CN112159395B

CN112159395B - 4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷类化合物及其药物用途

Info

Publication number: CN112159395B
Application number: CN202011130310.7A
Authority: CN
Inventors: 郭晓河; 陶乐; 李玉江; 常俊标; 董黎红; 王强; 余学军; 郑果
Original assignee: High and New Technology Research Center of Henan Academy of Sciences; Henan Academy of Sciences
Current assignee: High and New Technology Research Center of Henan Academy of Sciences; Henan Academy of Sciences
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112159395A

Abstract

本发明公开了新型4‑丙胺酸取代胞嘧啶核苷类化合物及其药物用途，属药物化学领域。其具有通式（I）结构：

式中，R=NH₂,C₁‑C₁₀的烷基胺,优选：R=NH₂,NHCH₃,NHCH₂CH₃。通过对4‑丙氨酸甲酯‑1‑（2'‑脱氧‑2'‑β‑氟代‑4'‑α‑叠氮‑β‑D‑呋喃糖基)胞嘧啶的丙氨酸甲酯进行修饰，合成了4‑丙氨酸取代嘧啶核苷衍生物，该类化合物具有抗科萨奇病毒活性；将其应用于治疗病毒性心肌炎药物，具有好的应用前景。

Description

4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷类化合物及其药物用途

技术领域

本发明涉及嘧啶核苷类化合物，尤其涉及4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷类化合物、合成方法及其药物用途，属药物化学领域。

背景技术

病毒性心肌炎是由病毒感染所致的以心肌炎症病变为主的疾病，约占心肌炎的50％。由于病情轻重不同，患者临床表现差异较大，取决于病变的广泛程度与部位，轻者可无症状，重者可并发严重的心律失常、心功能不全、亦可演变成扩张性心肌病，甚至猝死，严重危害生命健康，特别是对儿童和青少年危害更大。就目前的整个医疗水平和患者的需求而言，仍旧迫切需要有效治疗病毒性心肌炎的药物。因此，开发研制新型的抗病毒药物或针对其发病机理设计新型的治疗药物是目前研究病毒性心肌炎药物的重要途径。

科萨奇病毒一般分类A组和B组病毒。科萨奇A组病毒引起骨骼肌广泛性肌炎和弛缓性瘫痪，B组病毒可引起灶性分布的肌炎，并可引起脂肪组织炎、脑炎、心肌炎、胰腺炎、肝炎和心内膜炎。

核苷及其类似物在抗HIV、HBV、HCV病毒方面起着极其重要的作用，但在抗科萨奇病毒方面的研究较少。在现有文献中，尚未发现含4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷类化合物应用于抗科萨奇病毒(CVB)病毒药物的相关报道。

申请人在前期研究4-L-谷氨酸二甲酯取代嘧啶核苷化合物(见专利CN 109265504A)及其药物用途的基础上，为了更好地拓展核苷及其类似物的用途，对嘧啶核苷的4-位取代氨基酸进行了改进，发现了具有更好的抗科萨奇病毒活性的先导化合物，而且毒性也较低。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种活性好、毒性低的新型4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷化合物；另一目的在于提供该类化合物的合成方法；又一目的在于提供该类化合物在制备病毒性药物方面的应用。

为实现本发明目的，技术方案如下：

本发明所述4-丙胺酸取代-胞嘧啶核苷类化合物，具有通式(I)结构：

式中，R＝NH₂,C₁-C₁₀的烷基胺,

优选：R＝NH₂,NHCH₃,NHCH₂CH₃。

其可以是如下化合物之一且不仅限于这些化合物：

其反应路线、方法如下：

将已知化合物4-丙胺酸甲酯-1-(2'-脱氧-2'-β-氟代-4'-α-叠氮-β-D- 呋喃糖基)胞嘧啶(1)加入到带有不同取代基的胺类化合物中，密闭，加热反应，反应完毕后减压蒸干，用柱层析分离纯化得到化合物I。

