TWI359669B - - Google Patents

Description

13.59669 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種醫藥組合物，特別係關於一種治 療輪狀病毒及/或呼吸道融合病毒感染之醫藥組合物。本 發明亦關於一種製備治療輪狀病毒及/或呼吸道融合病 毒感染之醫藥組合物之方法。

【先前技術】

急性感染性腹瀉在世界上之諸多區域中係疾病及 死亡之主要肇因。在發展中國家中’腹瀉疾病之影響係 相當驚人的。就亞洲、非洲、及拉丁美洲而言’估計海 年共有介於三十至四十億件腹瀉病例’其中約有五百至 一千萬件造成死亡（Walsh，J.A· etal: N· Eng· J. Med” 301: 967_974(1979))。現已辨識出，輪狀病毒（R〇tavirus)為嬰 兒及幼童嚴重腹瀉最重要之肇因之一（Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields et al., Raven Publisher, Philadephia, 1996)，且經估計，輪狀病毒疾病每年造成 超過一百萬人之死亡。 此外，呼吸道融合病毒（Respiratory syncytial virus; RSV)為造成嬰兒及幼兒的病毒性肺炎及支氣管炎的主 要原因，其普遍造成6週至6個月大的嬰兒相當嚴重之 疾病症狀。因此’開發出新的藥品，以預防或治療輪狀 病毒及呼吸道融合病毒為全世界研究的重點之一。 輪狀病毒目前已有兩支口服疫苗上市，分別是葛蘭 素藥廠生產的Rotarix®與默沙東藥廠的R〇taTeq⑧，兩支 5 疫，的，究報告皆證實預防效果達到95%，但是保護期 限只有ί個月’並且還伴隨引發腸套#的風險。就治療 方面，了，目前治療輪狀病毒主要還是靠支持性的療 法還f有針對輪狀病毒具有抑制作用的藥物上市。 呼及道融合病毒目前還沒有真正有效的疫苗被開 發出來，只有透過RSV_IVIG (商品名RespiGam(g))和 pahvizumab(商品名Synagis@)這類RSv中和抗體的被動 性免疫預时法來肋RSV錢，但減效有限。治療 方面，核甘酸製劑Ribavirin (商品名viraz〇le)，是目前 唯一通過認證的抗RSV藥物，由於這樣的藥物成效也還 .有改壤的笔間’因此’發展出一些新的抗呼吸道融合病 毒的藥物有其必要性。 【發明内容】 主有鐘於此，本發明提供一種有別於傳統治療輪狀病 毋及/或呼吸道融合病毒感染之醫藥組合物，其係利用低 溫萃取步驟來獲得一藍藻萃取物，接著將之與醫藥可接 受之載體混合而製得的。 本發明之目的係提供一種含有藍藻萃取物之醫藥 組合物’其係具有抑制輪狀病毒及/或呼吸道融合病毒感 染及/或複製之能力。 本發明另一目的係提供一種製造上述醫藥組合物 之方法。 為達上述目的，本發明係提供—種用於治療輪狀病 毒及/或呼吸道融合病毒之醫藥組合物，其包含/治療有 效1的藍藻（Spirulina)萃取物及一醫藥可接受之載體。 -醫Ϊ可ϊί實施Ϊ樣中，該醫藥組合物係進-步包含 ^接叉之佐藥、賦形劑或添加物。 顆粒實施態财’該f藥組合物細粉末狀、 顆粒狀、液狀、膠狀或膏狀存在。 品、：較巧=;醫藥組合物之劑型係以食 樂。°、试劑或營養補充劑之形式提供。 注射f佳實施態射，該1餘合物係經由口服、 於一&皮下埋植或皮膚貼片方式施用於對象物。 於預防 病毒2?:=中,該醫藥組合物係適邮 呼吸道融2另提供一種用於製備治療輪狀病毒及/或 ΐ效之醫藥組合物之方法，其包含：一治療 體，且前'^^(splrulma)萃取物及一醫藥可接受之載 而得：(柄；ΐΐ取物係在-25〜18°c經由下列步驟萃取 (b)o°c以、溱5加入低張緩衝液，充分攪拌均勻； 化，收集藍過夜；（c)靜置解滚；⑷分離機分離純 較佳係在-2s刀，，及(e)喷霧乾燥。而前述藍藻萃取物 較佳係在4〜東靜置過夜。又，前述藍藻萃取物 物，而藉由一低溫萃取步驟來獲得一藍藻萃取 或呼吸道^入3其之醫藥組合物施用至一受輪狀病毒及/ 病毒及/或^病t感染之病患上’其係可有效抑制輪狀 吸道融合病毒感染及/或複製。此外，由於 13.59669 S亥監藻萃取物係在低溫萃取而得， 取物中有減分之生物邱。Q此係可保存藍蕩萃 實施方式】 本發明提供之醫藥組合物，其係 有效成分’利用其具有抑制抑制輪狀病毒及

