KR0149677B1

KR0149677B1 - 안정화된 생 백신

Info

Publication number: KR0149677B1
Application number: KR1019920015938A
Authority: KR
Inventors: 구니아끼 고야마; 주이찌로 오사메
Original assignee: 후까이 고노스께; 자이단 호오진 한다이 비세이부쓰 뵤오 겡뀨까이
Priority date: 1992-05-05
Filing date: 1992-09-02
Publication date: 1998-10-15
Also published as: AU2088992A; DE69215355T2; US6039958A; TW205570B; EP0568726A3; CA2075521A1; DE69215355D1; US5948411A; EP0568726A2; KR930023039A; EP0568726B1; ATE145336T1; CA2075521C

Abstract

Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실질적으로 제거한, 수두 비루스 및 안정화제를 함유하는 안정화된 생 백신을 공개한다. 이 안정화된 생 백신은 저장 안정성 및 내열성에서 극히 탁월하다. 또한, 각각 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실질적으로 제거한 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴으로 부터 선택된 적어도 하나의 요소를 포함하는 생 수두 백신의 향상된 안정화제를 공개한다. 이 안정화제는 수두 비루스를 포함하는 생 백신을 안정화시키는데 유리하게 사용될 수 있다. Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온의 실질적인 제거는 수두 비루스 및 안정화제를 함유하는 생 백신 내에 존재하는 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 킬레이트제로 차폐하거나 또는, 정제하여 내부에 포함된 Ca²⁺이온 및 또는 Mg²⁺이온을 제거한 후의 젤라틴 및/또는 젤라틴 유도체를 안정화제로 사용함으로써 수득될 수 있다.

Description

안정화된 생 백신

본 발명은 탁월한 저장 안정성 및 탁월한 내열성을 지닌 안정화된 생 백신에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 수두 비루스(Varicella virus)를 포함하는 비루스 성분 및 안정화제를 포함하며, Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실질적으로 제거한 안정화된 생 수두 백신에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 비루스 성분으로서 수두 비루스를 포함하는 생 백신의 안정화에 유용하며, 각각, Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실질적으로 제거한 젤라틴 및 젤라틴 유도체로 부터 선택된 적어도 하나의 구성 성분을 포함하는 안정화제에 관한 것이다.

1974년 세계보건기구(WHO, the World Health Organization)가 면역에 관한 전세계적 확장 계획안(EPI, the Expanded Programme on Immunization)을 시작한 이래 저장 안정성 및 내열성 면에서 탁월한 다양한 백신에 대한 요구가 증가되어 왔다. 그 요구에 부응하기 위해 보다 증진된 안정성을 가진 백신 개발을 위한 연구가 세계 여러곳에서 광범위하게 행해져 왔다. 그 연구의 결과로서, 세계의 열대지방 및 한대지방 어느곳의 온도에서도 사용할 수 있는 몇몇 유형의 백신이 개발되어 실용화되었다. 이들 공지의 향상된 백신의 예로는 펄투시스 톡소이드(pertussis toxoid), 상기 톡소이드를 사용하는 3가 DPT(diphtheria-pertussis-tetanus) 백신(미국 특허 번호 4,849,358) 및 동결건조된 불활성 일본뇌염 백신이 있다[미국 뉴욕의 라벤(Raven) 출판사 발행, 바이 러스학 분야 2판, 1권, 782-783 페이지, 1990].

그러나, 안정성 면에서 만족할 만큼 향상되지 않은 다양한 유형의 백신들이 있다. 예를 들어, 홍역, 독일 홍역(rubella), 이하선염 및 수두 비루스의 백신 같은 생 비루스 백신에 대해 열안정성의 증진은 동결건조에 의해 어느정도 획득되었으나 그 증진은 여전히 불만족스럽다. 특히, 생 백신내의 사용을 위한 수두 비루스는 극도의 낮은 온도 안정성을 가지고 있어, 일반적으로 -60℃ 이하에서 비루스를 보존할 필요가 있다. 일반적으로, 세포결합에 감수성 지닌 헤르페스 비루스 군에 속하는 비루스 즉, 수두 비루스는 열안정성면에서 극히 열등하다. 이러한 열에 대한 불안정성 때문에 수두 비루스 백신에 대한 만족할 만한 안정화제를 개발하는 것이 매우 어려웠다. 따라서, 생 수두 비루스 백신 뿐 아니라 수두 비루스 및 홍역, 독일홍역 및 이하선염의 비루스 같은 다른 비루스를 포함하는 혼합 생 백신에 대해 탁월한 열저항성을 지닌 수두 비루스 함유 생 비루스 백신을 현실화 하는 것은 매우 어려웠다.

일반적으로, 백신의 안정화제로서 일반적으로 사용되는 물질로서는 예를 들어, 소듐 글루타메이트, 아르기닌, 리신 및 시스테인 같은 아미노산, 글루코스, 갈락토스, 프락토스 및 만노오스 같은 단당체, 수크로스, 말토스 및 락토스 같은 이당체, 솔비톨 및 만니톨 같은 당 알코올, 올리고사카라이드, 전분, 셀룰로오스 및 그 유도체 같은 다당류 인간 혈청 알부민 및 소혈청 알부민, 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체, 및 항산화제인 아스코르브산을 들 수 있다. 이들 물질을 공지문헌 즉, 1972년 일본국 도쿄 대학 편찬협회에서 발행한 네이(Nei) 저 도께쯔-간소 토 호고 부쉬쯔(Toketsu-kanso To Hogo Busshutsu:동결 건조 및 보호 물질) 1-176 페이지 및 1964년 일본국 니깐고교신문 주식회사에서 발행한 오타(Ota) 등 저 신꾸 기주쯔 고자(8):신꾸 간소(Lecture on Vacuum Technology(8):Vacuum Drying, 176-182페이지에 기술되어 있다.

그러나, 이들 물질의 안정화 효과는 독립적으로 사용되었을 때에 일반적으로 열등하다. 따라서, 이들 안정화제들은 일반적으로 결합 상태로 사용된다. 예를 들어, 각각 아미노산, 당류, 당 알코올 및 펩톤에서 선택된 4가지 성분을 결합하여 사용하는 4성분 혼합 안정화제가 안정화 효과를 상승적 또는 부가적으로 증가할 수 있도록 제안되었다.

