CN112250726B

CN112250726B - 4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷化合物及其药物用途

Info

Publication number: CN112250726B
Application number: CN202011131948.2A
Authority: CN
Inventors: 陶乐; 郭晓河; 李玉江; 常俊标; 董黎红; 王强; 余学军; 郑果
Original assignee: High and New Technology Research Center of Henan Academy of Sciences; Henan Academy of Sciences
Current assignee: High and New Technology Research Center of Henan Academy of Sciences; Henan Academy of Sciences
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112250726A

Abstract

本发明公开了新型4‑天冬氨酸取代胞嘧啶核苷化合物及其药物用途，属药物化学领域。其具有通式（a）结构：

式中，R=OH,NH₂,甲胺，乙胺,C₃‑C₁₀的烷基胺，C₆‑C₁₂芳香烷基胺或者C₃‑C₆杂环烷基胺。优选：R=OH,NH₂,NHCH₂CH₃。通过对4‑天冬氨酸二甲酯‑1‑（2'‑脱氧‑2'‑β‑氟代‑4'‑α‑叠氮‑β‑D‑呋喃糖基)胞嘧啶的天冬氨酸二甲酯进行修饰，合成了4‑天冬氨酸取代嘧啶核苷衍生物，这些化合物具有抗科萨奇病毒活性，将其应用于治疗病毒性心肌炎药物，具有好的应用前景。

Description

4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷化合物及其药物用途

技术领域

本发明涉及胞嘧啶核苷类化合物，尤其涉及4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷化合物，合成方法及其药物用途，属药物化学领域。

背景技术

心脏是人体最重要的部位之一，它直接关系着人的生命体征。嗜心肌病毒感染会导致患者产生病毒性心肌炎，主要表现为心肌间质出现原发性非特异性炎症，在青少年中具有较高的发病率。引发疾病的主要病毒包括麻疹病毒、科萨奇病毒、流行性出血热等。患有病毒性心肌炎的患者在发病过程中出现基因及蛋白质表达异常，有较大的几率发生猝死，患者主要表现为心率失常，会出现心室纤颤、室性心动过速等,会导致患者出现急性心功能障碍，从而影响患者的生命健康。开发研制新型的抗病毒药物，或针对其发病机理设计新型的治疗药物是目前研究病毒性心肌炎药物的重要途径。

科萨奇病毒(Coxsachievirus,CV)是一类在自然界中普遍存在的病毒，1948年，首先从美国科萨奇镇的一位发热患者体内分离得到，因此命名为科萨奇病毒，该病毒共有30个血清型，分成A组和B组，A组病毒共24个血清型，B组病毒有6个血清型，其中科萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus B3,CVB3)是非常重要的一种亚型。CVB3通常引起人类心肌炎、扩张型心肌病等。

核苷类化合物在抗各种各样的病毒特别是在艾滋病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒方面起着极其重要的作用，但在抗科萨奇病毒B组3型方面研究的很少。在现有文献中，尚未发现含4-取代-胞嘧啶核苷化合物应用于抗CVB病毒药物的相关报道。

申请人在前期研究4-L-谷氨酸二甲酯取代嘧啶核苷化合物(见专利CN109265504A)及其药物用途的基础上，为了更好的拓展核苷及其类似物的用途，对嘧啶核苷的4-位取代氨基酸进行了改进，发现了具有更好的抗科萨奇病毒活性的先导化合物，而且毒性也较低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种活性好、毒性低的新型4-天冬氨酸取代-胞嘧啶核苷化合物；另一目的在于提供该类化合物的合成方法；又一目的在于提供该类化合物在制备病毒性心肌炎药物方面的应用。