化合物BG001的合成：

室温条件下将化合物1加入到甲胺水溶液中，搅拌反应，薄层层析跟踪检测至原料反应完全，减压蒸出溶剂，快速柱层析分离，得到白色粉末状固体化合物 BG001)。

化合物BG003的合成：

室温条件下将化合物1加入到浓氨水中，搅拌反应，薄层层析跟踪检测至原料反应完全，减压蒸出溶剂，快速柱层析分离，得到化合物BG003。

化合物BG004的合成：

室温条件下将化合物1加入到乙胺水溶液中，搅拌反应，薄层层析跟踪检测至原料反应完全，减压蒸出溶剂，快速柱层析分离，得到化合物BG004。

本发明所述通式中所涵盖的化合物可用于制备抗病毒药物(抗科萨奇病毒、抗HBV、抗HIV、抗HCV)。所指病毒优选科萨奇病毒。本发明合成的化合物作为抗病毒药物活性成分，可以单独使用，也可以与其他抗病毒药物联合用药，本发明所指的联合用药治疗过程中，包括运用至少一种本发明化合物或其活性衍生物与其他一种或多种抗病毒药物一起使用以增加总体疗效。联合用药时的药量和给药时间应根据不同的情况下所取得的最合理治疗效果而定。

本发明创新点及优点在于：对4-丙胺酸甲酯-胞嘧啶核苷类化合物(1)的丙胺酸甲酯进行了修饰，合成了4-丙胺酸衍生物-胞嘧啶核苷类化合物，这些化合物具有抗科萨奇病毒活性，对CVB3病毒具有明显抑制作用，其抗CVB3活性优于利巴韦林，且毒性低。制备方法简单可行；将其应用于治疗病毒药物，具有好的应用前景。

附图说明

图1为正常Hela细胞、感染CVB3病毒Hela细胞及本发明BG系列化合物治疗后细胞显微观察图片。(A)对照组，(B)模型组，(C)BG004浓度为12.5μM，(D) BG004浓度为25μM，(E)BG004浓度为50μM，(F)利巴韦林浓度为100μM。

具体实施方式

根据本发明通式化合物(A)的合成路线并结合实施例对发明进行进一步的说明，但并非限制本发明的范围。

实施例1：化合物BG001的合成：

将化合物1((50mg，0.12mmol)，室温条件下加入甲胺水溶液中(5mL，质量百分浓度40％)，然后继续搅拌反应2小时后，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)得到白色粉末状固体化合物BG001

(48mg，96％)。¹H NMR(400Hz,CD₃OD):7.73-7.71(1H,dd,J＝1.2,7.6 Hz),6.50-6.46(1H,dd,J＝7.2,12.0Hz),5.98-5.96(1H,d,J＝7.6 Hz),5.26-5.12(1H,m),4.61-4.60(1H,m),4.50-4.44(1H,dd,J＝4.4, 21.6Hz),3.83(2H,s),2.74(3H,m),1.40-1.38(3H,m)；¹³C NMR(100Hz, CD₃OD):175.5,165.2,158.2,142.0,98.6(J_FC＝6.7Hz),97.1,97.1, 95.2(J_FC＝189.7Hz),84.9(J_FC＝17.5Hz),76.5(J_FC＝24.3Hz),63.5,51.1, 18.3.

实施例2：化合物BG003的合成：

将化合物1(50mg，0.12mmol)，室温条件下加入浓氨水中(10ml，质量百分浓度17％)，然后继续搅拌反应2小时后，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离(二氯甲烷：甲醇＝3:1)得到白色粉末状固体化合物BG003(46mg， 96％)。¹H NMR(400Hz,CD₃OD):7.72-7.70(1H,d,J＝7.6Hz),6.50-6.46(1H, dd,J＝7.2,12.4Hz),5.99-5.97(1H,d,J＝8.0Hz),5.27-5.11(1H,ddd, J＝4.4,9.2,58.4Hz),4.69-4.63(1H,m),4.50-4.44(1H,dd,J＝4.8, 21.6Hz),3.83(2H,s),1.42-1.41(3H,m)；¹³C NMR(100Hz,CD₃OD):177.6, 165.2,158.2,141.9,98.6(J_FC＝7.6Hz),97.1,95.2(J_FC＝188.9Hz),84.9(J_FC＝16.7Hz),76.5(J_FC＝25.0Hz),63.4,18.4.