상기에서 기술한 바와같이, 생 수두 백신은 열 안정성에 있어 매우 열등하다. 비록 다른 유형의 생 비루스 백신에서의 안정화제로 널리 사용되는 아미노산, 당류, 당 알코올, 젤라틴 및 젤라틴 유도체가 생 수두 백신에 첨가되더라도 생 수두 백신의 만족할 만한 안정성을 얻을 수 없다. 따라서, 이들 공지의 안정화제를 포함하는 생 수두 백신을 실온에서 오랜기간 보존했을때, 이 백신의 감염 역가가 감소한다. 즉, 단일 비루스 성분으로서 수두 비루스를 포함하는 생 수두 백신의 경우 뿐만 아니라, 수두 비루스 및 홍역, 독일 홍역, 이하선염, 소아마비 및 감기의 생 비루스 같은 다른 비루스를 포함하는 혼합(다가) 생 백신의 경우에도, 생 수두 백신 이외의 생 비루스 백신을 안정화 하는데 효과적인 공지의 안정화제를 첨가하더라도 만족할 만한 안정화는 얻을 수 없다. 따라서, 수두 비루스를 포함하는 안정한 생 백신을 제조하는 것은 매우 어려웠다. 더구나, 일반적으로 홍역, 독일 홍역 및 이하선염의 생 백신의 안정화에 효과적인 젤라틴 및/또는 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체를 수두 비루스를 포함하는 생 백신에 첨가했을 때 백신의 안정성이 심지어 감소하는 문제를 겪어 왔다. 심지어, 젤라틴 및/또는 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체 이외의 안정화제들 만을 사용하더라도 생 수두 비루스를 함유하는 혼합 백신에 대해 심각한 문제가 자주 발생하였다. 다시 말하면, 수두 비루스 이외의 비루스 즉, 자신의 배양계로 부터 수확한 홍역 비루스를 사용해 생 백신을 제조하였을때, 백신의 안정성은 젤라틴 및 젤라틴 유도체 이외의 공지의 안정화제를 단순히 첨가함으로써 유지된다. 그럼에도 불구하고, 그 자신의 배양계로 부터 수확한 생 수두 비루스를 상기 백신에 첨가하면, 결과 혼합 백신의 수두 비루스의 안정성이 저하하여, 혼합 백신은 생수두 비루스를 함유하는 혼합 백신으로서 만족할 만한 기능을 나타낼 수 없다.

이러한 상황에서 본 발명자들은 비루스 성분으로서 약독화(弱毒化)된 생 수두 비루스를 함유하는 안정화된 생 백신을 제공하기 위해 상기 언급한 문제점을 해결하기 위한 광범위하고 집중적인 연구를 행하였다. 그 결과로서, 그들은 일반적으로 다른 유형의 생 비루스 백신의 안정화에 유용하다고 알려진 젤라틴 및/또는 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체의 존재 또는 부존재와 무관하게 안정성에서 일반적으로 열등했던 생 수두 비루스에 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) 같은 킬레이트제를 첨가했을때 수두 비루스 함유 백신의 안정성이 현저히 증진되는 것을 예기치 않게 발견하였다. 본 발명자들은 왜 증진된 안정성이 EDTA의 첨가에 의해 얻어지는 가의 원인에 대해 더 연구하였다. 그 결과로 생 수두 백신의 안정성은 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온의 존재 또는 부존재에 의존하여 생 수두 비루스의 안정성의 필수요건은 수두 백신으로 부터 Ca²⁺및 Mg²⁺을 실질적으로 제거하는 것임을 발견하였다. 이것은 다양한 백신 즉, 폴리오 비루스 백신의 안정성이 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온의 존재로 다소 증진되는 사실에 비추어 놀랄만한 것이다.

대부분 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온은 비루스 증식을 위해 세포 배양을 준비할 때 사용된다. 또한, 다양한 백신의 대표적 안정화제 성분으로서 최근에 광범위하게 사용되는 젤라틴은 Ca²⁺이온을 약 0.1% 이하로 함유하며, 상업적으로 이용되는 가수분해된 젤라틴은 약 0.1% Ca²⁺이온 및 약 0.01% Mg²⁺이온을 함유하는 것으로 알려져 있다.

Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 수두 비루스를 함유하는 생 백신의 안정성을 감소시키는 정확한 기작은 알려져 있지 않다. 그러나, 열에 의한 생 수두 비루스의 불활성은 이들 특정 이온의 활동에 의해 유해하게 증진되며 따라서, 백신의 감염 역가를 감소시키고, 수두 비루스 입자들의 응고가 이들 특정 이온의 작용에 의해 유발되어 백신의 불안정성을 유발시키는 것으로 추정된다.

EDTA는 자극성을 가지므로, 백신에 사용되는 바람직한 첨가제로 고려할 수 없었다. 그러나, 본 발명자들의 연구기간 동안 수두 비루스 및 안정화제를 함유하는 생 백신에 EDTA를 첨가하면 백신의 안정성이 현저하게 증가될 수 있음이 발견되었다. 그 이유는 EDTA가 배양된 세포 및 안정화제로 부터 유도된 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온에 대한 킬레이트제로서 작용하여 그 이온들을 차폐하는데 있다고 믿어진다.

상기에 언급한 새로운 발견들을 기초로 하여 본 발명이 완성되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 약독화된 수두 비루스 및 안정화제를 함유하고 높은 안정성을 가진 생 백신을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 약독화된 생 수두 비루스 및 안정화제로서 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체로 부터 선택된 적어도 하나의 요소를 포함하고, 생 수두 비루스 백신 이외의 생 백신의 안정화에는 현저한 효과를 보이나, 생 수두 비루스 백신의 안정화에는 아무런 효과를 가지지 않고 오히려 그 반대의 효과를 가지는 안정화제를 함유하는 탁월한 안정성을 가진 안정화된 생 백신을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 내부에 포함된 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온의 차폐 및 제거를 위해 상업적으로 이용되는 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체(젤라틴 및 젤라틴 유도체는 수두 비루스를 함유하는 생 백신에 대한 안정화제로서 실제로 사용되지 않는다.)를 처리하여 각각 수득한 처리된 젤라틴 및 처리된 젤라틴 유도체로 구성되는 군으로 부터 선택된 적어도 하나의 요소를 포함하는, 수두 비루스 함유 생 백신의 안정화제를 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 목적 및 다른 목적, 특징 및 장점은 하기에 기술한 상세한 설명 및 청구범위에 의해 분명해질 것이다.

본질적으로, 본 발명에 따르면, 약독화된 생 수두 비루스 및 약독화된 재조합 수두 비루스로 구성되는 군으로 부터 선택된 적어도 하나의 수두 비루스를 함유하는 비루스 성분 및 안정화제를 함유하고, Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실질적으로 제거한 안정화된 생 백신이 제공된다.

본 발명의 약독화된 생 수두 비루스는 약독화된 생 수두 비루스 및 공지의 방법으로 제조할 수 있는 약독화된 생 재조합 수두 비루스로 구성되는 군으로 부터 선택된 적어도 하나의 수두 비루스를 함유한다. 오카 균주(Oka Strain:미국 특허 번호 3,985,615:비루스 기탁반호 ATCC VR-795)가 생 수두 백신의 제조에 특히 유용한 약독화된 생 수두 비루스 균주로서 잘 알려져 있다. 약독화된 생 재조합 수두 비루스는 오카 균주의 게놈 DNA와 외부 유전자의 재조합으로 제조될 수 있다. 상기 재조합은 공지의 방법으로 쉽게 조작될 수 있다. 비루스 유전자가 외부 유전자와 재조합되는 재조합 방법의 상세한 것에 관한 참조는 유럽 특허 출원 공개 번호 0 334 530 a1에 따라 얻을 수 있다. 이 비루스 균주(오카 균주)는 본 발명에 유용하게 사용될 수 있으나, 본 발명의 수두 비루스는 이 균주에 결코 한정되지 않는다.

본 발명의 생 백신은 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 실제적으로 제거될 것이 요구된다. Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온의 실제적인 제거라는 용어는 여기서 킬레이트제를 사용한 색도계 적정에 의해 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 실제적으로 검출되지 않는 것을 의미한다.