为实现本发明目的，技术方案如下：

本发明所述4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷化合物，具有通式(a)结构：

式中，R＝OH,NH₂,甲胺，乙胺,C₃-C₁₀的烷基胺，C₆-C₁₂芳香烷基胺或者C₃-C₆杂环烷基胺。

优选：R＝OH,NH₂,NHCH₃，NHCH₂CH₃。

其可以是如下化合物之一且不仅限于这些化合物：

其反应路线、方法如下：

化合将已知化合物1溶于无水二氯甲烷，加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)和N-乙基二异丙基氨,反应混合物在室温和氮气保护下搅拌后加入TPSCl(2，4，6-三异丙基苯磺酰氯)，然后继续搅拌反应，加入水淬灭反应，分出有机相，二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，然后加入L-天冬氨酸二甲酯盐酸盐和DMAP，氮气保护下，加入无水乙腈，加入二异丙基乙胺。室温下搅拌过夜反应，得到浅黄色溶液，TLC检测反应结束，加入水得到白色浑浊液，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂。粗产品柱层析化合物2；将化合物2，四氢呋喃和甲醇混合液冷至零度后，加入碳酸钾，冰浴条件下继续反应，待反应完全，过滤，甲醇洗涤后减压浓缩，柱层析得化合物3；化合物3与甲醇、氨水或烷基胺反应，合成出化合物a。

化合物BG006的合成：

将化合物3溶于甲醇，加入氢氧化钠溶液，室温搅拌，加入乙酸，爬大板分离，得化合物BG006。

化合物BG007的合成：

室温条件下，化合物3中加入浓氨水，搅拌反应，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离得到化合物BG007。

化合物BG009的合成：

室温条件下，化合物3中加入乙胺水溶液，搅拌反应，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离得到化合物BG009。

本发明所述通式中所涵盖的化合物用于治疗或预防或缓解病毒引起疾病药物的制备，抗病毒药物包括抗科萨奇病毒、抗HBV、抗HIV、抗HCV。优选科萨奇病毒(CVB3)。

本发明所述化合物作为抗科萨奇病毒药物活性成分可以单独使用，也可以与其他抗病毒药物联合用药，本发明所指的联合用药治疗过程中，包括运用至少一种本发明化合物或其活性衍生物与其他一种或多种抗病毒药物一起使用以增加总体疗效。联合用药时的药量和给药时间应根据不同的情况下所取得的最合理治疗效果而定。

本发明创新点及优点在于：对化合物3的天冬氨酸甲酯进行了修饰，合成了4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷类化合物，这些化合物具有抗科萨奇病毒活性；制备方法可行；将其应用于治疗病毒药物，具有好的应用前景。

附图说明

图1为正常Hela细胞、感染CVB3病毒Hela细胞及本发明BG系列化合物治疗后细胞显微观察图片。(A)对照组，(B)模型组，(C)BG007浓度为12.5μM，(D)BG007浓度为25μM，(E)BG007浓度为50μM,(F)利巴韦林浓度为100μM。

具体实施方式

根据本发明通式化合物(a)的合成路线并结合实施例对发明进行进一步的说明，但并非限制本发明的范围。

实施例1：化合物2的合成：

将化合物1(1.06g，2mmol，1.0eq)溶于无水二氯甲烷(200ml)，加入DMAP(0.05g，0.40mmol)和N-乙基二异丙基氨(1.95g，15mmol),反应混合物在室温和氮气保护下搅拌1小时后，加入TPSCl(1014g，3.8mmol)，然后继续搅拌反应22小时，加入水(100ml)淬灭反应，分出有机相，二氯甲烷萃取两次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸出溶剂，然后加入L-天冬氨酸二甲酯盐酸盐(0.47g，2.4mmol，1.2eq)和DMAP(0.12g，1mmol，1eq)，氮气保护下，加入无水乙腈(15ml)，加入二异丙基乙胺(0.78g，6mmol，3eq)。室温下搅拌过夜反应，得到浅黄色溶液，TLC检测反应结束，加入水得到白色浑浊液，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸去溶剂。粗产品柱层析(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)，得到白色粉末化合物2(1.0g，75％)。¹H NMR(400Hz,CDCl3):8.12-7.96(4H,m),7.68-7.39(6H,m),6.79-6.74(1H,dd,J＝3.2,18.0Hz),5.18(1H,d,J＝8.0Hz),5.78-5.71(2H,m),5.58-5.45(1H,m),5.30-5.26(1H,m),3.79(3H,s),3.63(3H,s),3.15-3.02(3H,m)；

