CN111747944B - 广谱抗包膜病毒化合物、组合物及其应用 - Google Patents

广谱抗包膜病毒化合物、组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及广谱抗包膜病毒化合物、组合物及其应用。化合物包括如式(I)所示的结构或其药学上可接受的盐。本发明发现该系列化合物具有广谱且高效的抗包膜病毒活性，能主动进攻包膜病毒使其失去感染能力、将其抵御于靶细胞之外、更大程度地保护细胞正常生理功能。此外，该系列化合物对不同包膜病毒均具有较高的选择指数(CC50/IC50或CC50/EC50)，其中针对HIV‑1的选择指数更是高达6806，具有较高的安全性。本发明提供了一种广谱高效的抗病毒小分子化合物，具有制备方法简单、成本低、易于运输存储、安全性高、活性好的优点，在生物医学领域及应对新发突发传染病领域具有广阔的前景。

Description

广谱抗包膜病毒化合物、组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及广谱抗病毒化合物或组合物及其应用。
背景技术
现今，病毒性传染病严重威胁着人类的健康，并对人类社会造成了严重的经济损失。细胞因子(干扰素和胸腺素)、逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和整合酶抑制剂等抗病毒药物的研发已使得AIDS、乙型病毒性肝炎等成为可控制的疾病。但是，临床上针对病毒生命周期的特异性酶抑制剂的应用，导致了耐药株不断出现，迫使我们急需研发其它的广谱抗病毒药物，为患者提供更多的可选方案。此外，值得重视的是，近年来以包膜病毒为主导的一些新发突发病毒(如：IAV、SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、EBOV、ZIKV等)频发，而针对单一病毒的特异性疫苗具有研发耗时长、成本高、贮藏和运输不便以及缺乏交叉保护效果等缺点。
因此，研发新的小分子类广谱抗包膜病毒药物在缓解目前耐药问题以及应对新发突发传染病方面具有显著优势。小分子类广谱抗病毒药物的开发具有重要的现实意义。本发明通过提供新的化合物来解决上述问题。
发明内容
本发明基于发明人的以下发现：本发明的化合物具有广谱且高效的抗包膜病毒活性。本发明的化合物可以主动进攻包膜病毒使其失去感染能力、将其抵御于靶细胞之外、更大程度地保护细胞正常生理功能。例如，包膜病毒选自Ⅰ型包膜病毒、Ⅱ型包膜病毒和Ⅲ型包膜病毒，特别是流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒或水疱性口炎病毒。本发明的化合物对不同包膜病毒均具有较高的选择指数(CC50/IC50或CC50/EC50)，具有较高的安全性。本发明提供了一种广谱高效的抗病毒小分子化合物，具有成本低、易于运输存储、安全性高、活性好的优点，在生物医学领域及应对新发突发传染病领域具有广阔的前景。
在一方面，本发明提供了具有式(I)的化合物或其药学可接受的盐，
Figure BDA0002581063130000021
其中R1选自卤素、CH3、OH、SH、或者NH2；
R2选自-COOH；-COOR，其中R为直链或支链C1-6烷基；-COSH；-COSR，其中R为直链或支链C1-6烷基；-C(＝O)NH2；
R3为-L-CH2-R’，其中L为O、S、NH或-CH2-；R’选自氢，直链或支链C1-6烷基，C2-6炔基，-L’-C2-6炔基，其中L’选自-CH2OCH2-，-CH2SCH2-，-CH2NHCH2-或-CH2CH2CH2-，用以下基团任选取代的C3-6环烷基，C3-6杂环基，苯基或者5元或6元杂芳基：一个或多个C1-3烷基、卤素、OH、SH、或者NH2。
在一个实施方案中，R3为
Figure BDA0002581063130000022
Figure BDA0002581063130000023
在一个实施方案中，化合物是式(II)的化合物：
Figure BDA0002581063130000024
其中R为
Figure BDA0002581063130000025
Figure BDA0002581063130000026
在一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物或其药学可接受的盐和药物载体。
在一个实施方案中，药物组合物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆、乳剂、注射剂、软膏剂、气雾剂或栓剂。
在一方面，本发明提供了消毒用品，其包含本发明的化合物。
在一个实施方案中，消毒用品选自消毒液、消毒纸巾或消毒凝胶。
在一方面，本发明提供了在体外失活病毒或预防病毒的方法，其包括使化合物、药物组合物或消毒用品与病毒接触的步骤，其中病毒包含包膜病毒。
在一个实施方案中，包膜病毒选自Ⅰ型包膜病毒、Ⅱ型包膜病毒和Ⅲ型包膜病毒，优选选自流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒或水疱性口炎病毒。
在一方面，本发明提供了本发明的化合物或药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于抑制病毒感染、清除或减少病毒、或者治疗或预防由病毒引起的疾病，其中病毒包含包膜病毒。
在一个实施方案中，包膜病毒选自Ⅰ型包膜病毒、Ⅱ型包膜病毒和Ⅲ型包膜病毒，优选选自流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒或水疱性口炎病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的化合物属于能够广谱失活包膜病毒的小分子化合物，在应对包膜病毒引起的新发突发传染病中具有独特优势。在用于包膜病毒失活剂或药物组合物时，能主动进攻病毒颗粒使其失去感染能力，将其抵御于靶细胞之外，降低病毒进入细胞后对细胞正常生理功能的损害，并有望缓解针对病毒进入细胞后生命周期的药物引起的耐药性。
(2)本发明提供的化合物用于广谱失活包膜病毒的药物时，具有“可口服”的独特优势。
附图说明
图1是本发明的化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013的抗SARS-CoV-2假病毒感染的结果。其中，A：不同浓度的化合物与SARS-CoV-2假病毒于37℃孵育30min后，将混合物感染hACE2-293T细胞，37℃培养48小时后通过萤光素酶实验检测抑制活性。B：不同浓度的化合物与hACE2-293T细胞在4℃孵育1小时后，用PBS清洗细胞3次，彻底去除残留的化合物。将SARS-CoV-2假病毒加入上述细胞中，37℃培养48小时后通过萤光素酶实验检测病毒的感染情况。C：化合物与SARS-CoV-2假病毒在4℃孵育1小时后，加入PEG-6000于4℃孵育1小时并13000rpm/min离心30min，用PBS清洗病毒沉淀3次，彻底去除残留的化合物。将处理后的假病毒加入hACE2-293T细胞中，37℃孵育48小时后通过萤光素酶实验检测病毒的感染活性。D：不同浓度的化合物与不同细胞孵育48小时后，根据CCK-8试剂盒说明检测化合物对细胞的毒性。
图2是化合物FD001抑制流感病毒H3N2、2009H1N1对MDCK细胞感染的空斑实验结果。
图3是化合物FD001和FD0012抑制ZIKV PRVABC59(2015/Puerto Rico)对Vero-E6细胞感染的空斑实验结果。
图4是化合物FD001和FD0012抑制VSV假病毒对Huh-7细胞感染的活性，通过萤光素酶实验检测。
图5是化合物FD001和FD0012对非包膜病毒抑制效果的检测结果。其中，A：化合物抑制HPV16、HPV58假病毒感染Hela细胞的活性，通过萤光素酶实验检测。B：化合物抑制EV71(FJ08089)感染RD细胞的活性，通过CCK-8实验检测。
具体实施方式
除非另外定义，本发明中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在现有技术与本发明冲突的情况下，应当以本发明为准。
本发明提供了具有式(I)的化合物或其药学可接受的盐，
Figure BDA0002581063130000041
其中R1选自卤素、CH3、OH、SH、或者NH2；
R2选自-COOH；-COOR，其中R为直链或支链C1-6烷基；-COSH；-COSR，其中R为直链或支链C1-6烷基；-C(＝O)NH2；