배양 세포로 부터 유래된 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 백신 내에 함유되어 있을때, 이들 이온은 킬레이트제를 첨가하여 이 이온을 포함한 킬레이트 화합물을 형성하여 차폐될 수 있다. 킬레이트제로서 킬레이트 화합물을 형성할 수 있는 수용성 물질을 사용할 수 있다. 킬레이트 화합물을 형성할 수 있는 수용성 킬레이트제의 예로는, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 같은 폴리아미노카르복실산 및 그의 염, 시트르산 같은 옥시카르복실산 및 그의 염, 및 울트라포스페이트 같은 응축 인산을 들 수 있다.

특히 EDTA에 관해서는, EDTA 및 Ca, Co, K, Na, Li, Ni, Ba, Bi, Mg, Mn, La 및 암모늄을 그의 염으로 가지는 그의 염의 다양한 상업적으로 이용가능한 생성물들이 있다. 이들중 Ca염 및 Mg염은 바람직하지 않다. 바람직한 염은 Na염 및 K염이다. 더우기, EDTA의 첨가로 인한 pH의 변화를 최소화 시키는 견지에 EDTA의 디소듐염 또는 EDTA의 트리소듐염의 사용이 바람직하다. 또한, EDTA의 디소듐염 또는 EDTA의 트리소듐염의 사용이 바람직하다. 또한, EDTA의 유사 화합물인 수용성 에틸렌글리 콜테트라아세트산 및 그의 염이 본 발명의 킬레이트제로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 안정화제로서는 수크로스, 락토오스, 솔비톨, 소듐글루타메이트, 시스테인, 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체 같은 공지의 안정화제를 들 수 있다. 젤라틴 및 젤라틴 유도체로 구성되는 군으로 부터 선택된 적어도 하나의 요소가 안정화된 성분으로서 특히 유용하다.

본 발명에서 젤라틴 및 젤라틴 유도체는 독립적으로 또는 결합하여 사용될 수 있다.

젤라틴트로서는 예를 들어, 일본 약전(藥典)에 기술된 정제 젤라틴을 들 수 있다.

젤라틴 유도체의 예로는 가수분해된 젤라틴 및 그의 화학적 유도체를 포함한다. 가수분해된 젤라틴의 용어는 젤라틴을 가수분해에 의해 분해시켜 수득한 가수분해된 폴리펩티드 또는 상기 언급한 가수분해된 폴리펩티드의 중합에 의해 수득한 폴리펩티드를 의미한다. 가수분해된 젤라틴은 수용성이며, 분자량이 약 35,000 이하이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 젤라틴 유도체의 실예로서 겔리세이트(Gelysate, 미국 BBL 주식회사에서 제조판매하는 가수분해된 젤라틴의 상표명), 피지오겔, 네오플라즈마겔, 겔리펀돌 및 해마셀(Haemacel, 독일 Hoechst Ag에서 제조판매하는 가수분해된 젤라틴 또는 그의 화학적 유도체의 상표명) 같은 상업적으로 이용가능한 생성물을 들 수 있다. 이 젤라틴 유도체들의 상세한 것은 생물학적 표준화의 개발(Developments in Biological Standardization, 1981년 카르저 저, 48권, 207-234페이지)에 기술되어 있다. 본 발명에서는, 상표명 겔리세이트로서 쉽게 이용되는 가수분해된 젤라틴이 바람직하게 사용된다.

젤라틴 및 젤라틴 유도체의 바람직한 양은 안정화된 생 백신의 농도에 대하여 각각 약 0.02 내지 1.0%(w/v) 및 약 0.5 내지 10%(w/v)이다.

상업적으로 이용가능한 젤라틴 및 젤라틴 유도체, 특히 가수분해된 젤라틴은 일반적으로 Ca²⁺이온 및/또는 Mg²⁺이온을 함유한다. 따라서, 이들 상업적으로 이용 가능한 젤라틴 및 젤라틴 유도체를 그대로 사용할 때, 상기에서 언급한 EDTA 또는 그의 염 같은 킬레이트제를 생 백신에 첨가함이 바람직하다.

본 발명에서 사용된 킬레이트제의 양은 백신내에 존재하는 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 킬레이트 화합물로 전환시켜 이들 이온을 차폐하는데 필요한 양보다 적지 않는한 중요하지 않다. 킬레이트제의 양은 안정화된 생 백신의 농도에 대해 일반적으로 약 0.001 내지 0.1%(w/v)이다.

비루스 항원의 현탁액으로서 후에 기술할 참고 실시예 4에서 사용된 방법에 따라 제조된 0.005 내지 0.01M PBS(-)가 사용될 수 있다.

또한, Ca 및 Mg 화합물의 첨가없이 제조한 배지 199(참고 실시예 10을 볼 것) 및 MEM(최소배지:Minimum Essential Medium, 참고 실시예 1을 볼것)이 비루스 항원의 현탁액으로서 사용될 수 있다.

안정화된 생 백신 내의 각 안정화제 성분의 농도에 관해서는 안정화된 생 백신의 농도에 대해 예를 들어, 소듐 글루타메이트 약 0.01 내지 약 5.0%(w/v), 시스테인 약 0.02 내지 1.0%(w/v), 수크로스 약 0.5 내지 10%(w/v), 락토스 약 0.5 내지 10%(w/v), 솔비톨 약 0.2 내지 6.0%(w/v), 젤라틴 약 0.02 내지 1.0%(w/v), 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체 약 0.5 내지 10%(w/v) 및 EDTA 또는 그의 염 같은 킬레이트제 약 0.001 내지 0.1%(w/v)를 들 수 있다.

안정화제의 첨가 이후 최종 pH는 6.5 내지 7.5가 바람직하다. 주사에 의한 백신 투여로 인한 고통 및 상처의 발생을 경감시키는 견지에 비추어 백신은 등장점 주위의 삼투압을 가지는 것이 바람직하다.

하기에 본 발명의 안정화된 생 백신을 수득하는데 유용한 안정화제의 조제의 바람직한 4가지 실시예를 기술한다. (1) 안정화된 생 백신의 농도에 대해 약 0.01 내지 5%(w/v)의 소듐 글루타메이트, 약 0.5 내지 10%(w/v)의 수크로스, 약 0.02 내지 1%(w/v)의 젤라틴 및 약 0.5 내지 10%(w/v)의 가수분해된 젤라틴을 포함하는 안정화제. (2) 안정화된 생 백신의 농도에 대하여, 약 0.01 내지 5%(w/v)의 소듐 글루타메이트, 약 0.5 내지 10%(w/v)의 수크로스, 약 0.02 내지 1%(w/v)의 젤라틴, 약 0.5 내지 10%(w/v)의 가수분해된 젤라틴 및 약 0.001 내지 0.1%(w/v)의 킬레이트제를 포함하는 안정화제. (3)안정화된 생 백신의 농도에 대하여, 약 0.5 내지 10%(w/v)의 락토오스, 약 0.2 내지 6.0%(w/v)의 솔비톨, 약 0.02 내지 1.0%(w/v)의 시스테인, 약 0,01 내지 5.0%(w/v)의 소듐 글루타메이트, 약 0.02 내지 1.0%(w/v)의 젤라틴 및 약 0.5 내지 10%(w/v)의 가수분해된 젤라틴을 포함하는 안정화제, 및 (4) 안정화된 생 백신의 농도에 대하여, 약 0.5 내지 10%(w/v)의 락토오스, 약 0.2 내지 6.0%(w/v)의 솔비톨, 약 0.02 내지 1.0%(w/v)의 시스테인, 약 0.01 내지 5.0%(w/v)의 소듐 글루타메이트, 약 0.02 내지 1.0%(w/v)의 젤라틴, 약 0.5 내지 10%(w/v)의 가수분해된 젤라틴 및 약 0.001 내지 0.1%(w/v)의 킬레이트제를 포함하는 안정화제.