实施例2：化合物3的合成：

将化合物2(0.90g，1.3mmol，1.0eq)，四氢呋喃(8ml)和甲醇(2.5ml)混合液冷至零度后，加入碳酸钾(0.37g，2.6mmol)，冰浴条件下继续反应1小时，待反应完全，过滤，甲醇洗涤后减压浓缩，柱层析(二氯甲烷：甲醇＝10:1)，得到白色粉末化合物3(0.55g，95％)。¹HNMR(400Hz,DMSO-d₆):8.33(1H,d,J＝8.0Hz),7.62(1H,d,J＝7.2Hz),6.41-6.37(2H,m),5.95(1H,d,J＝7.6Hz),5.76-5.66(1H,m),5.27-5.11(1H,ddd,J＝4.8,4.2,44.0Hz),5.01-4.94(1H,m)，4.47-4.39(1H,ddd,J＝4.8,5.2,12.0Hz),3.77-3.72(2H,m),3.66(3H,s),3.63(3H,s),2.93-2.82(3H,m)；¹³C NMR(100Hz,DMSO-d₆):171.0,170.4,163.1,154.2,141.4,96.9(J_FC＝8.4Hz),95.5(J_FC＝191.0Hz),94.6,82.3(J_FC＝15.9Hz),74.9(J_FC＝24.3Hz),62.3,54.9,51.8,49.2,35.5.m/z(ESI)453(M⁺+Na,100％)[found:M⁺+Na,453.1123.C₁₅H₁₉FN₆O₈ requires 453.1141].

实施例3：化合物BG006的合成：

将化合物3(43mg，0.1mmol)溶于甲醇(4ml)，加入氢氧化钠溶液(0.5ml，0.5mmol，1M)，室温搅拌6小时，加入乙酸(35ml，0.6mmol)，爬大板分离(二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:1)，得白色粉末BG006(38mg，95％)。¹H NMR(400Hz,CD3OD):7.10(1H,d,J＝6.8Hz),6.56-6.52(1H,dd,J＝4.8，10.8Hz),6.05(1H,d,J＝6.8Hz),5.15(1H,d,J＝54.0Hz),4.75(1H,brs),4.59-4.53(1H,dd,J＝4.0,22.8Hz),3.89(2H,s)，3.21-3.15(1H,dd,J＝6.8,14.4Hz),2.80(2H,m)；¹³C NMR(100Hz,CD3OD):164.4,158.3,141.5,98.34,98.00，97.50(J_FC＝192.0Hz)，94.97,84.43(J_FC＝8.4Hz)，75.97(J_FC＝15.9Hz),63.02,54.25,47.32,40.18。

实施例4：化合物BG007的合成：

将化合物3(43mg，0.10mmol)，室温条件下加入浓氨水(10ml，17％)，然后继续搅拌反应2小时后，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离(二氯甲烷：甲醇＝3:1)得到白色粉末状固体化合物BG007(38mg，95％)。¹H NMR(400Hz,CD3OD):7.75-7.65(1H,m),6.50-6.45(1H,dd,J＝4.8，10.8Hz),6.00(1H,d,J＝8.0Hz),5.26-5.10(1H,ddd,J＝4.4，9.6，53.6Hz),4.51-4.44(1H,dd,J＝4.4,22.0Hz),3.84(2H,s),3.22-3.15(1H,dd,J＝6.8,14.4Hz)，2.79-2.71(2H,m)；¹³C NMR(100Hz,CD3OD):175.7,165.0,158.2,141.9,98.7,97.6，97.1(J_FC＝191.0Hz)，95.2,84.7(J_FC＝9.1Hz)，75.97(J_FC＝25Hz),63.4,53.7,47.7.