实施例3：化合物BG004的合成：

将化合物1(50mg，0.12mmol)，室温条件下加入乙胺水溶液中(4ml，质量百分浓度60％)，然后继续搅拌反应2小时后，TLC检测反应结束，减压蒸出溶剂，快速柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)得到白色粉末状固体化合物BG004(50mg， 97％)。¹H NMR(400Hz,CD₃OD):7.72-7.70(1H,dd,J＝1.2,7.6Hz),6.50-6.46 (1H,dd,J＝7.2,12.0Hz),5.98-5.96(1H,d,J＝7.6Hz),5.26-5.11(1H, ddd,J＝4.4,7.2,49.2Hz),4.63-4.57(1H,m),4.50-4.44(1H,dd,J＝4.4, 21.6Hz),3.83(2H,s),3.24-3.18(2H,m),1.41-1.39(3H,m),1.13-1.09(3H,m)；¹³C NMR(100Hz,CD₃OD):174.6,165.1,158.1,142.0,131.0,98.5(J_FC＝6.7Hz),97.1,95.2(J_FC＝191.0Hz),84.8(J_FC＝17.5Hz),76.4(J_FC＝21.6Hz), 63.4,51.1,35.4,18.3.

应用例抗科萨奇病毒活性试验

1抗科萨奇病毒(CBV)体外活性实验：

1.1化合物BG001，BG003，BG004对Hela细胞的毒性测定

采用MTT法检测BG001，BG003，BG004对Hela细胞作用72h后的毒性，计算不同浓度药物对细胞的抑制率，计算半数毒性浓度CC₅₀，具体步骤如下：

(1)收集对数生长期的Hela细胞，调整细胞悬液浓度为5×10⁴个/ml，将细胞接种到96孔板上，每孔加细胞悬液100μl，体积百分浓度5％CO₂，37℃培养。

(2)第二天观察细胞生长状态良好，弃去上清，每孔加入100μl不同浓度的含药培养基，同时设置阳性对照与空白对照，继续培养72h，每天观察细胞生长状态。

(3)取出96孔板，每孔加入20μl MTT，继续培养4h，小心吸弃孔内上清液，每孔加150μl DMSO，置于摇床，37℃低速避光震荡10min，使得蓝紫色结晶溶解充分。

(4)酶标仪测定各孔吸光度(检测波长490nm，参考波长630nm)，计算不同浓度BG001-011对细胞的抑制率，公式(1.1)：

(5)根据浓度抑制率梯度变化趋势，利用SPSS Statistics 17软件计算BG001，BG003，BG004对Hela细胞的半数毒性浓度CC₅₀值。

1.2 CVB3病毒扩增

待Hela细胞长满单层，弃培养基并用灭菌PBS清洗两遍控干，加入CVB3 病毒原液500μl，放置体积百分浓度5％CO₂，37℃培养箱内，每30min摇晃一次，均匀分布，病毒吸附2h后加入4.5ml新鲜培养基，继续培养。显微镜下观察细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)，当细胞病变量达75％，将培养瓶放置-80℃冰箱，反复冻融3次，使细胞充分裂解释放病毒，5ml移液枪充分吹打后收集病毒液，3000rpm/min离心10min，取上清于冻存管分装，-80℃保存备用。

1.3 CVB3滴度测定

通过Reed-Mnench法计算半数组织细胞感染量，即CVB3病毒的TCID₅₀值。 lgTCID₅₀＝CPE阳性出现率大于50％的最高稀释度对数+距离比例×稀释度的间距对数，其中距离比例＝(CPE阳性率大于50％的百分率-50)/(CPE阳性率大于50％的百分率-CPE阳性率低于50％的百分率)。

(1)消化生长状态良好的Hela细胞，调整细胞悬液浓度为8×10⁴个/ml，将细胞接种到96孔板上，每孔加细胞悬液100μl，体积百分浓度5％CO₂，37℃培养。

(2)预先融化病毒储备液，吹匀待用。终点稀释法滴定CVB3的TCID₅₀，使用含质量百分浓度10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基按原液的10倍稀释，按10^-1至～10^-12的梯度稀释，每个浓度设置8个复孔，同时设置空白对照。

(3)待Hela细胞长至单层，弃上清，每孔加入100μl病毒稀释液，继续培养，每天观察并记录出现的病变孔数，待细胞病变不再发展(一般7天左右)，利用公式计算CVB3的TCID₅₀，确定后续实验中CVB3的最佳使用量。

1.4化合物BG001，BG003，BG004体外抗CVB3活性实验

根据细胞毒性和病毒滴度，设置合适的化合物浓度梯度和病毒感染剂量。设置空白细胞对照组、模型对照组、受试物组以及阳性药利巴韦林对照组。采用MTT法检测抗CVB3病毒的活性，计算IC₅₀值。