하기에 본 발명을 실시하는 상세한 방법을 설명한다.

(1) Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실질적으로 제거한 비루스 현탁액의 제조방법:

수두 비루스에 관하여 예를 들어, 수두 비루스를 숙주 세포를 이용하여 배양하고 배양 종료후, 배양 배지를 배양 용기로 부터 제거한다. 이어서, EDTA의 트리소듐염을 포함하는 0.01M 인산 완충염수(Phosphate-buffered saline, PBS)(-)를 최종 농도 0.05%(w/v)로 첨가하고, 감염된 세포를 배양 용기의 내부벽 표면으로 부터 분리한다. 이어서, 저속 원심분리를 행하여 감염된 세포를 모은다. 상기에서 언급한 용해된 안정화제를 함유하는 수두 비루스의 현탁 용액을 수집한 감염 세포에 첨가하여 감염세포를 현탁시킨다. 연속하여, 감염세포를 균질기를 사용하여 또는, 초음파 처리로 분쇄시켜 세포 부스러기를 제거하여 비루스 현탁액을 만든다.

다른 비루스들, 예를 들어 홍역, 독일홍역 및 이하선염 비루스에 대해서, 비루스 현탁액은 배양기간 동안 또는 배양 종료후 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 함유하는 배양 배지를 Ca 및 Mg 화합물의 첨가없이 제조한 배지 199 또는 MEM으로 대치하는 방법을 사용해 제조될 수 있다.

예를 들어, 홍역 비루스에 대하여, 후에 기술할 참고 실시예 4에서 제조한 PBS(-)로 감염 세포를 세척하여 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 제거하고, Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 제거한 배지 199 또는 MEM 각각에 감염세포를 현탁시키고, 결과의 현탁액을 동결해빙시키고 저속 원심분리를 하여 비루스 현탁액으로서 상층액을 수집하여 비루스 현탁액을 제조할 수 있다.

독일홍역 및 이하선염의 각각의 비루스에 대하여, 비루스 현탁액은 예를 들어, 세포막 분쇄에 의해 비루스를 함유하는 배양 배지를 농축하고, 그 결과의 농축된 배지를 초원심분리하여 비루스를 수집하고 그 비루스를 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 제거한 배지 199 또는 MEM 각각에 현탁시켜 제조할 수 있다.

안정화제를 수득한 비루스 현탁액에 첨가할 수 있다.

(2) 배양 세포로부터 유래한 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 킬레이트 화합물로 전환되어 이 이온들이 차폐된 비루스 현탁액의 제조방법:

예를 들어, 킬레이트제가 이들 금속 이온을 킬레이트 화합물로 전환시켜 이 이온들을 차폐하기 위해 비루스 현탁액에 첨가될 수 있다.

(3) Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 킬레이트 화합물로 전환되어 이 이온을 차폐한 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴의 제조방법:

예를 들어, 킬레이트제가 젤라틴 용액 또는 가수분해된 젤라틴 용액에 첨가되어 이들 금속 이온을 킬레이트 화합물로 전환시켜 차폐한다. 이러한 킬레이트제 처리된 젤라틴 및 킬레이트제 처리된 가수분해된 젤라틴은 생 수두 백신의 안정화제로서 매우 유용하다.

(4) Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실제적으로 제거한 정제된 젤라틴 및 정제된 가수분해 젤라틴의 제조방법:

정제는 예를 들어, 투석처리, 젤 여과 처리, 양이온 교환 수지 처리 및 킬레이트 수지 처리로 구성되는 군으로 부터 선택된 적어도 하나의 처리를 이용한 공지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 상기에 언급한 금속 이온이 킬레이트제에 의해 차폐되거나 또는 차폐되지 않은 상기에 언급한 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴을 젤여과 처리하거나 또는 젤라틴 용액 및 가수분해된 젤라틴 용액을 투석처리하여 상기 언급한 금속 이온을 실제적으로 제거한 정제된 젤라틴 및 정제된 가수분해 젤라틴을 수득할 수 있다. 이렇게 수득한 정제된 젤라틴 및 정제된 가수분해 젤라틴은 생 수두 백신의 안정화제로 매우 유용하다.

(5) 안정화된 수두 백신의 제조방법:

수두 비루스는 인간 이배성 세포를 사용해 배양하고, 수득한 배양액을 예를 들어, 원심분리로 정제하여 수두 비루스 파편을 수득한다. 수득한 비루스 파편에 백신 안정화제를 첨가하여, 그 결과 혼합물을 안정화된 생 백신의 복용량 당 비루스 함량이 1,000 PFU(용균반 형성단위) 이상이 되도록 희석하여 안정화된 생 수두 백신을 수득한다. 이렇게 제조한 생 백신의 일부를 안정성, 효과 및 균질성을 테스트하여 백신으로서의 적격성을 확인한다. 이들 테스트는 일본국 보건 사회부의 고시번호 195에서 제공된 생물학적 생성물의 최소요건(1989) (예를 들어, 생물학적 생성물의 최소 요건중 동결 건조된 약독화 생 수두 백신 참조)에 따라 행해질 수 있다.

적격성이 확인된 후에, 그 백신이 사용된다. 동결 건조된 백신은 부피 약 3 내지 30㎖의 유리병 또는 주사병 내의 백신을 동결건조시키고 유체가 흐르지 않도록 밀봉하고 5℃ 이하에서 저자함으로써 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 백신은 자체에 부착된 지시에 따라 사용된다. 다시 말하면, 동결건조된 백신은 사용직전에 멸균 증류수를 사용해 완전히 재구성 하여, 그 결과 용액을 예를 들어 복용량 당 0.5㎖의 양으로 피하주사에 의해 접종한다.

상기에서 언급한 것처럼, 홍역, 독일홍역, 이하선염 및 이와 유사한 것의 비루스는 수두 비루스에 비해 상대적으로 열에 안정하다. 이들 홍역, 독일홍역 및 이하선염 비루스의 백신에 대한 안정화제는 조제면에서 서로 유사하고, 당류, 아미노산, 당 알코올, 젤라틴 및 젤라틴 유도체들은 이들 비루스 백신의 안정화에 유용한 것으로 알려져 있다. 그러나, 이들 공지의 안정화제는 수두 비루스 및/또는 재조합 수두 비루스를 포함하는 생 백신에 효과적으로 사용될 수 없다.

반면에, 본 발명의 안정화제는 수두 비루스 및/또는 재조합 수두 비루스만을 포함하는 수두 백신 뿐 아니라, 수두 비루스 및/또는 재조합 수두 비루스 및 홍역, 독일홍역, 이하선염, 감기, 일본뇌염 및 간염 비루스 같은 수두 비루스 이외의 다른 비루스를 적어도 하나 포함하는 혼합(다가) 백신에도 효과적이다. 이들 혼합 백신의 예로는 수두, 홍역, 독일홍역 및 이하선염 비루스를 포함하는 사가 생 백신(일본국 특허 출원 공개 명에서 No. 58-5169 참조)을 포함한다.

본 발명에 따라, 저장성 및 열안정성이 극히 탁월한, 동결건조된 백신, 동결건조된 혼합 백신, 액체 백신 및 액체 혼합 백신 같은 다양한 유형의 안정화된 백신이 제공될 수 있다.

