CN103768073A - 具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结构如式I所示的具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用，式I为：还提供了所述具有双腙结构的甾体衍生物的药学上可接受的盐作为抗病毒药物的应用，以及一种由有效量的具有双腙结构的甾体衍生物和可接受的辅料组成的抗病毒药物药物制剂。

Description

具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物技术领域，具体地指一种具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用。

背景技术

人类健康问题是生命科学研究的重要领域，而病毒感染引起多种疾病，已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题。因此创新型抗病毒药物的基础应用研究是人类战胜自然并保存自身的必然需求。据不完全统计，60～65%流行性传染病是由病毒感染引起。近年来，随着艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎等危害性大、发病率高、难于治愈的病毒性疾病在全球广泛蔓延，以及流感病毒、冠状病毒等呼吸道病毒基因的变异所出现新的变种病毒或病毒变异株，多次暴发全球局部区域大范围流行，迫切需要新的预防和治疗药物。对病毒性疾病的治疗，目前仍缺乏专属性强的药物，而抗病毒药物和免疫调节药物能直接干预病毒的复制，是治疗病毒性疾病的研究重点，但在众多使人类致病的病毒中，此类药物为数甚少。因此，面向国家重大传染病防治的战略需求，开展肝炎、流感和艾滋病等重大病毒性传染病防治的基础理论与应用研究，不断开发高效低毒选择性的新型小分子抗病毒活性药物，成为当前一项具有重要意义的研究工作，它也是制药工业界的热门研究领域之一。申请人在前期科研过程中于文献《Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry》2013,13,1291，公开了系列具有双腙结构的型甾体衍生物，并且发现此类化合物具有一定的抗肿瘤活性。为了进一步开发此类化合物的生物学功能，在后续的科研过程中申请人通过大量生物学试验发现此类化合物还呈现出更加显著的广谱抗病毒活性，具有明显的应用前景，为进一步开发创新型抗病毒药物提供了新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用。

为实现上述目的，本发明公开了一种结构如式I所示的具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用，式I为：

式I中：

R¹和R²各自独立为氢、甲基、乙基、三氟甲基、苯基或取代苯基、杂芳环或取代杂芳环中的一种：

或者，R¹和R²共同构其中，R为甲基、乙基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、甲氧基、羟基、氟、氯、溴、碘、硝基、氰基或氢；

或者，R¹和R²共同构成-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-或-CH₂-YR′-CH₂-，其中，n为1、2、3或4，Y为杂原子，Y优选为氮、氧、硫、磷或硼中的一种，R′为取代基，选自氢、C_1-4烷基、C_2-5烷氧基、C_1-4烷基-C_3-6烷氧基、C_3-6烷氧基-羰基、苄基及取代苄基、苄氧羰基、C_3-8环烷基-羰基、苯甲酰基、杂环基-羰基、C_1-6卤代烷基、C_1-6卤代烷氧基、卤代杂环基-羰基中的一种；

R³为氢、乙酰基、丙酰基、甲磺酰基、三氟乙酰基、三氟甲磺酰基或苯甲酰基中的一种。

本发明还提供了具有上述结构通式I的双腙结构的甾体衍生物的药学上可接受的盐作为抗病毒药物的应用。所述盐优选为所述双腙结构的甾体衍生物的常规无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐及有机酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、苯甲酸盐中的一种。

本发明还公开了一种抗病毒药物药物制剂，由有效量的结构如式I所示的具有双腙结构的甾体衍生物和可接受的辅料组成。所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

本发明的具有双腙结构的甾体衍生物的制备，参照文献《Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry》2013,13,1291，所公开的方法，以常规化学品去氢表雄酮（DHEA）为起始原料，依次经过与水合肼反应得到中间体2、然后中间体2与含羰基化合物在乙醇中进行进一步缩合反应得到R³=H的甾体双腙类化合物I（R³=H）；进而，化合物I（R³=H）可经过常规酯化反应即与各种取代酰氯（RCOCl）或取代磺酰氯（RSO₂Cl）在吡啶作用下进一步转化为酯类化合物I（如R³=CH₃CO或CH₃CH₂CO或CH₃SO₂等）。具体制备流程如下：