实施例5：化合物BG009的合成：

将化合物3(43mg，0.10mmol)，室温条件下加入乙胺水溶液(4ml，60％)，然后继续搅拌反应2小时后，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)得到白色粉末状固体化合物BG009(44mg，96％)。¹H NMR(400Hz,CD3OD):7.74-7.73(1H,d,J＝4.0Hz),,7.39-7.33(1H,m),6.50-6.46(1H,dd,J＝4.8,12.0Hz),5.99-5.97(1H,d,J＝8.0Hz),5.28-5.13(1H,ddd,J＝4.4，9.2，53.2Hz),5.01-4.97(1H,m),4.51-4.44(1H,dd,J＝4.4,21.6Hz),3.84(2H,s),3.24-3.15(4H,m)，2.75-2.62(2H,m),1.18-1.07(6H,m)；¹³CNMR(100Hz,CD3OD):172.6,171.8,165.3,158.1,142.2,129.52,128.1,98.7,97.1，97.1(J_FC＝192.7Hz)，95.2,85.0(J_FC＝16.7Hz),76.4(J_FC＝23Hz),63.4,52.7,35.5,35.4.

应用例抗科萨奇病毒活性

1、抗科萨奇病毒(CBV)体外活性试验：

1.1BG006,BG007,BG009对Hela细胞的毒性测定

采用MTT法检测BG006,BG007,BG009对Hela细胞作用72h后的毒性，计算不同浓度药物对细胞的抑制率，计算半数毒性浓度CC₅₀，具体步骤如下：

(1)收集对数生长期的Hela细胞，调整细胞悬液浓度为5×10⁴个/ml，将细胞接种到96孔板上，每孔加细胞悬液100μl，体积百分比5％CO₂，37℃培养。

(2)第二天观察细胞生长状态良好，弃去上清，每孔加入100μl不同浓度的含药培养基，同时设置阳性对照与空白对照，继续培养72h，每天观察细胞生长状态。

(3)取出96孔板，每孔加入20μl MTT，继续培养4h，小心吸弃孔内上清液，每孔加150μl DMSO，置于摇床，37℃低速避光震荡10min，使得蓝紫色结晶溶解充分。

(4)酶标仪测定各孔吸光度(检测波长490nm，参考波长630nm)，计算不同浓度BG006,BG007,BG009对细胞的抑制率，公式(1.1)：

(5)根据浓度抑制率梯度变化趋势，利用SPSS Statistics 17软件计算BG006,BG007,BG009对Hela细胞的半数毒性浓度CC₅₀值。

1.2CVB3病毒扩增

待Hela细胞长满单层，弃培养基并用灭菌PBS清洗两遍控干，加入CVB3病毒原液500μl，放置体积百分比5％CO₂，37℃培养箱内，每30min摇晃一次，均匀分布，病毒吸附2h后加入4.5ml新鲜培养基，继续培养。显微镜下观察细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)，当细胞病变量达75％，将培养瓶放置-80℃冰箱，反复冻融3次，使细胞充分裂解释放病毒，5ml移液枪充分吹打后收集病毒液，3000rpm/min离心10min，取上清于冻存管分装，-80℃保存备用。

1.3CVB3滴度测定

通过Reed-Mnench法计算半数组织细胞感染量，即CVB3病毒的TCID₅₀值。lgTCID₅₀＝CPE阳性出现率大于50％的最高稀释度对数+距离比例×稀释度的间距对数，其中距离比例＝(CPE阳性率大于50％的百分率-50)/(CPE阳性率大于50％的百分率-CPE阳性率低于50％的百分率)。

(1)消化生长状态良好的Hela细胞，调整细胞悬液浓度为8×10⁴个/ml，将细胞接种到96孔板上，每孔加细胞悬液100μl，体积百分比5％CO₂，37℃培养。

(2)预先融化病毒储备液，吹匀待用。终点稀释法滴定CVB3的TCID₅₀，使用含质量百分含量10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基按原液的10倍稀释，按10^-1至～10^-12的梯度稀释，每个浓度设置8个复孔，同时设置空白对照。

(3)待Hela细胞长至单层，弃上清，每孔加入100μl病毒稀释液，继续培养，每天观察并记录出现的病变孔数，待细胞病变不再发展(一般7天左右)，利用公式计算CVB3的TCID₅₀，确定后续实验中CVB3的最佳使用量。

1.4BG006,BG007,BG008体外抗CVB3活性实验根据细胞毒性和病毒滴度，设置合适的化合物浓度梯度和病毒感染剂量。设置空白细胞对照组、模型对照组、受试物组以及阳性药利巴韦林对照组。采用MTT法检测抗CVB3病毒的活性，计算IC₅₀值。

