CN109956975A - 肝递送恩替卡韦前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用 - Google Patents

肝递送恩替卡韦前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供基于肝脏特异性递送技术(肝递送)(Liver Specific Delivery(LSD))的抗病毒前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用，具体地，本发明提供了式I和式II化合物及其异构体、可药用盐、水合物、溶剂化物，以及相应的药物组合物。本发明还提供了本发明化合物单独或与其它抗病毒药物联合在抗病毒中的应用，特别是在治疗抗乙型肝炎病毒(HBV)中的应用。

Description

肝递送恩替卡韦前体药物核苷环磷酸酯化合物及应用
技术领域
本发明涉及基于肝脏特异性递送技术(肝递送)(Liver Specific Delivery(LSD))的抗病毒前体药物，核苷环磷酸酯化合物的制备及应用，或其光学异构体、水合物、溶剂化物、可药用盐以及药物组合物。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等病毒严重威胁人类健康。以乙型肝炎病毒为例，乙型病毒性肝炎(乙型肝炎)是一种由乙型肝炎病毒引起的，以肝脏炎性病变为主，并可引起多器官损害的疾病。据世界卫生组织(WTO)调查结果显示，估计全球有2.4亿人是慢性乙型肝炎感染者，每年估计有78万人死于乙型肝炎感染，其中65万人死于慢性乙型肝炎导致的肝硬化和肝癌，13万人死于急性乙型肝炎感染，是全球健康的一个重要问题。
抗乙型肝炎病毒的药物，主要一类是核苷酸类药物，例如：阿德福韦酯、替诺福韦酯(TDF)、替诺福韦艾拉酚胺(TAF)、恩替卡韦、拉米夫定、替比夫定等，其作用机理是在细胞内活化成三磷酸代谢物，能抑制病毒的DNA或RNA聚合酶活性，阻止DNA或RNA的合成，达到抑制病毒复制的目的。
有些核苷酸类化合物，例如：阿德福韦、替诺福韦等，在生理PH下，呈高负电性。所以口服给药，跨膜能力差，生物利用度低；同时，增加了胃肠道及肾的毒副作用。然而，进行酯化改造，形成酯类前药，比如，阿德福韦酯，替诺福韦酯等，可提高生物利用度及组织分布。但酯水解酶在体内广泛分布，造成药物还没抵达肝细胞前，多数就被水解为带负电的生物活性成分(阿德福韦、替诺福韦等)，该成分不容易进入肝细胞，而被主动转运至肾的近端小管，很容易造成肾毒性。
环状磷酸酯(4-芳基-2-氧代-1,3,2-二氧杂磷杂环己烷)前体结构有很好的肝脏特异性递送性能，机理非常明确，4-芳基取代位置被肝细胞中的细胞色素P450同功酶家族中的CYP3A特异性催化，生成羟基，然后开环生成带负电荷的磷酸中间体，该物质不易通过细胞膜而存在于细胞内，在磷酸二酯酶催化下，经过水解，β-消除反应，生成核苷单磷酸化合物，继续在核苷酸激酶作用下，生成具有生物活性的核苷酸三磷酸化合物，同时，代谢副产物芳基乙烯基酮能与肝细胞中含量丰富的抗氧化和自由基的谷胱甘肽发生1,4-加成反应而被清除，尚未发现该加成产物具有副作用的报道。
以阿德福韦为活性成分，通过芳基上取代基的改造，单取代，二取代，不同取代基等几十个组合化合物，最后发现间氯取代的芳环，Pradefovir，在CYP3A酶作用下，代谢成阿德福韦的生成速率最高，接近3,5-二氯芳基的5倍多(US200707214668 B2)。
然而，目前尚缺乏活性高、肝脏特异性递送性强、且毒副作用低的病毒抑制化合物，因此，本领域迫切需要开发具有活性高、肝脏特异性递送性强、且毒副作用低等优点的新型病毒抑制化合物。
发明内容
本发明合成了抗病毒的核苷酸类药物的环状磷酸酯，然后对其芳环取代基进一步的改造，得到一类更具有肝递送作用的前药，使其疗效更高，毒副作用更小的优点。
本发明的第一方面，提供了一种如下式I和式II所示的化合物，或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：
其中：
各R1独自选自卤素、硝基、羟基、氨基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷胺基、取代或未取代的C1-C6羧基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷酰基、取代或未取代的C2-C6烷酰胺基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、氨基、氰基；
R2、R3各自独立地为卤素(F，Cl，Br或I)；
m为0、1、2或3。