本发明的双腙结构的甾体衍生物及其药学上可接受的盐，对肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）、B组柯萨奇病毒（Coxsackievirusgroup B,CVB）、腺病毒（Adenovirus,ADV）、人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis Bvirus,HBV）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）、A型流感病毒（Influenza virus）、呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、人腺病毒3型（Human adenovirus3,AD3）、水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitisvirus,VS）、轮状病毒（Rotavirus,RV）、巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）等具有显著的抑制活性，使得该类化合物可用于制备广谱抗病毒药物。

实际应用中，本发明所述的具有双腙结构的甾体衍生物及其药学上可接受的盐可通过常规的制剂技术制备成各种实用型药剂，如颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂的药物，通过口服、鼻腔或口腔喷雾或注射方式给药，能有效预防或治疗病毒感染。

附图说明

图1为表1中的部分具有双腙结构的甾体衍生物对EV71病毒浓度依赖的抑制病毒活性柱形图。

图2为表1中的部分具有双腙结构的甾体衍生物对CVB3病毒浓度依赖的抑制病毒活性柱形图。

图3为表1中的部分具有双腙结构的甾体衍生物对ADV7病毒浓度依赖的抑制病毒活性柱形图。

图4为表1中的化合物I-3、I-12及I-13在5μg/ml浓度下对EV71、CVB3、ADV7三种病毒分别在Vero、Hep-2、Hela细胞上引起细胞病变图。

图5为表1中的化合物I-3、I-12和I-13抑制EV71病毒的作用阶段分析图。

图6为表1中的化合物I-3、I-12和I-13抑制CVB3病毒的作用阶段分析图。

图7为表1中的化合物I-3、I-12和I-13抑制ADV7病毒的作用阶段分析图。

图8为表1中的化合物I-3、I-12和I-13对EV71、CVB3、ADV7子代病毒产量的抑制作用图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用作进一步详细说明。

实施例1

本发明的具有双腙结构的甾体衍生物的代表性化合物结构如表1所示，但并不限定于本实施例所列举的结构：

表1通式I的代表性化合物结构列表

实施例2

取实施例1中具有双腙结构的甾体衍生物的化合物进行抗病毒活性试验：

1、供试病毒：肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）、柯萨奇病毒B组3型（Coxsackievirus B3,CVB3）、腺病毒7型（Adenovirustype7,ADV7）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）、单纯疱疹病毒1型（Herpes simplex virus type1，HSV-1）、A型流感病毒（Influenza virus,H1N1毒株）、人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiency Virus,HIV-1）等。

2、试验方法：采用治疗指数（Therapeutic index,TI）作为评价指标，衡量药物对病毒的抑制效力，TI=CC₅₀/IC₅₀。CC₅₀即半数中毒浓度（Median cyctoxic concentration），指引起细胞50%药毒的药物浓度。IC₅₀即半数抑制浓度（Median inhibition concentration），指50%有效抑制病毒的药物浓度。

（1）化合物对Vero、Hela和Hep-2细胞的药物毒性（CC₅₀）测定：

将Vero、Hela、Hep-2细胞分别接种于96孔板，在37℃，5%CO₂培养箱（即培养箱中CO₂体积分数浓度为5%）培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含有不同浓度（160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml）双腙结构的甾体衍生物的细胞维持液继续培养，设定未处理细胞对照孔，48h后显微镜目测并记录不同浓度药物处理下的细胞形态特征，MTT法测定在波长570nm处的吸收值，计算细胞存活率，利用SPSS11.5软件计算药物的半数中毒浓度CC₅₀值。

细胞存活率=（药物组平均OD₅₇₀值/细胞对照组平均OD₅₇₀值）×100%

（2）化合物对EV71，CVB3和ADV7病毒的抑制作用（IC₅₀）测定：

将Vero、Hep-2和Hela细胞分别接种于96孔板，在37℃，5%CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含100TCID50（TCID50：Tissue culture infective dose，即半数组织培养感染剂量）的EV71，CVB3和ADV7病毒的细胞维持液在37℃，5%CO₂培养箱中吸附1.5h，弃去病毒感染液，PBS洗三次，加入含不同浓度（5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml）的双腙结构的甾体衍生物的细胞维持液继续培养，设定病毒对照孔，细胞对照孔。待培养48h，病毒对照孔出现90%左右的细胞病变效应（CPE）时，显微镜下观察药物组细胞病变情况，MTT法测定病毒抑制率，SPSS11.5软件计算药物的半数抑制浓度IC₅₀。药物的治疗指数TI=CC₅₀/IC₅₀，治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