R3为-L-CH2-R’，其中L为O、S、NH或-CH2-；R’选自氢，直链或支链C1-6烷基，C2-6炔基，-L’-C2-6炔基，其中L’选自-CH2OCH2-，-CH2SCH2-，-CH2NHCH2-或-CH2CH2CH2-，用以下基团任选取代的C3-6环烷基，C3-6杂环基，苯基或者5元或6元杂芳基：一个或多个C1-3烷基、卤素、OH、SH、或者NH2。
在一个实施方案中，R3为
Figure BDA0002581063130000051
Figure BDA0002581063130000052
在一个实施方案中，化合物可以是式(II)的化合物：
Figure BDA0002581063130000053
其中R为
Figure BDA0002581063130000054
Figure BDA0002581063130000055
如本文所用，术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。在本文中，卤素可以是氟、氯、溴和碘中的任一种。
术语“C1-6烷基”指包括含1-6个碳原子的、直链和支链的饱和烃基，如甲基、乙基、1-甲基乙基、1,1-二甲基乙基、丙基、2-甲基丙基、丁基、戊基、己基等。
术语“C2-6炔基”定义为具有饱和碳-碳键和至少一个三键、并具有2-6个碳原子的直链和支链烃基，例如，乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、2-甲基-2-丁炔基、2-甲基-2-戊炔基等。
术语“C3-6环烷基”指含有3、4、5或6个碳原子的环状脂族(环脂族)烃基，即C3-6环脂族残基，其中，该烃是饱和及未被取代的。该环烷基可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
如本文中所用，术语“C3-6杂环基”是指含有3至6个环成员，即3、4、5或6个环成员的饱和脂族(但非芳香族)杂环烷基，即根据本发明的杂环基是3至6元杂环基，其中至少一个碳原子，若适当亦可是二或三个碳原子，被各自相互独立地选自O、S、N、NH与N(C1-8烷基)优选O的杂原子或杂原子基团取代，其中，该环成员是未被取代的。因此，杂环基是杂环脂族残基。该杂环基可经由杂环基残基上任何所需要或可能的环成员与相应的上级总体结构键合。杂环基残基可以选自氮杂环丁烷基、氮杂环丙烷基、二硫杂环戊烷基、二氢吡咯基、二氧杂环己烷基、二氧杂环戊烷基、二氢吡啶基、二氢呋喃基、咪唑烷基、异恶唑烷基、吗啉基、氧杂环基烷基、氧杂环丁烷基、吡咯烷基、哌嗪基、4-甲基哌嗪基、哌啶基、吡唑烷基、吡喃基、四氢吡咯基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、四氢呋啶基、四氢噻吩基、噻唑烷基与硫代吗啉基。
术语“杂芳基”是指含有一个或多个杂原子的单价芳环基。杂芳基可以是呋喃基、噻吩基、噁唑基、吖啶基、吩嗪基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并噻吩基、苯并噁二唑基、苯并三唑基、咪唑基、吲哚基、异噁唑基、异喹啉基、吲嗪基、异噻唑基、异吲哚基噁二唑基、吲唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡咯基、吡嗪基、吡唑基、嘌呤基、酞嗪基、蝶啶基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三唑基、四唑基、噻唑基、三嗪基、噻二唑基等，及其氧化物，例如吡啶基-N-氧化物。术语“5元或6元杂芳基”表示含选自氮、氧和硫原子的1-3个杂原子的芳族5元或6元杂环基，其实例包括3-吡啶基、3-噻吩基和1-吡唑基。
如本文中所用，“药学上可接受的盐”是抗病毒化合物与有机或无机酸的盐。例如，药学上可接受的盐为氯化物、溴化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐，以及本领域普通技术人员知道的那些盐。本发明的药学上可接受的盐系用常规化学方法从含碱性或酸性基团的苯并咪唑衍生物进行合成的。一般来说，盐是通过游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量量的合适的碱或酸在水或有机溶剂中或在二者的混合物中进行反应而制得；一般来说，以非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈为佳。合适的盐列于Remington’sPharmaceuticla Sciences,第17版，Mack出版公司，Easton,Pa.,1985,第1418页。
如本文中所用，“药物载体”是将抗病毒剂传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体的，按意欲给药的途径加以选择。
化合物的施用量根据哺乳动物的种类和体重及受治疗的病毒或病毒感染而有大的变化。给药剂量随已知的因素而有大的变化，这些因素如特定抗病毒化合物的药物动力学特征及给药方式和途径；年龄、性别、代谢速率、吸收效率、接受治疗者的健康状况和体重；症状的性质和程度；所施用的合并治疗种类；治疗的频率；及所需的治疗效应。
通过各种方式使本发明的化合物与哺乳动物或动物机体的药物作用部位接触来抑制病毒生长或病毒感染。它们作为单独的治疗剂或与其它治疗剂合用以常规方法给药，这些方法在联合用药中可加以应用。
剂量单位可包括单一化合物或与其它化合物、其它病毒抑制化合物或其它抗病毒化合物的混合物。本发明的化合物可以以口服剂型给药，如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆和乳剂。本发明的化合物还可经静脉(快速推注或输注)、腹腔内、皮下或肌内给药，均使用药剂领域普通技术人员熟知的剂型。
本发明的化合物构成活性成分并典型地与合适的药物稀释剂、填充剂、赋形剂或载体(此处统称药物载体或载体物质)混合，这些物质根据制备给药的方式加以选择，且符合常规的药学实践。剂量单位可为适合于口服、直肠给药、局部给药、静脉注射或非经胃肠道给药的液体形式。
本发明的化合物可单独给药，但一般与药物载体混合。该载体可以是固体或液体，载体的类型一般根据使用的给药形式加以选择。
片剂可包含合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、致流动剂和熔化剂。例如，在口服用片剂或胶囊剂型中，活性成分可与口服无毒的药学上可接受的惰性载体(如乳糖、明胶、琼脂、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、硫酸钙、甘露醇、山梨醇等)混合。
合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然和合成树胶，如阿拉伯胶、黄耆胶或藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。这些剂型中所用的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括(但不限于)淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。
本发明的化合物还可以脂质体给药系统的形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可从各种磷脂形成，如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱。
本发明的化合物还可与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这样的聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺酚或棕榈酰残基取代的聚环氧乙烯-多熔素。本发明的化合物还可偶联于用来达到药物控释的一类生物可降解聚合物，例如，聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲嵌段共聚物。
本发明的化合物可以固体剂型(如胶囊、片剂和粉剂)或液体剂型(如酏剂、糖浆和悬浮液)口服给药。还可以灭菌液体剂型非经胃肠道给药。
明胶胶囊可包含活性成分和粉状载体，如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。类似的稀释剂可用来制备压制片。片剂和胶囊均可制成即时释放产品或缓释产品，以提供数小时持续释放药物。压制片可以包糖衣或包膜以遮蔽任何令人不快的味道及保护片剂不受大气影响，或包肠衣使其在胃肠道中选择性崩解。