(1)将生长状态良好的Hela细胞，计数后调整细胞浓度至5×10⁴个/ml，接种至96孔板，每孔100μl，培养过夜，观察细胞长至单层。

(2)不同浓度的含药培养基与病毒稀释液各50μl/孔，每组药物设置5 组浓度，3个复孔，同时设置空白细胞对照组、模型对照组以及阳性药利巴韦林对照组，培养5天。

(3)观察细胞，待模型对照组CPE达75％以上，空白对照组细胞生长正常时，每孔加入20μl MTT，培养4h后吸弃上清，每孔加150μl DMSO，置于摇床，37℃低速避光震荡10min，使得蓝紫色结晶溶解充分。

(4)酶标仪检测吸光度，计算不同药物浓度下对CVB3病毒的抑制率。SPSSStatistics 17软件计算半数有效浓度IC₅₀值。

2实验结果

2.1化合物BG001，BG003，BG004细胞毒性结果

空白对照组生长状态良好，细胞饱满通透，排列紧密，不同浓度梯度的化合物BG001，BG003，BG004作用细胞72h后，可观察到高浓度药物条件下细胞皱缩、破碎，停止生长。MTT法检测毒性结果，酶标仪读取吸光度值，公式计算药物对细胞的抑制作用，求出化合物BG001，BG003，BG004对Hela细胞的半数毒性剂量CC₅₀值和阳性药物利巴韦林的CC₅₀值(表1)。结果表明BG001、BG003、 BG004毒性远低于利巴韦林。

2.2 CVB3的病毒滴度结果

正常Hela细胞形态饱满，透亮，呈现多边形上皮细胞样，而经CVB3病毒感染后发生病变，细胞皱缩变圆，间隙增大，连接松散，折光度降低，贴壁性减弱，部分细胞破碎漂浮。观察到第7天至病变不再进展，记录不同倍数病毒稀释组出现病变孔数。通过Reed-Mnench法计算，TCID₅₀＝10^-10.5。

2.3化合物BG001，BG003，BG004体外抗CVB3活性结果

显微镜下观察，空白对照组(正常Hela细胞)细胞形态正常，通透，排列紧密。CVB3病毒接种后5天，病毒对照组完全病变。经化合物BG001，BG003， BG004治疗后，病变程度减轻，且随药物剂量的升高，病变效应减弱，呈现剂量依赖关系(图1)。计算病毒抑制率并计算化合物BG001，BG003，BG004对CVB3 病毒的半数抑制浓度IC₅₀，其中BG001、BG003、BG004对CVB3病毒的半数抑制浓度IC50分别为28.68、5.89、12.25μM；利巴韦林的IC50为33.5μM。(表1)。结果表明BG001、BG003、BG004对CVB3病毒均具有明显抑制作用，且其抗 CVB3活性优于利巴韦林。

表1化合物BG001、BG003、BG004细胞毒性及抗CVB3活性

化合物	CC<sub>50</sub>(μM)	IC<sub>50</sub>(μM)	治疗指数TI
				BG001	＞1000	28.68	＞34.87
BG003	＞1000	5.89	＞169.78
				BG004	＞1000	12.25	＞81.63
利巴韦林	911.2	33.5	27.2

由图1可以看出，正常Vero细胞形态正常，通透，排列紧密。CVB3病毒感染5天后，细胞完全病变、皱缩。经BG004(12.5-50μM)治疗后，病变程度减轻，且随药物剂量的升高，病变效应减弱，呈现剂量依赖关系。BG001，BG003， BG004对CVB3病毒均具有明显抑制作用，该类化合物的开发将为科萨奇病毒患者特别是科萨奇病毒患者带来光明。

与专利CN 109265504 A中合成的4-氨基酸取代嘧啶核苷化合物GY001-005 相比，4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷类化合物BG001、BG003、BG004的活性更好，毒性更低。

CN 109265504 A中合成的4-氨基酸取代嘧啶核苷化合物GY001-005毒性与活性如下表2所示：

表2 4-氨基酸取代嘧啶核苷化合物GY001-005细胞毒性和抗CVB3病毒活性

Claims

1.4-丙胺酸取代胞嘧啶核苷衍生物，其特征在于，选自如下化合物之一：

。