3、试验结果：

部分测试结果如下表2、表3及附图1～4所示。

表2化合物的药毒及抗病毒活性

^a CC₅₀–即半数中毒浓度，指引起细胞50%药毒的药物浓度；^b IC₅₀–即半数抑制浓度，指50%有效抑制病毒的药物浓度；^c TI（Therapeutic Index）–药物的治疗指数，TI=CC₅₀/EC₅₀；^d数据表示为三次独立实验的平均值；e-,低于50%的抑制率；^f DHEA–对照药物；^g Ribavirin–对照药物。

表3化合物的抗病毒活性

^a TI（Therapeutic Index）–药物的治疗指数，TI=CC₅₀/EC₅₀；^b-,低于50%的抑制率；^c DHEA–对照药物。

通过上述表2、表3及图1、图2、图3的结果可以看出，用于对照的母体化合物去氢表雄酮（DHEA）几乎无明显抗病毒活性，而本发明具有双腙结构的甾体衍生物对大部分供试病毒均表现出强的抗病毒活性，分析如下：

如表2所示，化合物I-3和I-13在Vero细胞上对于EV71的治疗指数分别为40.1和>100，并且如图1、图2、图3所示，化合物I-3、I-12、I-13在浓度为5μg/ml时，对EV71病毒的抑制均大于98%，化合物I-9在5μg/ml时的抑制率为89.2%；化合物I-3、I-12、I-13、I-32在Hep-2细胞上对于CVB3病毒的治疗指数分别达到了70.6、22.0、>300、21.4；化合物I-3、I-12、I-13、I-29、I-32、I-36在Hela细胞上对于ADV7的治疗指数分别为161.9、30.6、>250、>125、>160、43.5。表3显示，化合物I-3、I-38在MT4细胞上对HIV的治疗指数为45.2、36.5；化合物I-7、I-29在HepG2.215细胞上对HBV的治疗指数达到20.1、21.0；而化合物I-13在Hep-2细胞上对HSV-1的治疗指数则大于100。并且，从图1、图2、图3还可看出，化合物I-3、I-12、I-13在较低浓度时仍表现出高效的抗病毒活性，具有显著的研究价值及应用前景。图4显示的是化合物I-3、I-12及I-13在5μg/ml浓度下对EV71、CVB3、ADV7三种病毒分别在Vero、Hep-2、Hela细胞上引起的细胞病变图，通过图4可以看出，化合物I-3、I-12及I-13在5μg/ml浓度下能有效抑制病毒的复制，特别是化合物I-3、I-12表现出显著的抗CVB3和ADV7病毒的活性。

为了进一步明确该类化合物的抗病毒活性，并为该类化合物的开发提供较详尽的基础研究数据，本发明在以下后续试验过程中代表性的选择了化合物I-3、I-12及I-13进行了相应的作用机制研究，具体包括加药方式对化合物抗病毒作用的影响、化合物对病毒的直接杀伤作用、化合物对病毒复制的抑制作用等实验。

实施例3

加药方式对具有双腙结构的甾体衍生物抗病毒作用的影响：

（1）化合物的预防作用（Before infection）

分别用RD、Hep-2和Hela细胞铺板96孔板，过夜长满单层后，吸弃培养液，加入含不同浓度（5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml）的化合物I-3、I-12和I-13的2%FBS DMEM（其中2%为体积分数，即100ml的DMEM中加2ml的FBS）维持液，放置37℃，5%CO₂培养箱孵育2h，使药物充分作用细胞，弃掉药物培养液并用PBS三次洗净残留药物，加入100CCID50的EV71，CVB3和ADV7病毒悬液吸附1.5h，PBS洗涤残留病毒悬液，加2%FBSDMEM维持液在37℃，5%CO₂培养箱继续培养。