为了以液体剂型口服给药，将口服药物成分与任何口服、无毒、药学上可接受的惰性载体(如乙醇、甘油、水等)混合。合适的液体剂型的例子包括在水、药学上可接受的脂肪和油、醇包括酯或其它有机溶剂中的溶液或悬浮液、乳剂、糖浆或酏剂、悬浮液、溶液和/或从非泡腾颗粒重建的悬浮液及从泡腾颗粒重建的泡腾制剂。这样的液体剂型可包括例如合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、增稠剂和熔化剂。
口服给药用的液体剂型可包含着色剂和调味剂以提高患者的接受度。一般来说，水、合适的油、盐水、含水右旋糖(葡萄糖)和相应的糖溶液和乙二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是非经胃肠道溶液的合适载体。
非经胃肠道给药用溶液较佳为包含活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂，如果需要，还有缓冲物质。抗氧化剂，诸如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸，单独或合用，是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐和EDTA钠。此外，非经胃肠道溶液可包含防腐剂，如苯扎氯铵、羟苯甲酯或羟苯丙酯、及三氯叔丁醇。合适的药物载体在Mack出版公司出版的本领域标准参考书Remington’s Pharmaceutical Sciences中有描述。
本发明的化合物也可以作为外用药给药，例如作为涂抹剂，或者可以作为栓剂给药。本发明的化合物也可以掺入消毒用品中。消毒用品可以是消毒剂、消毒用的纸巾、织物、凝胶等。本发明的化合物可以作为单一化合物施用，或者也可以作为多种化合物的组合施用。
本发明的化合物可以作用于病毒。病毒的类型可以包括包膜病毒。包膜病毒可以选自Ⅰ型包膜病毒、Ⅱ型包膜病毒和Ⅲ型包膜病毒，特别是流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒或水疱性口炎病毒。例如，病毒可以是SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HIV-1、H3N2、2009H1N1、H5N1、H7N9、IAV、HCoV-OC43、EBOV、NiV、LASV、ZIKV PRVABC59或VSV中的一种或多种。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
表1中的化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013可委托商业合成公司合成。
Figure BDA0002581063130000091
表1：化合物编号及对应的取代基
Figure BDA0002581063130000092
这些化合物也可以通过常规化学方法合成。化合物的合成及结构表征典型地，本实施例合成了如下式所示结构的化合物，其中，化合物的主结构如下式所示，化合物编号及对应的取代基列于表1中。
合成方案1：化合物3a-g的合成方案
Figure BDA0002581063130000101
试剂和条件：(i)CH3CO2NH4,EtOH，回流，2h。其中，化合物中的R基团如表1中限定。
合成方案2：上述Rhodanine衍生物2a-f的合成方案。
Figure BDA0002581063130000102
试剂和条件：(i)K2CO3，DMF，60-70℃，2-12h；(ii)(1)AcCl，MeOH，室温，24h；(2)bis(carboxymethyl)trithiocarbonate，Et3N，i-PrOH,MW,90℃,45min。其中，-O-R1如表2中限定。
合成方案3：上述Rhodanine衍生物2g的合成方案。试剂和条件：(i)bis(carboxymethyl)trithiocarbonate,Et3N,i-PrOH,MW,90℃,45min。
3a-g合成通法：
向1(1当量),2a-g(0.9-1.1当量)的30mL/mmol乙醇溶液中加入催化量的乙酸铵(0.1当量)，升温回流反应2h，有大量固体产物析出，停止加热，待反应冷却后过滤，用乙醇洗，抽干后得到产物3a-g。
3a FD007：
(Z)-2-chloro-5-(5-((4-oxo-3-(4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenethyl)-2-thioxothiaz olidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(100mg,0.4mmol)及2a(116mg,0.4mmol)得到170mg红色固体产物，收率81％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(s,1H),7.88(d,J＝8.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.8Hz,1H),7.66(s,1H),7.47(d,J＝3.6Hz,1H),7.39(d,J＝3.6Hz,1H),7.17(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(d,J＝8.4Hz,2H),4.76(s,2H),4.22(t,J＝8.0Hz,2H),3.56(s,1H),2.91(t,J＝8.0Hz,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ193.57,166.80,166.31,156.21,155.96,149.63,131.42,130.29,129.69,127.32,126.66,125.80,123.08,118.99,118.16,114.90,111.33,79.33,78.17,55.33,45.44,31.32；ESI-MS(m/z)522.03[M-H]-。
3b FD008
(Z)-2-chloro-5-(5-((4-oxo-3-(4-(2-(prop-2-yn-1-yloxy)ethoxy)phenethyl)-2-t hioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(90mg,0.36mmol)及2b(120mg,0.36mmol)得到140mg红色固体产物，收率68％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(d,J＝2.4Hz,1H),7.84(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.68(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(s,1H),7.43(d,J＝4.0Hz,1H),7.36(d,J＝4.0Hz,1H),7.13(d,J＝8.4Hz,2H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),4.21-4.16(m,4H),4.07-4.05(m,2H),3.76-3.74(m,2H),3.49-3.47(t,J＝3.0Hz,1H),2.90(t,J＝7.2Hz,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ193.59,166.47,166.32,157.15,155.98,149.71,131.72,131.69,129.74,127.65,126.12,123.03,119.11,118.15,114.48,111.49,80.22,77.41,66.72,66.70,57.61,44.50,31.30；ESI-HRMS(m/z)568.0652[M+H]+,585.0911[M+Na]+。
3c FD009