혼합 생 백신의 제조의 경우에, 각각의 생 백신의 대량액을 희석하고, 생 백신의 1회 복용량당 각 비루스의 함량이 1000 내지 5000 PFU 이상, 또는 5000 TCID₅₀(중간 조직 배양 감염량) 이상이 되도록 혼합하여 혼합 생 백신의 최종 생성물을 수득한다.

상기에서 언급한 대로, 약독화된 수두 비루스 및/또는 약독화된 제조합 수두 비루스를 포함하는 비루스 성분 및 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실제적으로 제거한 안정화제를 포함하는 본 발명의 안정화된 생 수두 백신은 탁월한 저장 안정성 및 탁월한 열저항성을 가진다.

안정화된 생 백신은 더 나아가 홍역, 독일홍역, 이하성염, 일본뇌염, 감기 및 간염 비루스 같은 수두 비루스 이외의 약독화된 생 비루스를 적어도 하나 포함할 수 있다.

각각 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 실제적으로 제거한 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴 같은 젤라틴 유도체를 포함하는 본 발명의 안정화제는 비루스 성분으로서 수두 비루스 및/또는 재조합 수두 비루스를 포함하는 생 백신을 안정화하는데 극히 유용하다.

본 발명은 세계보건 기구의 확장된 면역 계획에 일치하여 세계적 규모의 예방 접종의 확산 및 예방 접종의 비용감소에 지대한 공헌을 한다. 따라서, 본 발명은 전염병 방지 및 인간의 건강 및 위생의 증진에 기여한다.

본 발명은 하기의 참고 실시예 및 본 발명의 범위를 제한하여 해석되게 하지 않는 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 상술하기로 한다.

[참고 실시예 1]

인간 이배성 섬유 아세포 MRC-5의 배양:

인간 이배성 섬유 아세포 MRC-5는 세포의 성장 및 유지를 위해 MEM(미국 GIBCO 사가 제조판매)을 이용해 37℃에서 배양한다. 상기 배지를 사용하기 직전에 pH를 맞추기 위해 수성 7%(w/v) NaHCO₃용액을 배지에 첨가한다. 성장 배지로서 사용하기 위해서 pH를 7.0으로 맞추고, 유지 배지로 사용하기 위해서는 pH를 7.5로 맞춘다. 이어서 배지를 상업적으로 이용 가능한 송아지 태아 혈청을 추가하여 혈청의 최종 농도가 성장 배지로서 사용하기 위해서는 10%(w/v)로, 유지 배지로서 사용하기 위해서는 3%(w/v)로 되게한다.

[참고 실시예 2]

수두 비루스의 배양:

수두 비루스 오카 균주의 종 비루스(세계보건기구 기술보고 시리즈, 275권, 102-124페이지, 1985;ATCC VR-795)를 참고 실시예 1에서 수득한 MRC-5 세포 배양내로 MDI(rkadua 다증도;miltiplicity of infection) 0.03 상태로 접종하여 37℃에서 2일간 배양한다. 참고 실시예 1에서 전술한 유지 배지를 이 배양의 배지로 사용한다. 상기 비루스의 배양동안, 비루스의 증식에 따라 감염세포의 범위가 점차적으로 확장된다. 현미경으로 관측했을 때, 비루스 감염세포는 환형을 나타냄이 관측되었다. 따라서, 감염 세포는 소위 CPE(세균 병리학적 효과; Cytopathogenic effect)로서 감지될 수 있다. 따라서, CPE를 나타내는 감염세포의 확장을 현미경으로 관측함에 의해서 비루스 성장의 정도를 결정할 수 있다. CPE가 세포 배양 단층(monosheer)의 전 지역을 통해 관측될 때, 비루스의 배양은 종지된다. 배양면적 210㎠를 가지는 룩스병(Roux bottle)이 배양 용기로 사용된다.

[참고 실시예 3]

홍역, 이하선염 및 독일홍역 비루스의 배양:

참고 실시예 1 및 2에 전술한 것과 실제적으로 동일한 방법으로, 병아리 태아세포 및 메추라기 태아세포를 각각 MEM을 이용해 배양하고, 홍역 비루스 및 이하선염 비루스를 각각 상기의 병아리 태아 세포내에서 배양하고, 독일홍역 비루스는 상기의 메추라기 태아세포내에서 배양한다.

[참고 실시예 4]

M/100 PBS(-) (Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 제거한 인산 완충 염수(phosphate-buffered saline)의 제조:

Nacl 8.0g KCl 0.2g Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g, KH₂PO₄0.2g을 증류수에 녹여 그 결과로서 생기는 PBS(-)의 총 부피가 1000㎖이 되게한다. 수득한 PBS(-)의 pH는 약 7.4이다.

[참고 실시예 5]

비루스의 현탁 용액 (A)의 제조:

수크로스 50g, 소듐 L-글루타메이트 1.0g 및 RDTA의 트리소듐염 0.1g을 참고 실시예 4에서 수득한 PBS(-) 800㎖에 순서대로 첨가하여 용액을 수득한다. 별도로, 젤라틴 2.0g에 증류수 50㎖을 첨가하고, 가수분해된 젤라틴(미국 BBL사가 제조·판매) 25g에 증류수 50㎖을 첨가하여 이들 결과 용액 각각을 압력 가열기 내에서 가열하여 용액을 수득한다. 상기에서 수득한 용액을 모두 함께 혼합하고, 증류수를 첨가하여 최종 용적 1000㎖을 만든다. 연속하여, 상기 결과용액을 여과 멸균시키고, 이 혼합물의 알리괏을 멸균 테스트하여 혼합물의 멸균 상태를 확인한다. 비루스의 현탁 용액 (A)의 1ℓ의 조성은 하기 표 1에 나타낸다.

[참고 실시예 6]

비루스 현탁 용액 (B)의 제조:

참고 실시예 5에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 비루스의 현탁액(B)를 하기 표 2에 표시된 성분을 사용하여 제조한다. 다시 말하면, 젤라틴 및 가수분해된 젤라틴을 증류수에 용해시켜 용액을 수득한다. 다른 성분들은 PBS(-) 800㎖에 녹여 용액을 수득한다. 이어서, 이들 용액을 함께 혼합하고, 증류수를 첨가하여 결과 혼합물의 최종 용적이 1000㎖이 되게 한다. 연속하여, 혼합물을 여과 멸균시킨다. 멸균된 여과액을 비루스 현탁 용액 (B)로 사용한다.

[참고 실시예 7]

비루스 현탁 용액( C)의 제조:

참고 실시예 6에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로, 비루스 현탁 용액 (B)의 각 성분의 두배의 농도를 가지는 용액을 제조한다. 제조된 용액을 비루스 현탁 용액 (C)로 사용한다.

[참고 실시예 8]

용액 1 내지 8의 제조:

하기의표 3에서 표시된 대로 가수분해된 젤라틴 및 EDTA의 트리소듐염(둘다 참고 실시예 5에서 *로 표시된 것)의 농도(g/ℓ)를 다양하게 하는 것을 제외하고는 참고 실시예 5에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 과정을 반복한다.

[참고 실시예 9]

Ca이온 및 Mg이온을 제거한 가수분해된 정제 젤라틴의 제조:

가수분해된 젤라틴(미국 BBL사가 제조·판매) 120g에 증류수 180㎖을 첨가하고, 그 결과 혼합물을 가압 가열기 내에서 가열하여 가수밴해된 젤라틴을 용해시킨다. 연속하여, 증류수를 첨가하여 최종용적 300㎖을 만들어 40%(w/v) 수성 가수분해 젤라틴 용액을 수득한다.