（2）化合物对病毒吸附的抑制作用（During infection）

将EV71、CVB3和ADV7病毒悬液分别和不同浓度的（5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml）化合物I-3、I-12和I-13混匀，最终病毒稀释倍数为100TCID50，直接滴定于提前准备好的已贴壁长满单层的96孔板RD，Hep-2和Hela细胞中，37℃，5%CO₂培养箱吸附1.5h后，PBS洗涤三次，加细胞维持液继续培养。

（3）化合物对病毒生物合成的影响（Post infection）

具体方法同化合物对EV71、CVB3和ADV7病毒的抑制作用测试方法。

以上各组均设细胞对照组、病毒对照组。分别在37℃，5%CO₂培养箱条件下培养大约48h，待病毒对照孔出现病变约90%时，目测药物组的细胞CPE，用MTT法测定病毒抑制率，SPSS11.5软件分别计算不同加药方式下药物的IC₅₀。

测试结果如图5、图6、图7及表4所示。其中图5、图6、图7显示，三种双腙结构的甾体衍生物I-3、I-12、I-13在以上三种加药方式下（病毒感染前，病毒感染期，病毒感染后）均可以很好地抑制病毒导致的细胞CPE，但是相比较，病毒感染后加入药物这种方式表现出最大的抑制活性。从表4数据可以看出，病毒感染后加药（治疗作用）此种作用方式需最低药物浓度即可发挥最强的抗病毒效果。因此推断药物主要作用于病毒在细胞内的复制增殖。

表4化合物I-3、I-12和I-13在不同加药方式下抑制病毒的活性

实施例4

具有双腙结构的甾体衍生物对病毒的直接杀伤作用：

将高滴度的EV71，CVB3和ADV7病毒悬液（10⁴TCID50）分别和5μg/ml的I-3、I-12和I-13混合，4℃冰箱孵育处理12h，稀释病毒悬液100倍（药物终浓度远低于其抑制病毒的IC₅₀），滴定于提前准备好已经长满96孔板单层的RD，Hep-2和Hela细胞，通过Reed-Muench滴定法测定病毒滴度。

结果表明：药物处理过的病毒悬液与未处理的病毒对照悬液其病毒滴度无明显差别，说明药物对于病毒没有直接的杀伤作用。

实施例5

具有双腙结构的甾体衍生物抑制病毒的复制作用：

在96孔培养板中长满单层的RD、Hep-2和Hela细胞上接种100TCID50EV71，CVB3和ADV7病毒，PBS洗净残留病毒液，分别加入含5μg/ml的I-3、I-12和I-13的2%FBS DMEM维持液，分别在培养4h、8h、24h和36h时，细胞三冻三融裂解，裂解液通过Reed-Muench滴定法测定病毒滴度，比较药物在不同时间点对于病毒生成量的抑制作用。

试验结果如附图8所示（VC：病毒控制对照），图8表明病毒感染细胞后，随着时间的增加，其病毒对照组细胞呈现病毒滴度逐渐增强的趋势，但是药物处理组的病毒滴度几乎维持在最起始水平，因此到后期病毒产量的抑制率逐渐增强，充分说明双腙结构的甾体衍生物能有效抑制病毒在细胞内的复制增殖。

实施例6

本发明具有双腙结构的甾体衍生物颗粒剂制备：

取5g化合物I-2，依次加入20g蔗糖粉、5g羧甲基纤维素钠、5g微晶纤维素、3g柠檬酸，混合均匀，以90%乙醇为润湿剂，制成软材，经18目筛制粒，烘干，12目筛整粒，分装，制成粒径为800-850μm的袋装颗粒剂。

取10g化合物I-8，依次加入30g蔗糖粉、8g羧甲基纤维素钠、8g微晶纤维素、5g柠檬酸，混合均匀，以80%乙醇为润湿剂，制成软材，经18目筛制粒，烘干，12目筛整粒，分装，制成粒径为800-850μm的袋装颗粒剂。

取5g化合物I-29，依次加入20g蔗糖粉、6g羧甲基纤维素钠、4g微晶纤维素、4g柠檬酸，混合均匀，以85%乙醇为润湿剂，制成软材，经18目筛制粒，烘干，12目筛整粒，分装，制成粒径为800-850μm的袋装颗粒剂。