(Z)-2-chloro-5-(5-((3-(4-ethoxyphenethyl)-4-oxo-2-thioxothiazolidin-5-ylid ene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(100mg,0.4mmol)及2c(100mg,0.36mmol)得到84mg红色固体产物，收率45％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(d,J＝2.0Hz,1H),7.74(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.63(s,1H),7.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.38-7.35(m,2H),7.12(d,J＝8.7Hz,2H),6.85(d,J＝8.7Hz,2H),5.76(s,1H),4.20(t,J＝7.8Hz,2H),3.99(q,J＝13.7,6.7Hz,2H),2.89(t,J＝7.8Hz,2H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ193.58,166.32,157.25,156.88,149.44,130.74,129.69,129.31,126.98,124.95,123.20,118.62,118.24,114.40,110.88,62.86,45.49,31.29,14.66；ESI-MS(m/z)514.05[M+H]+。
3d FD010
(Z)-2-chloro-5-(5-((3-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenethyl)-4-oxo-2-thioxothi azolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(85mg,0.30mmol)及2d(100mg,0.28mmol)得到62mg红色固体产物，收率37％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.12(d,J＝2Hz,1H),7.88(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.70(d,J＝8.7Hz,2H),7.63(s,1H),7.45-7.36(m,3H),7.27-7.24(m,2H),7.15-7.13(m,3H),6.95(d,J＝8.7Hz,2H),5.08(s,2H),4.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.91(t,J＝7.6Hz,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ193.14,166.28,165.88,162.97,160.54,156.42,155.73,149.22,120.72,139.65,131.05,130.04,129.97,129.49,139.33,126.93,126.39,125.46,123.04,122.62,118.60,117.71,114.44,113.96,113.84,113.62,110.94,67.82,45.02,30.86；ESI-MS(m/z)594.05[M+H]+。
3e FD012
(Z)-2-chloro-5-(5-((3-(4-(cyclopropylmethoxy)phenethyl)-4-oxo-2-thioxothi azolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(88mg,0.35mmol)及2e(100mg,0.33mmol)得到62mg红色固体产物，收率35％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.77(br s,1H),8.20(d,J＝2.2Hz,1H),7.94(dd,J＝8.4,2.2Hz,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(s,1H),7.48(d,J＝3.6Hz,1H),7.37(d,J＝3.6Hz,1H),7.11(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,2H),4.19(t,J＝7.6Hz,2H),3.76(d,J＝7.0Hz,2H),2.89(t,J＝7.8Hz,2H),1.20-1.16(m,1H),0.56-0.52(m,2H),0.30-0.28(m,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ195.56,166.30,157.37,155.87,149.71,131.77,129.66,129.27,127.49,126.23,122.96,119.15,118.09,114.48,111.53,71.89,45.49,31.27；ESI-MS(m/z)540.07[M+H]+。
3f FD013
(Z)-2-chloro-5-(5-((4-oxo-3-(4-(thiophen-3-ylmethoxy)phenethyl)-2-thioxot hiazolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(79mg,0.32mmol)及2f(100mg,0.29mmol)得到37mg红色固体产物，收率22％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.97(s,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.65(s,1H),7.60(d,J＝8.4Hz,1H),7.55-7.52(m,2H),7.41-7.37(m,2H),7.17-7.12(m,3H),6.94(d,J＝8.8Hz,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ193.93,166.69,157.32,149.73,138.33,130.99,130.06,127.95,127.27,126.94,125.05,124.27,123.57,118.91,118.60,115.12,111.18,65.05,45.79,31.60；ESI-MS(m/z)626.04[M+H]+,579.26[M-CO2]+。
3g FD001
(Z)-2-chloro-5-(5-((4-oxo-3-phenethyl-2-thioxothiazolidin-5-ylidene)methyl)furan-2-yl)benzoic acid
通过上述3a-g合成通法，由1(1.0g,4mmol)及2g(950mg,4mmol)得到1.2g红色固体产物，收率65％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.68(br s,1H),8.21(d,J＝2.0Hz,1H),7.94-7.91(m,1H),7.75(d,J＝8.4Hz,1H),7.62(s,1H),7.47(d,J＝3.6Hz,1H),7.36(d,J＝3.6Hz,1H),7.32-7.21(m,5H),4.24(t,J＝7.6Hz,2H),2.97(t,J＝7.6Hz,2H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ193.93,166.29,166.21,155.82,149.73,137.61,135.21,133.03,132.59,132.39,131.88,131.82,128.68,128.54,127.64,127.51,126.65,126.30,122.98,119.17,118.09,111.56,45.25,32.13；ESI-MS(m/z)468.02[M-H]-。
6a-f合成通法：
向4(1当量)及碳酸钾(1.1-3当量)的5mL/mmol DMF溶液中加入5a-f(3当量)，室温或加热(60-70℃)反应2-12h用乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，经闪柱纯化[石油醚/乙酸乙酯＝0-40％]得到产物6a-f。
6a HX-11-36