제조된 가수분해 젤라틴 용액을 셀룰로오스 에스테르 즉, 스펙트라/포르(분획 분자량:1,000:일본국 후나코시 약품회사에서 제조·판매)로 만들어진 투석관 내로 부어, 실온에서 48시간 동안 외부 용액으로 사용된 증류수에 대해 투석시킨다. 투석 종료후, 수득한 투석액을 킬레이트 색도계 적정으로 Ca이온 및 Mg이 탐지되지 않아, 이들 이온이 실질적으로 제거되었음을 확인한다. 확인후, 투석액을 여과 멸균시킨다. 상기 결과의 멸균 여과액을 생 백신의 안정화제 성분으로서 사용되는 정제된 가수분해 젤라틴으로 사용한다.

상기의 킬레이트 색도계 적정은 킬레이트제로서 EDTA의 디소듐염을 사용하고, 금속 지시약으로서 에리오크롬 블랙 T(Eriochrome Black T)를 사용한 킬레이트 색도 적정으로 수행한다. 색도계 적정에서, 분서계의 색이 자주빛 적색에서 청색으로 변할 때 적정을 종결한다.

[참고 실시예 10]

수두 비루스의 용균반(Plaque) 분석.

10배씩 연속 희석한 테스트될 비루스 함유 용액을 페트리 접시에 배양한 단층의 MRC-5 세포에 각각 접종하고 5%(v/v) 이산화 탄소를 함유하는 배양기 내에서 37℃로 배양한다. 유지 배지는 기초 배지로서 배지 199(미국 DIFCO사 제조판매)를 사용하는 것을 제외하고는 참고 실시예 1에서와 실제적으로 동일한 방법으로 제조한다. 아가로오스를 최종 농도 0.8%(w/v)가 되도록 유지 배지에 첨가하여 고체 배지를 제조한다. 상기 제조된 고체 배지를 감염세포의 단층면 위에 올려 놓는다. 상기 고체 배지에 중성 레드(red)를 최종 농도 0.01%(w/v)가 되도록 첨가하여 제조한 배지를 감염세포 위에 올려둔 고체 배지위에 더올려 둠으로써 감염 배양 세포를 염색한다. 이어서, 나타난 용균반의 수를 센다. 용균반의 수 즉, PFU(용균반 생성단위)는 생 백신의 비루스 함량을 나타내고, 생 백신의 역가는 PFU로서 나타낸다. 예를 들어, 10배로 희석된 백신 1㎖의 접종으로, 배양후 10개의 용균반이 생성되면, 10×10으로 계산하여 용균반의 총수는 10PFU/㎖로 계산되며, 총수는 일반적으로, 10의 일반적 대수 계산에 따라 5를 가리킨다.

[참고 실시예 11]

홍역, 독일 홍역 및 이하선염의 각각의 생 백신의 역가 결정:

홍역 백신 및 독일 홍역 백신의 역가에 대하여, 홍역 비루스의 용균반 분석은 베로 세포(Vero cells)를 사용하고, 독일 홍역 비루스의 용균반 분석은 RK-13 세포를 사용하여, 각각 참고 실시예 10에서 전술한 것과 동일한 방법으로 행하여 역가를 결정한다.

이하선염 백신에 대하여, 이 역가는 베로 세포를 사용하여 이하선염 비루스의 TCID으로 분석된다. TCID은 하기와 같이 결정한다.:

10배씩 연속적으로 희석한 테스트할 백신 용액을 각각 5㎖의용적을 가진 시험관 내에서 배양한 베로 세포층 내로 각각 접종한다. TCID은 현미경으로 관찰해서 CPE가 감염된 세포의 50%로 관측되는 배수에서 그 백신의 희석배수를 기초로 하여 결정한다(1976년 레인지 메디칼 출판물, 리뷰 오브 메디칼 마이크로 바이올로지 13판, 344-345p 참조). 예를 들어, 10배 희석한 백신 용액을 각각 세포층을 포함하는 10개의 시험관 내에 접종하고 배양한다. 이 경우에, 배양후 CPE가 10개의 시험관 중 5개(50%)에서 관측되었다면, TCID은 로그 10에 의해 4.0을 가리킨다.

[실시예 1]

생 백신의 저장 안정성 테스트(안정화제의 효과 테스트):

각각 배양 면적 210㎠을 가진 20개의 룩스병 내에 있는 MRC-5 세포 배양액에 수두 비루스 오카 균주의 종 비루스를 접종하고, 참고 실시예 2에서 전술한 것과 실제적으로 동일한 방법으로 배양한다. 배양 종결후, 배양 배지를 버린다. 각 룩스병 내의 감염된 세포를 200㎖의 PBS(-)로 두 번 세척한다. 연속하여 0.05%(w/v) EDTA의 트리소듐염 20㎖을 각 룩스병 내의 감염된 세포 위에 넣고, 피펫팅으로 룩스병의 내부벽 표면으로 부터 세포를 분리하여 용액내에 현탁시켜 감염된 세포 현탁액을 수득한다. 병내의 상기에서 수득한 세포 현탁액을 모두 모은다. 그 결과로 감염된 세포 현탁액을 총 400㎖ 수득한다. 수득한 현탁액을 8등분으로 나누어 8개의 원심 분리용 튜브(T1 내지 T8)에 넣어 50㎖씩의 감염된 헤포 현탁액을 가진 8개의 원심 분리용 튜브를 준비한다. 각 원심 분리용 튜브내의 감염된 세포 현탁액을 4℃에서 10분간 2,000rpm으로 원심 분리하여 상층액과 세포로 현 탁액을 분리한다. 상층액은 버리고 원심 분리용 튜브의 바닥면 위에 감염된 세포의 덩어리(peller)를 수득한다. 참고 실시예 8에서 제조한 용액 1 내지 8을 튜브번호와 용액번호가 일치하도록 하여 원심 분리용 튜브에 첨가한다. 즉, 용액 1의 20㎖의 알리괏을 원심 분리용 튜브 T1에 넣고, 용액 2의 20㎖의 알리괏을 원심 분리용 튜브 T2에 넣는 등의 방식으로 각 용액을 넣고 감염된 세포를 재현탁시킨다. 이어서, 결과 현탁액을 1회 순환의 동결·해동시킨다. 연속하여, 현탁액을 빙수 세조내에서 초음파 처리(20MHz, 150mA, 0.3ch/㎖)하고 4℃에서 10분간 1,000rpm으로 원심 분리하여 세포와 상층액을 분리시킨다. 세포로 부터 분리된 비루스를 포함하는 상층액을 모아 다른 안정화제 조성을 가지는 생 백신의 8가지 유형을 제조한다.

각 유형의 생 백신을 3㎖의 용적을 가진 유리병에 각 병단 0.5㎖씩 나누어 넣고 동결 건조시킨다. 유리병에 질소가스를 가득 채우고 유리병을 고무 마개로 밀폐 밀봉한다. 이 백신 병을 37℃에서 보관한다. 저장기간중 매주 5병씩 임의로 선택하여 안정화제의 효율성을 시험한다. 시험수행 직전, 주입용 증류수 0.7㎖을 동결 건조된 백신에 그 재조성을 위해 첨가하여, 완전히 용해된 백신을 함유하는 용액을 수득한다. 효율성 시험은 수득한 용액에 대하여 참고 실시예 10에서 전술한 용균반 분석으로 수행한다. 각 유형의 백신의 역가는 PFU로 표시한다. 상기 결과는 하기의 표 4에 정리한다. 용액 7에서 나타난 안정화 효과가 가장 뛰어나다.

