(a4)中，前两次所述过滤均为采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤，第三次所述过滤为采用0.45μm滤膜进行过滤；
步骤(a6)中，所述过滤为先采用孔径为2.5μm的滤纸进行过滤，再用0.2μm滤膜进行过滤。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：步骤(a1)中的所述炎症皮肤的重量、步骤(a4)中的所述活性炭的重量、步骤(a4)中第一次使用的所述生理盐水的体积、步骤(a4)中第二次使用的所述生理盐水的体积，以及步骤(a6)中进行所述减压蒸馏后的液体体积的配比为200g：40g：400ml：40ml：5ml。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述抑制痘病毒感染为如下(a)或(b)：
(a)在与痘病毒同时作用于宿主或宿主细胞时，抑制所述痘病毒对所述宿主或所述宿主细胞的感染；
(b)治疗痘病毒感染。
8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：在(1)或(2)中，所述痘病毒为能够感染哺乳动物的痘病毒。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述能够感染哺乳动物的痘病毒为天花病毒、痘苗病毒或鼠痘病毒。
10.一种用于抑制痘病毒感染的产品，为按照权利要求1-6任一中的包括步骤(a1)-(a6)的方法制备获得的生物活性制剂CH2009。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20200417 |