3-(4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述6a-f合成通法，由4(3.5g,14.7mmol)及80％溴丙炔(2.0mL,17mmol)得到2.65g淡黄色油状物6a，收率66％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.14(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(d,J＝8.4Hz,2H),4.68(d,J＝2.8Hz,2H),4.53(br s,1H),3.55(q,J＝2.4Hz,2H),2.74(t,J＝6.4Hz,2H),2.53(t,J＝2.4Hz,1H)。
6b HX-11-42B
3-(4-(2-(prop-2-yn-1-yloxy)ethoxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述6a-f合成通法，由4(1.46g,6.15mmol)及2-(2-丙炔-1-基氧基)乙基甲磺酸酯(1.64g,9.23mmol)，得到0.8g白色油状物6b，收率41％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.11(d,J＝8.8Hz,2H),6.87(d,J＝8.4Hz,2H),4.51(brs,1H),4.28(d,J＝2.0Hz,2H),4.15-4.13(m,2H),3.91-3.89(m,2H),3.96(q,J＝6.0Hz,2H)。
6c DY-4-13
tert-butyl 4-ethoxyphenethylcarbamate
通过上述6a-f合成通法，由4(600mg，2.5mmol)及溴乙烷(0.58mL，7.5mmol)得到550mg白色固体产物6c，收率82％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.85(d,J＝8.4Hz,2H),4.51(brs,1H),4.01(q,J＝6.8Hz,2H),3.35-3.31(m,2H),2.74(t,J＝7.2Hz,2H),1.42-1.38(m,12H)。
6d DY-4-17
tert-butyl 4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenethylcarbamate
通过上述6a-f合成通法，由4(500mg，2.1mmol)及1-溴甲基-4-氟苯(0.55mL，6.3mmol)得到550mg白色固体产物6d，收率93％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.32(m,1H),7.20-7.10(m,4H),7.03-6.99(m,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,2H),5.04(s,2H),4.53(br s,1H),3.37-3.34(m,2H),2.75(d,J＝6.8Hz,2H),1.43(s,9H)。
6e DY-4-32
tert-butyl 4-(cyclopropylmethoxy)phenethylcarbamate
通过上述6a-f合成通法，由4(800mg，3.37mmol)及溴甲基环丙烷(0.4mL，4.05mmol)得到876mg白色固体产物6e，收率81％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.86-6.83(m,2H),4.51(s,1H),3.79(d,J＝7.0Hz,2H),3.36-3.33(m,2H),2.74(t,J＝6.7Hz,2H),1.43(s,9H),1.29-1.25(m,1H),0.66-0.62(m,2H),0.36-0.32(m,2H)。
6f DY-5-24
tert-butyl 4-(thiophen-3-ylmethoxy)phenethylcarbamate
通过上述6a-f合成通法，由4(606mg，2.6mmol)及溴甲基噻吩(400mg，2.3mmol)得到700mg白色固体产物6f，收率82％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.31(m,2H),7.15(dd,J＝1.2,5.0Hz,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,2H),6.91(d,J＝8.4Hz,2H),5.04(s,2H),4.52(br s,1H),3.34(m,2H),2.74(t,J＝6.7Hz,2H),1.43(s,9H)。
2a-f合成通法
冰浴下，向5a-f(1当量)的5mL/mmol MeOH中加入AcCl(3当量)，再置于常温反应24h，将反应液直接浓缩后，加入少量乙醚，静置，过滤得到胺基中间体；在微波管中，向胺基中间体的1mL/mmol的异丙醇溶液中依次加入三乙胺(1.2当量)，双(羧甲基)三硫代碳酸盐(1当量)，微波加热至90℃反应45min，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，闪柱纯化[石油醚/乙酸乙酯＝0-40％]得到产物2a-i。
2a HX-11-37
3-(4-(prop-2-yn-1-yloxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述2a-f合成通法，由5a(2.65g,9.6mmol)得到胺基中间体1.83g，收率90％；取中间体(100mg,0.47mmol)经反应得到80mg淡黄色固体产物2a，收率58％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.21(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(d,J＝8.4Hz,2H),4.68(d,J＝2.8Hz,2H),4.18-4.14(m,2H),3.94(s,2H),2.90-2.86(m,2H),2.53(t,J＝2.4Hz,1H)；2.89(t,J＝8.0Hz,2H)。
2b HX-11-45
3-(4-(2-(prop-2-yn-1-yloxy)ethoxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述2a-f合成通法，由5b(800mg,2.5mmol)得到胺基中间体610mg，收率95％；取中间体(500mg,2.0mmol)经反应得到370mg淡黄色固体产物2b，收率56％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝8.8Hz,2H),6.87(d,J＝8.8Hz,2H),4.28(d,J＝2.0Hz,2H),4.18-4.12(m,2H),3.93-3.89(m,2H),2.75(t,J＝7.2Hz,2H),2.47(t,J＝6.4Hz,1H)。
2c HXDY-4-21
3-(4-ethoxyphenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述2a-f合成通法，由5c(550mg，2.07mmol)得到胺基中间体440mg，收率95％；取中间体(300mg,1.49mmol)经反应得到180mg淡黄色固体产物2c，收率43％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.17(d,J＝8.8Hz,2H),6.84(d,J＝8.8Hz,2H),4.18-4.14(m,2H),4.04(q,J＝7.2Hz,2H),3.93(s,2H),2.89-2.85(m,2H),1.42(t,J＝7.2Hz,3H)。
2d HXDY-4-25
3-(4-((4-fluorobenzyl)oxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述2a-f合成通法，由5d(700mg，2.03mmol)得到胺基中间体565mg，收率99％；取中间体(400mg,1.42mmol)经反应得到180mg淡黄色固体产物2d，收率35％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37-7.32(m,1H),7.20-7.14(m,4H),7.03-6.99(m,1H),6.92-6.88(m,2H),5.04(s,2H),4.18-4.14(m,2H),3.92(s,2H),3.90-2.86(m,2H)。
2e HXDY-4-34B