合病毒之感染及/或複製之能力，將之應 提供消費者-種㈣於傳統治療輪狀絲及/或呼吸道 融合病毒感染之藥物。 本發明係提供-種用於治療輪狀病毒及/或呼吸道 融合病毒之醫藥被合物…’其包含—治療免效量的發轉 取物及-醫藥可接受之載體。而該醫藥組合物係可進一 步選擇性地包含醫藥可接受之佐藥、賦型劑或添加物。

其中前述載體”可能包含惰性成分，該惰性成分 不會與本發明之醫藥組合物内的其他成分發生實質反 應。可利用彳示準藥物劑型技術，如描述於Remingt〇n，s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company,

Easton，PA.中的方法。合適之藥物載體包含，例如，但 不限於無菌水、生理食鹽水、抑菌食鹽水（包含約〇 9% mg/mL笨基醇的食鹽水）、磷酸緩衝液食鹽水、漢克溶 液、林格式乳糖液或其他製藥技術習用之載體。 前述“賦型劑”可以有多種功能及目的，例如：在 口服劑型之旋劑製造時，加入崩散劑以使錠劑能在胃腸 道中朋散成小顆粒，以利吸收；又如加入著色劑以增加 美觀等；至於其他非口服製劑，例如：針劑、懸浮劑、 =、栓劑、喷霧等，各有其合適的賦型劑和作用目的。 ;ί ί賦可i括，例如，但不限於乳糖、甘露醇、 上 、明膠、山梨糖醇、海澡糖、 ，木⑽、澱粉、微晶纖維素、甲基纖維幸、阿拉 同組合等，型劑的使用已是本技術領 象後：係指該化合物劑量在提供給-對 =體外獲得預期的活性。以流行性感冒為:;里= 二=====症狀的減 =體:來決定，例如:對象的當時健康象 及對藥物的忍受度。劑量也與疾病的程度、 他因：此領域之人士能依據前述或其 a)萃取物及-醫藥可接受之載= ⑷有：籃物係在-25〜18。。經由下列步驟萃取而得： 以下靜罟、Γ」7加入低張緩衝液，充分攪拌均勻；（b)〇t>c 藍色=及；r (物機分離，^ 用以供利用本發明之實施例’然本實施例並非 X明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明 之精神和範圍内，當可作各種之更動與潤飾，因此，本 發明之保護範圍，當視後附之申請專利範圍所界定者為 準。 實施例： L細胞株：MA104(胎兒猴腎臟細胞）、HEp-2(人類猴癌 細胞）。 2.病毒株：人類輪狀病毒Wa及G9型菌株(VR010591); 呼吸道融合病毒臨床病毒株（臺大醫院）。 3'待谢藥物藍藻萃取液;其包·含藍善萃取物.及無.菌务一 PBSA，即本發明之一醫藥組合物。 實驗方法 A·細跑培養 將可於體外連續培養之細胞株MA104細胞與 HEp-2細胞，由冷凍保存於液態氮中取出後快速解凍， 經離心去除冰凍保存液，加入含有胎牛血清之細胞生長 培養基’移至細胞培養瓶中，置於内含5% C02之37°C 培養箱進行培養。每三至四天進行一次細胞繼代培養， 當單層細胞長滿培養瓶時，將培養基移除，以填酸鹽緩 衝液(PBS)清洗兩次後，加入胰蛋白質酵素(trypsin)作用 5至10分鐘，見細胞脫落即可加入生長培養基。細胞經 充分混合均勻後’即以1 : 4之比例留下部份細胞於培 養瓶中，或經計數細胞數目後’稀釋成適當的濃度，以 13.59669 供培養病毒或後續測試之用。 B·病毒培養