[실시예 2]

활성 성분으로서 약독화된 생 수두 비루스를 함유하는 안정화된 생 백신의 제조:

배양 면적 210㎠을 가지는 20개의 룩스병 내의 MRC-5 세포 배약액 내에 수득 비루스 오카 균주의 종자 비루스를 접종하고, 참고 실시예 2에서와 실질적으로 동일한 방법으로 배양한다. 배양 종료후, 배양 배지를 버린다. 각각의 룩스병 내의 감염된 세포를 200㎖의 PBS(-)로 두 번 세척한다. 연속하여, 0.05%(w/v) EDTA의 트리소듐염 20㎖을 각 룩스병 내의 감염된 세포위에 넣고, 피펫팅으로 룩스병의 내부 벽 표면으로 부터 감염된 세포를 분리하여 용액내에서 현탁시켜 감염세포 현탁액을 수득한다. 병내의 감염 세포 현탁액을 모두 모은다. 이어서, 모은 현탁액을 4℃에서 10분간 2,000rpm으로 원심 분리하여 상충액과 세포로 현탁액을 분리한다. 상충액을 버리고 감염 세포의 펠렛을 수득한다. 수득한 세포를 참고 실시예 5에서 제조한 비루스 현탁액(A) 100㎖에서 재현탁시킨다. 이어서 상기의 수득된 현탁액을 1 순환의 동결-해동시키고 빙수 세조내에서 초음파 처리(20KHz, 150mA, 0.3초/㎖)하고, 4℃에서 10분간 1000rpm으로 원심 분리하여 상충액과 세포로 현탁액을 분리시킨다. 세포로 부터 분리된 비루스를 함유하는 상충액을 모운다.

수집한 상충액을 생 백신의 대량액으로서 사용한다. 수득된 생 백신의 대량액증 30㎖은 시험을 위해 사용하고, 나머지 생 백신의 대량액 70㎖은 참고 실시예 5에서 제조한 비루스 현탁용액(A)와 혼합하여 생 백신의 최종 대량액 140㎖을 제조한다. 상기에서 수득한 최종 대량액 중 30㎖은 시험을 위한 사료로 사용하고, 나머지는 3㎖의 용적을 가지는 유리병 내로 각 병당 0.5㎖씩 나누어 넣고 동결 건조시킨다. 이어서, 유리병에 질소가스를 가득 채우고 고무 마개로 유리병을 밀폐 밀봉시킨다. 이 백신 병을 4℃에서 저장한다. 유리병에 저장된 동결 건조된 백신의 사용할 때, 백신 사용 직전에 주입용 증류수 0.7㎖을 백신에 첨가하여 백신을 완전히 용해시켜 사용한다. 따라서, 백신은 용액 형태로 사용에 제공된다.

상기에서 수득한 생 백신의 대량액의 시료, 상기에서 수득한 생 백신의 최종 대량액의 시료 및 20개의 백신 병들은 백신으로서의 적격성의 확인을 위해 안정성, 효율성 및 균일성을 시험한다. 시험은 일본국 보건 사회부 고시 195에서 제공한 생물학적 최소요건(1989) 중 동결 건조된 약독화 생 수두 백신에 따라 수행한다. 시험결과, 유리병 내의 상기에서 전술한 백신의 비루스 함량은 2×10PFU/0.5㎖이고, 백신은 모두 시험에 통과했음이 관측되었다. 결과적으로, 이 백신은 생 백신으로서 적격성을 가진다고 할 수 있다. 더 나아가서, 이 백신은 실시예 1에서와 실제적으로 동일한 방법으로 저장성을 시험하였다. 시험 결과는 이 백신이 용액 7에서 수득한 것과 같거나 보다 높은 안정성을 가졌음을 보였다. 따라서, 이 백신은 뛰어난 안정화된 생 백신임이 확인되었다.

[실시예 3]

사가 생 백신의 저장 테스트:

참고 실시예 6에서 수득한 비루스 현탁액(B)를 사용하여 생 수두 백신(V)의 대량액을 실시예 2에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 제조한다.

별도로, 홍역, 독일 홍역 및 이하선염 비루스 각각을 참고 실시예3에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 배양한다.

홍역 비루스에 대해서, 배양 종결후 배양배지를 버린다. 감염된 세포를 PBS(-)로 세척하여 Ca이온 및 Mg이온을 제거한다. 연속하여, Ca이온 및 Mg이온을 제거한 배지 199(미국 DIFCO사에서 제조·판매)또는 MEM의부피를 감염된 세포위에 넣고 세포를 배양 용기의 내부벽 표면으로 부터 피펫팅으로 분리하여, 영액내에 현탁시켜 감염된 세포 현탁액을 수득한다. 이어서, 수득한 현탁액을 1 순환의 동결-해동시키고, 저속 원심 분리(4℃에서 10분간 2000rpm)하여 세포와 상충액으로 현탁액을 분리시킨다. 비루스를 포함하는 상충액을 홍여 비루스 현탁액으로서 수집한다.

각각의 독일 홍역 및 이하선염 비루스에 대해서, 배양 종결후, 비루스를 함유하는 배양 배지를 저속 원심 분리(4℃에서 10분간 2000rpm)하여 상충액을 수득한다. 상충액을 셀룰로오스 막(분획 분자량:300킬로달톤, 미국 밀리포르회사에서 제조, 판매)을 사용해부피로 농축한다. 상기 수득한 농축 배지를 초원심 분리(4℃, 20,000rpm, 이하선염 비루스는 90분, 독일 홍역 비루스는 180분)하여 상충액으로 부터 비루스 펠렛을 분리한다. 상충액을 버리고 비루스를 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 제거한 배지 199 또는 MEM에 현탁시켜 각각 독일 홍역 및 이하선염 비루스에 대한 비루스 현탁액을 수득한다.

상기에서 수득한 각각의 비루스 현탁액을 참고 실시예 7에서 수득한 비루스 현탁 용액 (C)와 동일한 부피로 혼합하여, 각각 하기와 같은 홍역, 독일 홍역 및 이하선염에 대한 세가지 유형의 생 백신 대량액을 제조한다. (1) 배지 199를 사용하여 제조한 각각의 비루스 현탁액에 비루스 현탁 용액 (C) 동일 부피를 첨가하여 홍역(M1), 독일홍역(R1) 및 이산선염(MU1)의 생백신 대량액을 제조한다. (2) EDTA의 트리소듐염을 배지 199를 사용하여 제조한 각각의 비루스 현탁액에 첨가하여 최종 농도가 0.15%(w/v)가 되게하고 여기에 더하여 비루스 현탁 용액 (C)의 동일 부피를 첨가하여 홍역(M2), 독일 홍역(R2) 및 이하선염(MU2)의 생 백신의 대량액을 제조한다. (3) 비루스 현탁 용액 (C)의 동일 부피를 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 제거한 MEM을 사용하여 제조한 각 비루스 현탁액에 첨가하여 홍역(M3), 독일 홍역(R3) 및 이하선염(MU3)의 생 백신의 대량액을 제조한다.