R4选自下组：氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C2-C12烷酰基、取代或未取代的-CO-O-C1-C10烷基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、-NRaRb、氰基，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、或C1-C3卤代烷基；
且式I和式II中，除已有手性外，其他各个手性中心为R型或S型；
在另一优选例中，R2为Cl，且R3为F；或R2为Cl，且R3为Br。
在另一优选例中，所述的光学异构体包括互变异构体，顺反异构体，构象异构体，内消旋化合物和具有对映或非对映关系的光学异构体。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
在另一优选例中，所述式I和式II所示的化合物的盐为式I和式II所示的化合物与无机酸或有机酸所形成的可药用盐，或所述式I和式II所示的化合物的盐为式I和式II所示的化合物与碱反应所形成的可药用盐。所述的式I和式II所示的化合物或其盐为无定形物或晶体。
本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括治疗有效量的如本发明第一方面中所述的化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；和药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。
本发明的第三方面，提供了如本发明第一方面所述的化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物的用途，用于制备治疗和/或预防与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的急性或慢性疾病的药物组合物。
本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式I化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
(i-a)在惰性溶剂中，用式Ia化合物和酸、酰氯、卤代烷基反应，形成式I化合物；
式中，各基团的定义如上文中所述。
在另一优选例中，所述的步骤(i-a)中，所述的试剂选自下组：二环己基碳二亚胺(DCC)、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或其组合；优选为DCC和三乙胺。
在另一优选例中，所述的步骤(i-a)中，所述的惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃或其组合；优选为N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷溶剂。
在另一优选例中，所述的步骤(i-a)的反应温度为-0-100℃(优选在25±5℃左右)。
在另一优选例中，所述的步骤(i-a)的去保护反应的反应时间为0.5-24小时，较佳地为0.5-8小时。
(i-b)在惰性溶剂中，用式Ib化合物脱除TBS，形成式Ia化合物；
在另一优选例中，所述的步骤(i-b)中，所述的脱TBS试剂选自下组：TBAF、冰醋酸、稀盐酸或其组合；优选为盐酸乙醇溶液和TBAF。
在另一优选例中，所述的步骤(i-b)中，所述的惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其组合；优选为四氢呋喃溶剂。
在另一优选例中，所述的步骤(i-b)的反应温度为-50-30℃(优选在25±5℃左右)。
在另一优选例中，所述的步骤(i-b)的去保护反应的反应时间为0.5-6小时，较佳地为0.5-3小时，更佳地为0.5-2小时。
本发明的第五方面，提供了一种式II化合物的制备方法，所述方法包括步骤：
(j-a)在惰性溶剂中，用式IIa化合物和酸、酰氯、卤代烷基反应，形成式II化合物；
式中，各基团的定义如上文中所述。
在另一优选例中，所述的步骤(j-a)中，所述的试剂选自下组：二环己基碳二亚胺(DCC)、三乙胺、N,N-二异丙基乙胺或其组合；优选为DCC和三乙胺。
在另一优选例中，所述的步骤(j-a)中，所述的惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃或其组合；优选为N,N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷溶剂。
在另一优选例中，所述的步骤(j-a)的反应温度为-0-100℃(优选在25±5℃左右)。
在另一优选例中，所述的步骤(j-a)的去保护反应的反应时间为0.5-24小时，较佳地为0.5-8小时。