实施例7

本发明具有双腙结构的甾体衍生物胶囊剂制备：

取10g化合物I-6，依次加入5g可压淀粉、2g羧甲基纤维素钠，混合均匀，以75%的乙醇为润湿剂，制成软材，经20目筛制粒，烘干，18目筛整粒，再加入0.2g硬脂酸镁，混合均匀，装胶囊即可。

取10g化合物I-6，依次加入5g可压淀粉、2g羧甲基纤维素钠，混合均匀，以80%的乙醇为润湿剂，制成软材，经20目筛制粒，烘干，18目筛整粒，再加入0.2g硬脂酸镁，混合均匀，装胶囊即可。

取15g化合物I-32，依次加入8g可压淀粉、3g羧甲基纤维素钠，混合均匀，以65%的乙醇为润湿剂，制成软材，经20目筛制粒，烘干，18目筛整粒，再加入0.3g硬脂酸镁，混合均匀，装胶囊即可。

实施例8

本发明具有双腙结构的甾体衍生物的片剂制备：

取10g化合物I-9，依次加入4g可压淀粉、3g羧甲基纤维素钠，混匀，以85%的乙醇为润湿剂，制成软材，经20目筛制粒，烘干，16目筛整粒，再加入0.2g硬脂酸镁，混匀，再经压片包衣，制成包衣片。

取20g化合物I-12，依次加入10g可压淀粉、6g羧甲基纤维素钠，混匀，以80%的乙醇为润湿剂，制成软材，经18目筛制粒，烘干，16目筛整粒，再加入0.5g硬脂酸镁，混匀，再经压片包衣，制成包衣片。

实施例9

本发明具有双腙结构的甾体衍生物的丸剂制备：

取10g化合物I-7，使之与10g聚乙二醇3000混合，将混合物水浴加热至60～70℃，搅拌约2h，然后用滴丸机滴制，滴制温度为70℃，在10℃左右的液体石蜡中冷却，制备成丸剂。

取20g化合物I-11，使之与20g聚乙二醇4000混合，将混合物水浴加热至60～70℃，搅拌约2h，然后用滴丸机滴制，滴制温度为70℃，在10℃左右的液体石蜡中冷却，制备成丸剂。

取5g化合物I-30，使之与10g聚乙二醇2000混合，将混合物水浴加热至50～60℃，搅拌约2h，然后用滴丸机滴制，滴制温度为60℃，在10℃左右的液体石蜡中冷却，制备成丸剂。

Claims (6)

1.结构如式I所示的具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用，

式I中：

R¹和R²各自独立为氢、甲基、乙基、三氟甲基、苯基或取代苯基、杂芳环或取代杂芳环中的一种；

或者，R¹和R²共同构成

其中，R为甲基、乙基、三氟甲基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、甲氧基、羟基、氟、氯、溴、碘、硝基、氰基或氢；

或者，R¹和R²共同构成-CH₂-(CH₂)_n-CH₂-或-CH₂-YR′-CH₂-，其中，n为1、2、3或4，Y为杂原子，R′为氢、C_1-4烷基、C_2-5烷氧基、C_1-4烷基-C_3-6烷氧基、C_3-6烷氧基-羰基、苄基及取代苄基、苄氧羰基、C_3-8环烷基-羰基、苯甲酰基、杂环基-羰基、C_1-6卤代烷基、C_1-6卤代烷氧基、卤代杂环基-羰基中的一种；

R³为氢、乙酰基、丙酰基、甲磺酰基、三氟乙酰基、三氟甲磺酰基或苯甲酰基中的一种。

2.根据权利要求1所述具有双腙结构的甾体衍生物作为抗病毒药物的应用，其特征在于：所述Y为氮、氧、硫、磷或硼原子中的一种。

3.权利要求1所述具有双腙结构的甾体衍生物的药学上可接受的盐作为抗病毒药物的应用。

4.根据权利要求3所述具有双腙结构的甾体衍生物的药学上可接受的盐作为抗病毒药物的应用，其特征在于：所述盐为盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐或苯甲酸盐中的一种。

5.一种抗病毒药物药物制剂，其特征在于：它由有效量的结构如式I所示的具有双腙结构的甾体衍生物和辅料组成。

6.根据权利要求5所述的抗病毒药物药物制剂，其特征在于：所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

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