3-(4-(cyclopropylmethoxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述2a-f合成通法，由5e(1g，3.43mmol)得到胺基中间体780mg，收率100％；取中间体(500mg,2.21mmol)经反应得到297mg淡黄色固体产物2e，收率44％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.17-7.14(m,2H),6.86-6.82(m,2H),4.17-4.13(m,2H),3.93(s,2H),3.78(d,J＝6.8Hz,2H),2.89-2.85(m,2H),1.28-1.24(m,1H),0.66-0.62(m,2H),0.36-0.32(m,2H)。
2f HXDY-5-26
3-(4-(thiophen-3-ylmethoxy)phenethyl)-2-thioxothiazolidin-4-one
通过上述2a-f合成通法，由5f(500mg，1.50mmol)得到胺基中间体363mg，收率94％；取中间体(260mg,1.10mmol)经反应得到242mg淡黄色固体产物2f，收率63％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.32(m,2H),7.18-7.14(m,3H),6.92(d,J＝8.4Hz,2H),5.05(s,2H),4.18-4.14(m,2H),3.92(s,2H),2.90(m,2H)。
2g HX-13-37
3-phenethyl-2-thioxothiazolidin-4-one
在微波管中，向苯乙胺(1.2g,10mmol)的10mL异丙醇溶液中依次加入三乙胺(2.1mL,15mmol)，双(羧甲基)三硫代碳酸盐(3.4g,15mmol)，微波加热至90℃反应45min，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，闪柱纯化[石油醚/乙酸乙酯＝0-40％]得到2.0g淡黄色固体产物2g,收率84％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32-7.22(m,5H),4.21-4.17(m,2H),3.92(s,2H),2.95-2.91(m,2H)。
实施例1：化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013对SARS-CoV-2的抑制和失活作用
本实施例中，骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号3418。pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S质粒由美国Bei资源中心提供，目录号NR-52420。
将含有SARS-CoV-2S蛋白的质粒(pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S)与骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)共转染293T细胞，48小时后收集细胞上清，3000rpm/min离心10min，所得上清分装冻存于-80℃冰箱，并于hACE2-293T靶细胞上测定SARS-CoV-2假病毒滴度。
为测定化合物的抗病毒活性，将化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013分别溶于DMSO中，用无血清培养基于96孔板中对这些化合物进行倍比稀释，加入100TCID50/孔的SARS-CoV-2假病毒，置于37℃孵育30分钟后将混合物加入2x104/孔的hACE2-293T细胞中，实验同时设置药物对照(靶向SARS-CoV S蛋白RBD区域的单抗33G4(33G4的杂交瘤细胞由纽约血液中心杜兰英博士提供，采用protein G进行抗体纯化，可参见He Y,Lu H,Siddiqui P,Zhou Y,Jiang S.Receptor-binding domain of severe acute respiratorysyndrome coronavirus spike protein contains multiple conformation-dependentepitopes that induce highly potent neutralizing antibodies.J Immunol.2005；174(8):4908-4915.)，IC50>1μg/mL)、细胞对照(仅含有细胞，不含病毒和药物)以及病毒对照(不含药物)。于37℃培养48小时后，通过萤光素酶实验检测抑制活性。图1的A图所示，化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013对SARS-CoV-2假病毒感染的hACE2-293T细胞具有不同程度的抑制作用。利用Graphpad软件计算出具体的IC50值，并将结果列于表2中。
将上述化合物分别在96孔板中用无血清培养基倍比稀释，与2x104/孔的hACE2-293T细胞在4℃孵育1小时后，弃去化合物并用PBS清洗细胞3次(同时设置保留化合物组作为对照)，加入100TCID50的SARS-CoV-2假病毒感染上述细胞，于37℃培养48小时，通过萤光素酶实验检测抑制活性。如图1的B图所示，化合物与细胞在4℃孵育后，清洗掉上清液，再用SARS-CoV-2感染细胞，导致化合物失去了对SARS-CoV-2的抑制活性。而保留化合物的组别仍具有有效的抑制活性。这说明了化合物可能不是通过作用于细胞而发挥活性。
分别将上述化合物用无血清培养基倍比稀释，并加入400TCID50/孔的SARS-CoV-2假病毒。将上述混合物置于4℃孵育1小时。加入终浓度为3％的PEG-6000，置于4℃孵育另外1小时。将上述混合物于4℃、13000rpm/min离心30min，弃去上清中的化合物。用含有10mg/mL BSA的3％PEG-6000重悬病毒，于4℃、13000r/min离心30min，弃去上清中残留的化合物。重复上一步骤两次。用无血清培养基重悬病毒，并加入用完全培养基稀释的hACE2-293T靶细胞2x104/孔。置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，48小时后通过萤光素酶实验检测抑制活性。如图1的C图所示，先将化合物与病毒在4℃孵育，通过PEG-6000沉淀病毒并弃去上清液，再用分离得到的病毒感染细胞，病毒的感染活性受到明显的抑制。这说明了用化合物预处理病毒后分离出的病毒颗粒感染性受损，即化合物通过作用于病毒颗粒发挥抗病毒活性。利用Graphpad软件计算出具体的EC50值，并将结果列于表2中。
分别将上述化合物在96孔板中用无血清培养基倍比稀释，加入到含有2x104/孔的hACE2-293T细胞中，同时设置无细胞无药物组(即DMEM组)、无药物组作为对照。在37℃孵育48小时后，按照CCK-8试剂盒的说明，检测化合物对hACE2-293T细胞的细胞毒性(图1的D图)。具体的CC50值利用Graphpad软件计算得出，并进一步计算出化合物抑制或失活SARS-CoV-2假病毒的选择指数(SI值)列于表2中，表明这些化合物在活性范围内均没有明显的细胞毒性，尤其是化合物FD012抑制SARS-CoV-2假病毒的选择指数高达410，失活SARS-CoV-2假病毒的选择指数高达307。
实施例2：化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013对SARS-CoV和MERS-CoV的抑制和失活作用
本实施例中，含有SARS-CoV S蛋白(GenBank accessionnumber:AY278488.2),或含有MERS-CoV S蛋白(GenBank accession number:AFS88936.1)的质粒pcDNA3.1-SARS-CoV-S和质粒pcDNA3.1-MERS-S由美国纽约血液中心杜兰英博士馈赠。骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)同实施例1。
SARS-CoV和MERS-CoV假病毒的包装与实施例1中类似。将pcDNA3.1-SARS-CoV-S质粒或pcDNA3.1-MERS-S质粒与pNL4-3.Luc.R-E-质粒共转染293T细胞，48小时后收集细胞上清，3000rpm/min离心10min，所得上清分装冻存于-80℃冰箱，并分别于hACE2-293T细胞和Huh-7细胞上测定SARS-CoV和MERS-CoV假病毒的滴度。
