CN106668013A - 吡啶芳香酯类化合物在制备抗肠道病毒71型药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗病毒药物领域。提供了系列新型吡啶芳香酯类化合物在制备抗肠道病毒71型（EV712）药物中的应用。所述吡啶芳香酯类化合物为式WY89,WY94,WY96,WY97所示的化合物。通过系列新型吡啶芳香酯类化合物对于EV71抑制活性研究实验，WY89、WY94、WY96和WY97抑制EV71在宿主细胞RD上产生的细胞病变效应（CPE），增强细胞存活率，降低子代病毒产量，并可抑制EV71感染导致的宿主细胞凋亡，主要作用于EV71在宿主细胞内的复制增殖阶段。表明这些新型吡啶芳香酯类化合物有制备抗EV71病毒药物的潜力，这些化合物合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产，具有临床应用前景。

Description

吡啶芳香酯类化合物在制备抗肠道病毒71型药物中的应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及吡啶芳香酯类化合物在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑炎，脊髓灰质炎样麻痹，神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974年首次报道以来，EV71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国政府已于2008年将手足口病列为丙类传染病纳入管理，并制定一系列相关法律法规，严控手足口病的流行传播。目前对于由EV71感染的疾病治疗没有特效药物，相关的疫苗于2015年才上市，其预防效果还有待进一步调查。因此开发特异有效的抗EV71药物势在必行。

酯类化合物是一类重要的精细化工产品，广泛应用于药物、材料、食品、增塑剂、溶剂等化工行业，芳香酯可广泛用于香料、防腐剂、溶剂、药物、染料、涂料和材料合成等方面。本申请人所在项目组自主合成了具有新型结构的芳香酯化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公开了这几种芳香酯化合物的制备方法。未对其生物学活性进行评价。

发明内容

本发明的目的是提供吡啶芳香酯类化合物在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用，所述的吡啶芳香酯类化合物WY89、WY94、WY96、WY97，其结构式如下式：

本发明在细胞水平发现WY89，WY94，WY96和WY97可以强烈抑制EV71病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，降低子代病毒产量，并且可以抑制病毒感染引起的细胞凋亡，主要作用于EV71在宿主细胞内的复制增殖阶段。

进一步地，所述的吡啶芳香酯类化合物优选为式WY94。

本发明的第二个目的是提供一种抗肠道病毒71型的药物，包含有效剂量的作为活性成份的化合物WY89、WY94、WY96、WY97中的任意一种，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

进一步地，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

由此表明化合物WY89、WY94、WY96、WY97有制备抗EV71感染的特异治疗药物的潜力，具有临床应用前景。

本发明的系列新型吡啶芳香酯类化合物的制备，参照文献Tetrahedron Letters2015，56，6136–6141的方法，具体以过渡金属钯为催化剂，在吡啶的邻位诱导作用下，在芳环的邻位用高价碘苯作用，进行芳酰氧基化，得到最终酯化产物。

本发明具有以下优点：

1、这些化合物合成原料价格低廉，易于购得；合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产推广。

2、从结构相似的化合物中寻找抗EV71药物，易于通过构效关系探讨确认其作用靶点，为进一步药物开发提供有价值的导向作用。

附图说明

图1是吡啶芳香酯类化合物对于EV71作用的RD细胞存活率的影响。

图2是WY89、WY94、WY96和WY97对于EV71引起的RD细胞CPE的抑制效应。

图3是WY94对于EV71子代病毒产量的抑制作用。

图4是WY94对于EV71引起的RD细胞凋亡的抑制作用。

图5是WY94不同加药方式处理下对于EV71的抑制活性。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

【实施例1】新型吡啶芳香酯类化合物的合成

本发明合成了以下6种新型吡啶芳香酯类化合物，参照文献Tetrahedron Letters2015，56，6136–6141的方法，具体以过渡金属钯为催化剂，在吡啶的邻位诱导作用下，在芳环的邻位用高价碘苯作用，进行芳酰氧基化，得到最终酯化产物。

【实施例2】对6种吡啶芳香酯类化合物抗EV71活性进行评估

1、试验方法：

1.1化合物对于宿主RD细胞的毒性

将RD细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Mediancyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD₄₉₂值/细胞对照组平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2化合物对于EV71的抑制活性

将RD细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID₅₀的EV71病毒液感染细胞1h，加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

CPE观察完毕后，利用MTT方法检测药物对EV71的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式计算药物对EV71的抑制率。用SPSS11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

1.3药物的治疗指数(SI)