연속하여, 하기의 표 5에서 표시된 제제조성에 따라 생 백신의 대량액을 혼합하여 세 개의 백신 최종 대량액을 제조한다.

연속하여, 각각의 백신 최종 대량액을 실시예 1에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로, 용적 3㎖을 가지는 유리병 내에 각 병당 0.5㎖씩 나누어 넣는다. 각 병내의 백신을 동결·건조시킨다. 동결 건조후, 소량으로 나누어진 사가 백신으로서의 안정성을 확인하기 위해 백신을 37℃에서 안정화제의 효율성 시험을 한다. 효율성 시험은 참고 실시예 10 및 11에서 전술한 용균반 분석(수두, 홍역 및 독일 홍역 비루스에 대해) 및 TCID결정(이하선염 비루스에 대해)으로 수행한다. 결과는 하기의 표 6에 나타낸다. 최종 대량액 3이 안정화된 사가 생 백신으로서 가장 뛰어나다.

[실시예 4]

정제된 가수분해 젤라틴의 백신 안정화 효과 시험:

EDTA의 트리소듐염을 생략하는 것을 제외하고는 참고 실시예 5에서 전술한 비루스 현탁 용액 (A)와 실질적으로 동일한 조성을 가진 비루스 현탁 용액 (A1)을 제조한다.

또한, 참고 실시예 9에서 수득한 정제된 가수분해 젤라틴을 가수분해된 젤라틴 대신에 사용하고 EDTA의 트리소듐염을 생략하는 것을 제외하고는 참고 실시예 5에서 전술한 비루스 현탁용액 (A)와 실질적으로 동일한 조성을 가진 비루스 현탁 용액 (A2)을 제조한다. 비루스 현탁 용액(A), (A1) 및 (A2)를 각각 사용하여 동결 건조된 생 수두 백신을 실시예 2에서 전술한 것과 실질적으로 동일한 방법으로 제조한다. 수득한 각 생 백신은 37℃에서 저장 안정성을 시험한다. 시험 결과는 하기의 표 7에 나타낸다. 비루스 현탁 용액 (A2)는 용액 (A)와 동일한 비루스 안정화 효과를 가지는 것으로 관측되었다. 즉, Ca이온 및 Mg이온을 제거한 정제된 가수분해 젤라틴이 안정화제 성분의 하나로서 사용되면 EDTA의 트리소듐염이 필요치 않다는 것이 확인되었다.

[실시예 5]

활성 성분으로서 약독화된 재조합 수두 비루스를 함유하는 안정화된 생 백신의 제조:

간염 B 비루스 유전자를 약독화된 수두 비루스 오카 균주의 게노믹 DNA에 접합시켜 제조한 약독화된 재조합 수두 비루스 rVH17-5 오카 균주[ECACC(유럽 동물 세포 배양 수탁기관) 수탁 번호 V92041523]를 종 비루스로 사용하여 재조합 수두 비루스 백신을 제조하는 것을 제외하고는 실시예 2에서와 실질적으로 동일한 절차를 반복한다. 상기에서 수득한 백신을 실시예 2에서와 같은 안정성, 효율성, 균일성 및 저장성에 대한 시험을 행한다. 그 결과로, 본 백신은 생 백신으로서의 적격성을 가지며 탁월한 안정성을 가지는 것이 관찰되었다. 따라서, 본 생 백신은 실시예 2에서 수득한 백신과 비교될 수 있는 탁월한 안정화된 생 백신임이 확인되었다.

Claims

약독화된 생 수두 비루스(attenuated live varicella virus) 및 약독화된 재조합 수두 비루스로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 수두 비루스를 함유하는 비루스 성분과, 젤라틴 및 젤라틴 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 젤라틴 생성물을 함유하는 안정화제를 포함하며, 킬레이트제를 사용한 색도계 적정법에 의해 측정시 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 감지되지 않는 정도로 상기 이온들이 제거됨을 특징으로 하는 안정화된 생 백신.
제1항에 있어서, 상기 비루스 성분으로서 수두 비루스 이외에, 홍역, 독일홍역 및 이하선염의 약독화된 생 비루스 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 약독화된 생 비루스를 더 포함함을 특징으로 하는 안정화된 생백신.
제1항, 또는 제2항에 있어서, 액체 생성물 또는 동결 건조된 생성물의 형태임을 특징으로 하는 안정화된 생 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 젤라틴 생성물이 하나 이상의 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 함유하며, 상기 안정화제는 킬레이트제를 사용하는 색도계 적정법에 의해 측정시 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 감지되지 않는 정도로 상기 이온을 제거할 수 있는 양으로 킬레이트제를 더 함유함을 특징으로 하는 안정화된 생 백신.
제4항에 있어서, 상기 젤라틴 및 상기 젤라틴 유도체의 양은 각각 안정화된 생 백신의 농도에 대하여 0.02 내지 1.0%(중량/부피) 및 0.5 내지 10%(중량/부피)이고 상기 킬레이트제의 양은 안정화된 생 백신내 농도에 대하여 0.001 내지 0.1%(중량/부피)임을 특징으로 하는 안정화된 생 백신.
제4항에 있어서, 상기 젤라틴 유도체는 가수분해된 젤라틴임을 특징으로 하는 안정화된 생 백신.
제6항에 있어서, 상기 안정화제는 안정화된 생백신내 농도에 대하여 소듐 글루타메이트 0.01 내지 5%(중량/부피), 수크로스 0.5 내지 10%(중량/부피), 젤라틴 0.02 내지 1.0%(중량/부피), 가수분해된 젤라틴 0.5 내지 10%(중량/부피) 및 킬레이트제 0.001 내지 0.1%(중량/부피)로 이루어짐을 특징으로 하는 안정화된 생 백신.
제6항에 있어서, 상기 안정화제는 안정화된 생백신내 농도에 대하여 락토오스 0.5 내지 10%(중량/부피), 소르비톨 0.2 내지 60%(중량/부피), 시스테인 0.02 내지 1.0%(중량/부피), 소듐 글루타메이트 0.01 내지 5.0%(중량/부피), 젤라틴 0.02 내지 1.0%(중량/부피), 가수분해된 젤라틴 0.5 내지 10%(중량/부피) 및 킬레이트제 0.001 내지 0.1%(중량/부피)로 이루어짐을 특징으로 하는 안정화된 생백신.
제4항에 있어서, 상기 킬레이트제가 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염임을 특징으로 하는 안정화된 생백신.
제5 내지 8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 킬레이트제가 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 그의 염임을 특징으로 하는 안정화된 생백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 젤라틴 및 상기 젤라틴 유도체는 킬레이트제를 사용하는 색도 적정법에 의해 측정시 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온이 감지되지 않는 정도로 상기 이온들이 제거되어 있고, 각각 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온을 함유하는 젤라틴 및 젤라틴 유도체를 투석 처리, 겔 여과 처리, 양이온 교환 수지 처리 및 킬레이트 수지 처리로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 처리에 적용시켜 이에 의해 Ca²⁺이온 및 Mg²⁺이온 중 하나 이상을 모두 제거함으로써 얻어지는 정제 젤라틴 및 정제 젤라틴 유도체임을 특징으로 하는 안정화된 생백신.
제11항에 있어서, 상기 젤라틴 유도체가 가수분해된 젤라틴임을 특징으로 하는 안정화된 생백신.