采用与实施例1类似的方法，化合物对SARS-CoV和MERS-CoV假病毒的抑制和失活作用分别在hACE2-293T细胞和Huh-7细胞上检测(表2)。Huh-7细胞用作MERS-CoV假病毒感染的靶细胞，单克隆抗体m336(由复旦大学应天雷教授提供，可参见Ying T,Du L,Ju TW,etal.Exceptionally potent neutralization of Middle East respiratory syndromecoronavirus by human monoclonal antibodies.J Virol.2014；88(14):7796-7805.)用作阳性对照，IC50＝0.006μg/mL。hACE2-293T细胞用作SARS-CoV假病毒感染的靶细胞，单克隆抗体33G4用作阳性对照，IC50＝0.03μg/mL。IC50和EC50值均由GraphPad软件计算得出，列于表2中。
采用与实施例1类似的方法检测化合物对Huh-7细胞的细胞毒性。具体的CC50值利用Graphpad软件计算得出，并进一步计算出化合物抑制或失活SARS-CoV假病毒和MERS-CoV假病毒的选择指数(SI值)列于表2中，表明这些化合物在活性范围内均没有明显的细胞毒性，尤其是化合物FD012抑制SARS-CoV假病毒的选择指数高达615，化合物FD013抑制MERS-CoV假病毒的选择指数高达618；化合物FD010和FD013失活MERS-CoV假病毒的选择指数高达均大于1000。
表2
Figure BDA0002581063130000201
在表2中显示了测定的化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013在hACE2-293T细胞或Huh-7细胞中的CC50、对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的IC50、EC50和选择指数SI。指示这些化合物对细胞的毒性(CC50)，抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒分别对hACE2-293T细胞和Huh-7细胞进行感染的活性(IC50)或化合物失活游离的SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒颗粒的活性(EC50)，通过萤光素酶实验检测；以及化合物抗SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV的选择指数。
实施例3：化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013对HIV-1的抑制和失活作用
本实施例中，HIV-1IIIB毒株和MT-2细胞由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号分别为398和237。
HIV-1IIIB(X4)在MT-2细胞上扩增并进行滴度测定，分装保存于-80℃。用无血清培养基于96孔板中分别对化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013进行倍比稀释，将病毒用无血清培养基稀释后加入上述96孔板中(相当于100TCID50的病毒量)。将每种化合物-病毒混合液置于37℃培养箱中孵育30min后加入2×104/孔的MT-2细胞中。同时设置药物对照(AMD3100，由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号8128，IC50＝0.02μM)、细胞对照(只含有细胞，不含有药物和病毒)和病毒对照(不含有药物，只含有细胞和病毒)。置于37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养后，弃去上清液，并加入新鲜完全培养基。4天后，观察细胞病变，收集上清液，并加入等量的5％的Triton-100，对上清中的病毒进行裂解。用双抗夹心ELISA检测上清中的p24抗原，判断化合物对HIV-1的抑制活性。具体如下：用Anti-HIVImmune Globulin(HIVIG)4℃过夜包被96孔ELISA板，PBST(0.05％吐温20)洗板3次，用2％的脱脂奶粉37℃封闭2小时后，加入1:10稀释的病毒裂解液于37℃孵育1小时，PBST洗板3次，加入183抗体于37℃孵育1小时，PBST洗板3次，加入HRP标记的抗鼠二抗，于37℃孵育1小时，PBST洗板3次，加入TMB底物显色，加入硫酸终止。酶标仪测定OD450 nm，GraphPad软件计算IC50(表3)。化合物在MT-2细胞上的CC50的测定同实施例1。
分别将上述化合物用无血清培养基倍比稀释，并加入400TCID50/孔的HIV-1IIIB,同时设置药物对照(AMD3100，EC50>10μM)、细胞对照(只含有细胞，不含有药物和病毒)和病毒对照(不含有药物，只含有细胞和病毒)。将上述混合物置于4℃孵育1小时。加入终浓度为3％的PEG-6000，置于4℃孵育另外1小时。将上述混合物于4℃、13000rpm/min离心30min，弃去上清中的化合物。用含有10mg/mL BSA的3％PEG-6000重悬病毒，于4℃、13000r/min离心30min，弃去上清中残留的化合物。重复上一步骤两次。用无血清培养基重悬病毒，并加入用完全培养基稀释的MT-2靶细胞2×104/孔。置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，第4天收集上清并加入等量的5％Triton-100裂解病毒。通过双抗夹心ELISA检测上清中的p24抗原测定化合物对病毒的失活活性，GraphPad软件计算EC50(表3)。
表3
Figure BDA0002581063130000221
表3是化合物抑制HIV-1对MT-2细胞感染的活性(IC50)以及化合物失活游离的HIV-1颗粒的活性(EC50)，通过ELISA测定p24抗原检测；以及对化合物抗HIV-1的选择指数(SI)的统计。
实施例4：化合物FD001对流感病毒H3N2、2009H1N1增殖的影响
本实施例中，H3N2、2009H1N1毒株由美国Bei资源中心提供，目录号分别为NR-44022和NR-13659。MDCK细胞，购自中国科学院细胞库，目录号GNO23。
H3N2、2009H1N1毒株在MDCK细胞上扩增并进行滴度测定，分装保存于-80℃。将化合物FD001在6孔板中进行倍比稀释，加入含有2μg/mL TPCK-trypsin(购自Sigma公司，货号T1426)的病毒稀释液，使最终每孔感染的病毒量在100-200PFU/mL之间，置于37℃孵育1小时。同时设置细胞对照组和病毒对照组。将上述混合物感染单层MDCK细胞，37℃、5％CO2条件下吸附2小时。吸弃上清，加入含1％低熔点琼脂糖(购自Invitrogen，货号16520050)和2％FBS的DMEM培养基，室温放置至琼脂糖凝固后，倒置于37℃、5％CO2培养箱中培养3天。待空斑形成后，加入含有1％结晶紫(美仑生物)的4％多聚甲醛固定液过夜固定并洗去孔中的琼脂糖，统计空斑形成数，计算抑制活性(图2)。
实施例5：化合物FD001、FD007-FD010、FD0012和FD013对H5N1和H7N9假病毒的抑制作用
通过RT-PCR从流感病毒A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)(由上海市金山公共卫生临床中心提供)中获得HA的基因(GenBank accession no.KC853228)和NA的基因(GenBankaccession no.KC853231)，并构建pVKD-HA和pVKD-NA质粒。包含H5N1 HA Thailand-HA(GenBank accession no.EF541411.1)的质粒、包含NA Thailand-NA(GenBank accessionno.EF541471.1)的质粒由美国纽约血液中心提供。将含有HA基因的质粒、含有NA基因的质粒与pNL4-3.Luc.R-E-质粒三者共转染293T细胞，48小时后收集细胞上清，3000rpm/min离心10min，所得上清分装冻存于-80℃冰箱，并分别于MDCK细胞上测定H5N1和H7N9假病毒的滴度。
采用与实施例1类似的方法，在MDCK细胞上检测化合物对H5N1和H7N9假病毒的抑制作用以及细胞毒性(表4)。