(1)将生长状态良好的Hela细胞，计数后调整细胞浓度至5×10⁴个/ml，接种至96孔板，每孔100μl，培养过夜，观察细胞长至单层。

(2)不同浓度的含药培养基与病毒稀释液各50μl/孔，每组药物设置5组浓度，3个复孔，同时设置空白细胞对照组、模型对照组以及阳性药利巴韦林对照组，培养5天。

(3)观察细胞，待模型对照组CPE达75％以上，空白对照组细胞生长正常时，每孔加入20μl MTT，培养4h后吸弃上清，每孔加150μl DMSO，置于摇床，37℃低速避光震荡10min，使得蓝紫色结晶溶解充分。

(4)酶标仪检测吸光度，计算不同药物浓度下对CVB3病毒的抑制率。SPSSStatistics 17软件计算半数有效浓度IC₅₀值。

2实验结果

2.1BG006,BG007,BG009细胞毒性结果

空白对照组生长状态良好，细胞饱满通透，排列紧密，不同浓度梯度的本发明化合物作用细胞72h后，可观察到高浓度药物条件下细胞皱缩、破碎，停止生长。MTT法检测毒性结果，酶标仪读取吸光度值，公式计算药物对细胞的抑制作用，求出BG006,BG007,BG009对Hela细胞的半数毒性剂量CC₅₀值和阳性药物利巴韦林的CC₅₀值(表1)。结果表明BG006、BG007、BG009毒性远低于利巴韦林。

2.2CVB3的病毒滴度结果

正常Hela细胞形态饱满，透亮，呈现多边形上皮细胞样，而经CVB3病毒感染后发生病变，细胞皱缩变圆，间隙增大，连接松散，折光度降低，贴壁性减弱，部分细胞破碎漂浮。观察到第7天至病变不再进展，记录不同倍数病毒稀释组出现病变孔数。通过Reed-Mnench法计算，TCID₅₀＝10^-10.5。

2.3BG006,BG007,BG009体外抗CVB3活性结果

显微镜下观察，空白对照组(正常Hela细胞)细胞形态正常，通透，排列紧密。CVB3病毒接种后5天，病毒对照组完全病变。经BG006,BG007,BG009治疗后，病变程度减轻，且随药物剂量的升高，病变效应减弱，呈现剂量依赖关系。计算病毒抑制率并计算BG006,BG007,BG009对CVB3病毒的半数抑制浓度IC₅₀，其中BG006、BG007、BG009对CVB3病毒的半数抑制浓度IC50分别为26.90、7.43、13.90μM；利巴韦林的IC50为33.5μM。(表1)。结果表明BG006、BG007、BG009对CVB3病毒均具有明显抑制作用，且其抗CVB3活性优于利巴韦林。

表1 化合物BG006、BG007、BG009细胞毒性及抗CVB3活性

化合物	CC<sub>50</sub>(μM)	IC<sub>50</sub>(μM)	治疗指数TI
				BG006	＞1000	26.90	＞37.17
BG007	＞1000	7.43	＞134.58
				BG009	＞1000	13.90	＞76.92
利巴韦林	911.2	33.5	27.2

由图1可以看出，正常Vero细胞形态正常，通透，排列紧密。CVB3病毒感染5天后，细胞完全病变、皱缩。经BG007(12.5-50μM)治疗后，病变程度减轻，且随药物剂量的升高，病变效应减弱，呈现剂量依赖关系。

与专利CN 109265504 A中合成的4-氨基酸取代嘧啶核苷化合物GY001-005相比，4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷化合物BG006、BG007、BG009的活性更好，毒性更低。

CN 109265504 A中合成的4-氨基酸取代嘧啶核苷化合物GY001-005毒性与活性如下表2所示：

表2 4-氨基酸取代嘧啶核苷化合物GY001-005细胞毒性和抗CVB3病毒活性

Claims

1.4-天冬氨酸取代胞嘧啶核苷衍生物，其特征在于，

选自如下化合物之一：

。