SI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

2、试验结果

表1具有新型结构的吡啶芳香酯类化合物细胞毒性及抗EV71活性

a”-”：低于50％的抑制效果或者无效

化合物细胞毒性及抗EV71活性测试结果如表1所示。浓度依赖的化合物对于EV71作用的RD细胞存活率的影响如图1所示。本发明检测到WY89、WY94、WY96和WY97对于EV71均有较好的抑制活性。WY94和和WY97在40μg/mL时均可以完全抑制EV71引起的RD细胞CPE效应，WY89和WY96在40μg/mL时对于EV71引起的RD细胞CPE效应的抑制效应分别为90％和83％。其中WY94具有最强的抑制活性(EC50为11.29)，高的治疗指数(SI为10.15)，优于对照药物利巴韦林。其他测试化合物检测到无或不足50％的抑制EV71细胞病变效应。化合物WY89、WY94、WY96和WY97抑制EV71引起的RD细胞CPE效应如图2所示。未做任何处理的RD细胞生长良好，EV71感染的细胞聚缩死亡，从细胞板壁脱离，40μg/mL WY89、WY94、WY96和WY97处理对于其病变效应有强的抑制作用，可以保护细胞免受EV71感染的侵害。

【实施例2】WY94对于EV71子代病毒产量的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID₅₀EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含40μg/mL WY94的细胞维持液。48h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID50方法测定EV71病毒滴度。

2、试验结果

如图3所示，40μg/mL WY94处理的RD细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度显著下降，说明了化合物对于EV71子代病毒产量强烈的抑制作用。

【实施例3】WY94对于EV71引起的RD细胞凋亡的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY94的细胞维持液。大约48h后，收集细胞，运用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。

2、试验结果

实验结果如图4所示，WY94可以有效抑制EV71导致的细胞凋亡。在病毒对照组细胞凋亡率为98.03％，正常未处理细胞凋亡率7.26％的情况下，40μg/mLWY94处理的细胞凋亡率只有20.28％。可见WY94可以有效保护EV71导致的细胞凋亡。

【实施例4】化合物WY94抗EV71活性药理学研究

1、试验方法

1.1WY94对于EV71的直接杀伤作用分析

10⁴TCID₅₀的EV71悬液与化合物100μg/mL WY94在4℃冰箱孵育24h，病毒悬液稀释100倍数，使其小于化合物对于病毒抑制的有效浓度，滴定于提前准备好的已贴壁长满单层的RD细胞中，通过Reed和Muench方法计算病毒悬液的TCID₅₀值。

1.2WY94对于EV71作用方式的分析

通过三种不同的加药方式(EV71感染前，感染之间，感染之后加入测试化合物)分别测定化合物对于EV71的影响。

(1)预防作用：在EV71感染之前加入WY94作用。

RD细胞在96孔板中长满单层后，吸弃培养液，加入含不同浓度WY94孵育2h，弃掉药物培养液之后，100TCID₅₀的EV71悬液吸附1h，去掉病毒悬液，加细胞培养维持液继续培养。48h时观察细胞CPE，测定细胞存活率。

(2)抑制吸附作用:在EV71感染期间加入类似物作用。

将EV71悬液和不同浓度WY94混匀，直接滴定于已长满单层96孔板的RD细胞中，37℃，5％CO₂培养箱吸附1h后，弃去感染液，加细胞维持液继续培养。48h时测定细胞存活率。

(3)治疗作用：在EV71感染之后加入类似物作用。

RD细胞在96孔板中长满单层后，吸弃培养液，100TCID₅₀的EV71悬液吸附1h，弃去病毒液，加入含不同浓度WY94继续培养，48h时检测细胞CPE和存活率。

2、试验结果

2.1化合物WY94体外直接杀伤EV71作用

化合物WY94处理过的EV71悬液感染RD细胞，48h检测其病毒滴度。结果发现，药物处理组相比病毒对照组，病毒滴度无明显变化(数据未显示)，说明这些类似物均不具有体外直接杀伤EV71作用。

2.2化合物WY94抑制EV71的作用方式

结果显示，WY94预处理细胞对于随后的EV71感染无明显的CPE抑制效应(图5)，WY94与EV71同时孵育感染细胞这种加药方式得出相似的结果，说明WY94不能通过预先作用于细胞来抑制EV71，即对于病毒感染无预防作用，且WY94对于EV71的吸附内化无明显影响。EV71感染之后加入化合物WY94，结果显示了对于EV71强的抑制活性，几乎可以完全抑制EV71导致的细胞病变效应(图5)，由此说明WY94主要作用EV71感染后在细胞内的复制增殖过程，此种具有新型结构的吡啶芳香酯类化合物可以用于制备抗EV71感染后在细胞内的复制增殖过程的药物。

综上所述，化合物WY89、WY94、WY96和WY97具有较强的抑制EV71在RD细胞中的复制增殖，其中WY94具有最强的抑制活性。本系列化合物结构新颖，抗EV71活性优良，可以为抗病毒药物设计提供一定的导向作用。如果进一步研究开发，有希望制备一种临床上有效治疗EV71感染的药物。

Claims (4)

1.吡啶芳香酯类化合物在制备抗肠道病毒71型的药物中的应用，其特征在于，所述吡啶芳香酯类化合物为WY89、WY94、WY96、WY97，其结构式如下式：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述吡啶芳香酯类化合物为WY94。

3.一种抗肠道病毒71型的药物，其特征在于，包含有效剂量的作为活性成份的化合物WY89、WY94、WY96、WY97中的任意一种，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

4.根据权利要求3所述的抗肠道病毒71型的药物，其特征在于，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。