表4
Figure BDA0002581063130000231
实施例6：化合物FD001和FD012对HCoV-OC43、EBOV假病毒、NiV假病毒、LASV假病毒的抑制作用
本实施例中，HCoV-OC43毒株从ATCC获得，目录号为VR-1558。Zaire型EBOV，即ZEBOV(GenBank:KM034549.1)或Sudan型EBOV，即SUDV(GenBank:KC545389.1)糖蛋白(GPs)的编码序列，由金唯智生物科技有限公司优化并合成，然后将其克隆到pcDNA3.1(+)表达载体中。插入了NiV包膜蛋白G蛋白(GenBank:AAK29088.1)及F蛋白(GenBank:AAK29087.1)全基因组的真核表达质粒pcDNA3.1-NiV-G和pcDNA3.1-NiV-F；插入了LASV包膜蛋白GPC蛋白(GenBank：AAA46286.1)全基因组的真核表达质粒pcDNA3.1-LASV-GPC由杰肽生物科技有限公司合成。补充有VSV-G的VSV-△G rLuc假病毒颗粒由Professor Benhur Lee馈赠。
HCoV-OC43在HCT-8细胞上扩增并进行滴度测定。化合物FD001和FD012倍比稀释后与100TCID50的HCoV-OC43在37℃孵育30min，将混合物加入2x104/孔的HCT-8细胞中，置于37℃孵育48小时。根据CCK-8试剂盒说明书测定细胞活力以判断化合物的抑制效果。IC50值由GraphPad软件计算得出，并列于表5中。
EBOV假病毒是将上述对应的包膜蛋白质粒与骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)共转染293T细胞获得，其包装方法与实施例1类似。NiV假病毒将NiV包膜质粒pcDNA3.1-NiV-G和pcDNA3.1-NiV-F共转染293T细胞，37℃培养6h后，加入补充有VSV-G的VSV-ΔG rLuc假病毒颗粒以提供病毒骨架，继续培养2h后，弃去293T细胞上清，并用PBS洗涤细胞3次以去除上清中游离的VSV-ΔG rLuc假病毒颗粒，加入含10％FBS的DMEM培养基继续培养72h，上清中含有以VSV-ΔG rLuc为骨架带有NiV-G/F包膜蛋白的NiV假病毒，3000rpm离心10min,收集含有NiV假病毒的细胞上清，分装并储存于-80℃备用。LASV假病毒是将pcDNA3.1-LASV-GPC质粒与骨架质粒(pNL4-3.Luc.R-E-)共转染293T细胞获得，其包装方法与实施例1类似。采用与实施例1类似的方法，在Huh-7细胞上检测化合物对EBOV假病毒感染的抑制活性，在Vero细胞上检测化合物对NiV假病毒、LASV假病毒的抑制活性(表5)。IC50值由GraphPad软件计算得出，并列于表5中。
表5
Figure BDA0002581063130000251
实施例7：化合物FD001和FD012对ZIKV PRVABC59的抑制作用
本实施例中，ZIKV PRVABC59(2015/Puerto Rico)毒株由美国Bei资源中心提供，目录号为NR-50684。
ZIKV PRVABC59毒株在Vero-E6细胞上扩增并进行滴度测定，分装保存于-80℃。化合物FD001和FD012对ZIKV PRVABC59的抑制作用采用空斑减少实验测定，与实施例4类似(图3)。对于ZIKV PRVABC59毒株，FD001和FD012的IC50分别为4.36μM和0.91μM。
实施例8：化合物FD001和FD012对VSV假病毒的抑制作用
本实施例中，含有VSV-G蛋白的质粒pHEF-VSVG细胞由美国NIH艾滋病试剂和参照物项目提供，目录号4693。骨架质粒同实施例1。
VSV假病毒的包装与实施例1中类似。在Huh-7细胞上检测化合物对VSV假病毒的抑制作用(图4)。
实施例9：化合物FD001和FD012对非包膜病毒的抑制作用
本实施例中，包装HPV16假病毒所需的HPV16-L1/L2表达质粒(p16sheLL)和萤光素酶pCLucf质粒，包装HPV58假病毒所需的HPV58-L1/L2表达质粒(p58sheLL)和萤光素酶pCLucf质粒，由美国马里兰州国立癌症研究所细胞肿瘤实验室的John Schiller博士提供。采用与实施例1中类似的方法，在Hela细胞上检测化合物对HPV16、HPV58假病毒的抑制作用(图5)。与实施例7类似，采用CCK-8试剂盒在RD细胞上检测化合物对EV71的抑制效果。根据图5，FD001和FD012对非包膜病毒HPV16、HPV58和EV71无抑制作用。
结论
本发明成功设计了广谱抗包膜病毒的化合物FD001及其系列衍生物。本发明提供的该类化合物已被证明可以广谱抑制Ⅰ型包膜病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HIV-1、IAV、HCoV-OC43、EBOV、NiV和LASV)、Ⅱ型包膜病毒(ZIKV)和Ⅲ型包膜病毒(VSV)的感染，化合物的抗病毒范围应包含但不局限于以上例举的包膜病毒。该类化合物具有较高活性，并无明显的细胞毒性，例如：针对SARS-CoV-2、SARS-CoV、HIV-1感染，FD012的选择指数分别高达410、615和6806，有望有效应对新发突发病毒性传染病的感染或多病毒交叉感染。重要的是，本发明提供的该类化合物可以主动进攻游离的病毒颗粒，对不同的包膜病毒具有广谱失活活性，降低了病毒入侵细胞后对细胞正常生理功能的损伤并可能减缓现有的酶抑制剂导致的耐药问题。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (14)

1.具有式(I)的化合物或其药学可接受的盐，
Figure FDA0003794774380000011
其中R1选自卤素；
R2选自-COOH；或-COSH；
R3为-L-CH2-R’，其中L为O；R’选自氢，直链或支链C1-6烷基，C2-6炔基，-L’-C2-6炔基，其中L’选自-CH2OCH2-，-CH2SCH2-或-CH2CH2CH2-，用以下基团任选取代的C3-6环烷基，C3-6杂环基，苯基或者5元或6元杂芳基：一个或多个C1-3烷基、卤素、OH、SH、或者NH2。
2.权利要求1的化合物或其药学可接受的盐，其中R3为
Figure FDA0003794774380000012
Figure FDA0003794774380000013
3.权利要求1的化合物，所述化合物是式(II)的化合物：
Figure FDA0003794774380000014
其中R为
Figure FDA0003794774380000015
Figure FDA0003794774380000016
4.药物组合物，其包含一种或多种权利要求1-3中任一项的化合物或其药学可接受的盐和药物载体。
5.权利要求4的药物组合物，其中该药物组合物的剂型为片剂、胶囊、丸剂、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、悬浮液、糖浆、乳剂、注射剂、软膏剂、气雾剂或栓剂。
6.消毒用品，其包含一种或多种权利要求1-3中任一项的化合物或其药学可接受的盐。
7.权利要求6的消毒用品，其选自消毒液、消毒纸巾或消毒凝胶。
8.在体外失活病毒或预防病毒的方法，其包括使一种或多种权利要求1-3中任一项的化合物、权利要求4或5的药物组合物或权利要求6或7的消毒用品与物品接触的步骤，其中病毒包含包膜病毒。
9.权利要求8的方法，其中所述物品含有病毒、疑似含有病毒或有风险含有病毒。
10.权利要求8或9的方法，其中所述包膜病毒选自Ⅰ型包膜病毒、Ⅱ型包膜病毒和Ⅲ型包膜病毒。
11.权利要求10的方法，其中所述包膜病毒选自流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒或水疱性口炎病毒。
12.权利要求1-3中任一项的化合物或权利要求4或5的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于抑制病毒感染、清除或减少病毒、或者治疗或预防由病毒引起的疾病，其中病毒包含包膜病毒。
13.权利要求12的用途，其中所述包膜病毒选自Ⅰ型包膜病毒、Ⅱ型包膜病毒和Ⅲ型包膜病毒。
14.权利要求13的用途，其中所述包膜病毒选自流感病毒、冠状病毒、艾滋病病毒、埃博拉病毒、尼帕病毒、拉沙热病毒、寨卡病毒或水疱性口炎病毒。
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