將人類輪狀病毒接種於MA104細胞，呼吸道融合 病毒接種於HEp-2細胞。輪狀病毒接種之前需先以膜蛋 白質酵素於37°C活化病毒30分鐘。病毒接稜後置於37 °C使病毒吸附於細胞，一小時後，換上新鮮的維持丨立養 基’置於内含5% C〇2冬37°C培養箱進行培養，輪&病 毒則需旋轉培養。培養直至HEp-2細胞大於75%細胞出 現細胞融合狀細胞病變效應（CPE; cytopathic effects)或 MA104:細论大於.75%:細胞破碎脱落即可利用.反晷冷珠 解象法收取病毒。病毒液在4°C 5000 rpm之條件下離心 10分鐘，以移除細胞沉澱物。將已去除細胞的病毒培養 上清液（即為後附實驗中所使用之病毒液）以少量分裝於 3mL小玻璃管内，保存於_8〇°C。

C.藍藻萃取物溶液製備 將粉末狀之藍藻萃取物以無菌之PBSA稀釋成25 mg/mL·，且不再過濾，並將其保存於_2〇°C 〇之後實驗皆 以此保存液再稀釋成適當濃度。 D·試管培養初步評估測試藍藻萃取液抑制病毒之作用 將適當濃度之MA104或HEp-2細胞培養於玻璃 管’第二天將以維持培養基進行序列稀釋之藍藻萃取液 與特定濃度之輪狀病毒或呼吸道融合病毒之病毒液以 11 1:1混合，於37°c~反應30分鐘後，以100混合液感 染已長滿於玻璃管底部之細胞。病毒於37。(：感染1j小^寺 後，補入1 mL含柄同濃度藍藻萃取液之維持二二: 每曰觀察細胞CPE之情形。 土 E·以MTT試驗測誠藍藻萃取液之細胞毒性 將適當濃度之MA104或HEp-2細胞培養於％孔 盤，箄二天再將以維持培養基作序列稀釋之藍藻萃取液 200 " L加入長滿細胞之％孔盤。培養3天後加、入mtT (5mg/mL) ’將細胞置於坑，5小時後，再加入作為溶 菌缓衝废(ly洳如細)亡備s如將其維持於游右振 分鐘後以〇〇57〇測定吸光度分析。 F·以MTT試驗測試藍藻萃取液抑制病毒之作用 病毒吸附前處理諸& ，適當浪度之MA104或HEp-2細胞培養於96孔 盤。第-天將韓持培養基進行序列稀釋之賴萃取液 與特定纽之魏病毒或呼料融合病毒之病毒液以 1.1此s，於37 C反應30分鐘後，於長滿細胞之96孔 盤之每孔接種100 VL之該混合液。病毒於37t培養箱 吸附一小時後，接著吸去該病毒液，再加入不含藍藻萃 取液之維持，養基2〇〇 “L。培養3天後加入MTT，將 細胞置於37C，5小時後，再加入溶菌緩衝液(DMS〇)， 將其維持於37°C.，1G分鐘後以〇]〇57。測定吸光度分析。

12 病毒吸附後處理話給 將適當 >辰度之]VIA 104或HEp-2細胞隔夜培養於96 孔盤，第二天每孔接種1〇〇 病毒液，於37〇c培養箱 吸附一小時，接著吸去該病毒液後，加入以維持培養基 作序列稀釋之藍藻萃取液200 "L。培養3天後加入 MTT ’將細胞置於37。(：，5小時後，再加入溶菌緩衝液 (DMSO)，將其維持於37。(：，10分鐘後以〇D57G測定吸 光度分析。 G.以焦點減少試驗(Focus Reduction Assay)測試藍藻 ::萃取液抑制輪狀病毒之作用 —...........— • · -· .. 病毒吸附前處理試驗 將適當濃度之MA104細胞隔夜培養於96孔盤，第 二天將以維持培養基進行序列稀釋之藍藻萃取液與特 定濃度之輪狀病毒液以1:1混合，於37〇C反應30分鐘 後，於長滿細胞之96孔盤之每孔接種1〇〇 之該混合 液。病毒於37°C培養箱吸附一小時後，吸去病毒液，再 加入不含藍藻萃取液之維持培養基2〇〇 。培養18〜24

小時後，吸去上清液並用冰曱醇固定細胞20分鐘。將 96孔盤扣乾後加入輪狀病毒抗血清(Rabbit anti HRV serum ’ 1:40) ’置於37°C培養箱作用2小時後，以PBSA 清洗三次，再加入與FITC共軛結合之山羊抗兔

IgG(FITC conjugated goat anti rabbit IgG，購自 Zymed 公司）(1:150) ’置於37°C培養箱避光作用1小時，以二 次水清洗三次，扣乾後利用螢光顯微鏡計算螢光細胞的 1359669 數目。 病毒吸附後處理試驗 將適當濃度之MA104或HEp-2細胞隔夜培養於％

孔盤弟—天母孔接種100 /z L病毒液後，於37°C培養 箱吸附一小時，吸去病毒液後加入以維持培養基作序列 稀釋之藍藻萃取液200 //L。培養18〜24小時後，吸去 上清液，並用冰甲醇固定細胞20分鐘。將96孔盤扣乾 後加入輪狀病毒抗血清(Rabbit anti HRV serum，1:40)， 置於37°C培養箱作用2小時後，以PBSA清洗三次，再 •加八與FITC共輛結合之山羊抗兔抱知)登於$ 7 C培養箱避光作用1小時，以二次水清洗三次。扣乾後 利用螢光顯微鏡計算螢光細胞的數目。 實驗結果

1·藍藻萃取液之細胞毒性 將藍藻萃取液以不同稀釋濃度，加在預先培養好之 細胞上’以MTT試驗來測試細胞活性。第一圖顯示 HEp-2及MA104細胞之MTT測試結果。與細胞對照組 比較，不論疋HEp-2或是MA104細胞，藍藻萃取液只 有在未經稀釋時（即最高濃度25 mg/mL時)具有顯著的 細胞毒性’使細胞存活率低於百分之五十，而在5 mg/mL 以下的濃度則皆無顯著之細胞毒性存在。雖然由第一圖 之結果顯*，濃度為25 mg/mL之錢萃取液使細胞存 活率低於百分之五十，但會造成此結果之原因應該是因 14 5. 13.59669 為最高濃度的藍藻萃取液(25 mg/mL)是以pBSA來稀 釋，由於不含細胞培養基，因此造成細胞生長不好而死 亡，因此，從實驗結果得知，藍藻萃取液本^對細胞而 言，並不具有顯著的毒性。 2.初步評估藍藻萃取液減緩輪狀病毒及呼吸道融合病 毒所造成之細胞病變之功效

將輪狀病毒或呼吸道融合病毒培養於試管中，培養 過程中全程加入不同7辰度之藍漆卒取液或不加藍藻萃 取液’每日觀察細胞之細胞病變，並分別於輪狀病毒感 …染後第七.日及:呼吸道:融合病毒感染後-第三-日.以顧微-鏡-

記錄下細胞病變之情形’其結果分別顯示於第二A圖及 第二B圖。第二A圖顯示不同濃度之藍藻萃取液對輪狀 病毒造成之細胞病變之抑制結果’而弟二B圖顯示不同 濃度之藍藻萃取液對呼吸道融合病毒造成之細胞病變 之抑制結果。由第二· A圖及弟·一 B圖之結果顯不適當浪 度之藍藻萃取液確實能有效抑制住病毒造成之細胞病 變，且抑制細胞病變的程度與藍藻萃取液的》農度呈正相 關。 3. MTT 試驗測試篥漆萃取液抑制呼吸道融合病毒之功 效 將呼吸道融合病毒以100 TCID5Q感染長滿96孔盤 之HEp-2細胞。在病毒感染細胞之前或之後分別以兩倍 序列稀釋之齡議萃取液先和病毒液混合或加於維持培 15 養基令，將其分別進行MTT試驗，其結果如第三圖所 示。由第三圖之結果顯示，在藍藻萃取液濃度為〇二， ，察到的細胞之存活率約為33%，此乃因為細胞已受疒 毋感染，且其並無含有藍藻萃取液，因而病毒會造成= ，死亡。此外，不論是在病毒吸附細胞之前或之後，趑 裙萃取液對於抑制呼吸道融合病毒的效果都是相^ 的，其能抑制病毒百分之五十感染力之最低藥物濃二 (ICso)約為〇.195mg/mL，而濃度更高的藍藻萃取液都二 持百分之八十以上之細胞活性。 唯 4·肇先焦戆減少試腌(奶職義則咖_狀咖^^^^ 測試藍藻萃取液抑制輪狀病秦之功效 n 將輪狀病毒以100 pfu感染長滿96孔盤之Mai〇4 、'田，。在病毒感染細胞之前或之後分別以兩倍序列 匕藻萃取液先和病毒液混合或加於維持培養基中稀= =別進行榮光焦點減少試驗，其結果如第 ，中第四圖中錢萃取液濃度為G時之數據為病毒控制 it數據。由ί:圖之結果顯示’在病毒感染細胞後給 ^能有效的=住螢就點的形成，且和藥物濃度约 呈正相關’=抑制病毒百分之五十感染力之最低藥 物遭度(IC5。)約為0.049 mg/mL，而在病毒感染前給藥也 有抑制輪狀病毒感染的效果。 综上所述，本發明所提供之包含藍藻萃取物之醫藥 級合物係具有抑制輪狀病毒及/或呼吸道融合病毒感染 及/或複製之能力，且其在病毒吸附前或吸附後提供均具 1359669 有抑制病毒感染及/或複製之功效，因此，本發明之醫藥 組合物係適用於預防及/或治療輪狀病毒及/或呼吸道融 合病毒之感染及/或複製。 其它實施態樣

所有揭露於本發明書之特徵係可使用任何方式結 合。本說明書所揭露之特徵可使用相同、相等或相似目 的的特徵取代。因此，除了特別陳述強調處之外，本說 明書所揭露之特徵係為一系列相等或相似特徵中的一 個實施例。 ——·…此外依據本說明書揭露:之_内容悉本—技術—領域:― 者係可輕易依據本發明之基本特徵，在不脫離本發明之 精神與範圍内，針對不同使用方法與情況作適當改變與 修飾，因此，其它實施態樣亦包含於申請專利範圍中。 【圖式簡單說明】

第一圖為HEp-2及MA104細胞之MTT測試結果。 第二A圖顯示不同濃度之藍藻萃取液對輪狀病毒 造成之細胞病變之抑制結果，其中a為細胞控制組；b 至e為病毒組，且分別含有濃度為3.125、0.781、0.195 及0.049之藍藻萃取液；及f為病毒控制組。 第二B圖顯示不同濃度之藍藻萃取液對呼吸道融合 病毒造成之細胞病變之抑制結果，其中a為細胞控制組 b至e為病毒組，且分別含有濃度為3.125、0.78卜0.195 及0.049之藍藻萃取液；及f為病毒控制組。 13.59669

第三圖為MTT試驗測試藍藻萃取液抑制呼吸道融 合病毒之結果。 第四圖為螢光焦點減少試驗測試藍藻萃取物抑制 輪狀病毒之結果。 【主要元件符號說明】

Ml 18

Claims (1)

1. 2 民國100年84 申請專利範圍： •一種用於抑制輪狀 醫藥組合物，其包含:及/或呼吸道融合病毒感染之 物及一醫藥可接受效量的藍藻（Spirulina)萃取 .如申請專利範圍第1項 包含一醫藥可接受之佐=述之醫藥組合物，其進一步 .如申請專利範圍第1項樂賦形劑或添加物。 4 末狀、顆粒狀、液狀、=之醫藥組合物，其係以粉 .如申請專利範圍第i項戶二:或存在。 以食品、飲品、藥品、試> 7之醫藥組合物，其劑型係 .如申請專利範圍第1項=、或營養補充劑之形式提供。 口服、注射、吸入、焓^述之醫藥組合物，其係經由 病患。 埋植或皮膚貼片方式施用於 6 ——I

   如申請專利範圍第1項 於抑制病毒錢及/或複ϋ之醫藥組合物’其係適用 一種用於製備抑制輪狀 醫藥組合物之方法，二Α或呼吸道融合病毒之 (Spimlina)萃取物及_醫/藥^受:有^量的藍藻 藻物係在-25〜阶經由下列步驟萃前述藍 b 2藍蒸粉加入低張緩衝液，充分攪拌均V. (b) 零度以下靜置過夜； 勺勺’ (c) 靜置解凍； (d) 分離機分離純化，收集藍色分液；及 (e) 噴霧乾燥。 如申請專利範圍第7項所述之方法，其尹前述藍蕩萃 19 8. 13.59669 民國100年8月4日 取物係在-25〜-10°C冷凍靜置過夜。 9.如申請專利範圍第7項所述之方法，其中前述藍藻萃 取物係在4〜18°C解凍。

   20