(j-b)在惰性溶剂中，用式IIb化合物脱除TBS，形成式IIa化合物；
式中，各基团的定义如上文中所述。
在另一优选例中，所述的步骤(j-b)中，所述的脱TBS试剂选自下组：TBAF、冰醋酸、稀盐酸或其组合；优选为盐酸乙醇溶液和TBAF。
在另一优选例中，所述的步骤(j-b)中，所述的惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、或其组合；优选为四氢呋喃溶剂。
在另一优选例中，所述的步骤(j-b)的反应温度为-50-30℃(优选在25±5℃左右)。
在另一优选例中，所述的步骤(j-b)的去保护反应的反应时间为0.5-6小时，较佳地为0.5-3小时，更佳地为0.5-2小时。
在另一优选例中，所述的式Ib化合物是通过以下方法制备的：
(i-c)在惰性溶剂中，将式Ic化合物与PA3001-3进行取代反应，得到式Ib化合物；
在另一优选例中，在步骤(i-c)中，所述反应在格氏试剂存在下进行；较佳地，所述的格氏试剂选自下组：叔丁基氯化镁(t-BuMgCl)。
在另一优选例中，所述的步骤(i-c)的取代反应在-50-30℃下(优选在25±5℃左右)进行。
在另一优选例中，所述的步骤(i-c)的取代反应的反应时间为1-72小时，较佳地为3-48小时，更佳地为6-24小时。
在另一优选例中，所述的步骤(i-c)的惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、或其组合；优选为四氢呋喃溶剂。
在另一优选例中，所述的式IIb化合物是通过以下方法制备的：
(j-c)在惰性溶剂中，将式IIc化合物与PA3001-3进行取代反应，得到式IIb化合物；
在另一优选例中，在步骤(j-c)中，所述反应在格氏试剂存在下进行；较佳地，所述的格氏试剂选自下组：叔丁基氯化镁(t-BuMgCl)。
在另一优选例中，所述的步骤(j-c)的取代反应在-50-30℃下(优选在25±5℃左右)进行。
在另一优选例中，所述的步骤(j-c)的取代反应的反应时间为1-72小时，较佳地为3-48小时，更佳地为6-24小时。
在另一优选例中，所述的步骤(j-c)的惰性溶剂选自下组：N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、或其组合；优选为四氢呋喃溶剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后，单磷酸活性分子ETVMP在肝脏中浓度-时间柱状分布图(nmol/g，摩尔浓度/组织重量)。
图2显示了大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后，ETV在肝脏中浓度-时间柱状分布图(nmol/g，摩尔浓度/组织重量)。
图3显示了大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后，单磷酸活性分子ETVMP在血浆中浓度-时间柱状分布图(nmol/g，摩尔浓度/组织重量)。
图4显示了大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后，ETV在血浆中浓度-时间柱状分布图(nmol/g，摩尔浓度/组织重量)。
图5显示了大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后，单磷酸活性分子ETVMP在脑浆中浓度-时间柱状分布图(nmol/g，摩尔浓度/组织重量)。
图6显示了大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后，ETV在脑浆中浓度-时间柱状分布图(nmol/g，摩尔浓度/组织重量)。
注释：
ETV：恩替卡韦，2-氨基-9-[(1S,3S,4S)-4-羟基-3-羟甲基-2-亚甲基环戊基]-1，9-二氢-6H-嘌呤-6-酮(CAS：142217-69-4)
ETVMP：2-氨基-9-((1S,3R,4S)-4-羟基-3-(单磷酸酯亚甲基)-2-甲烯基环戊基)-3H-嘌呤-6(9H)-酮(CAS:1103994-53-1)
具体实施方式
本发明人经过长期而深入的研究，通过对大量化合物的筛选研究，首次发现：一类具有特定结构的式I和式II化合物(其中苯环部分的3位和5位为不同的卤素或者2位和5位为不同的卤素)，令人意外地具有非常优异的抗病毒活性、显著提高的肝递送性以及显著降低的毒副作用。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“C1-C6烷基”指具有1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或类似基团。
如本文所用，术语“C2-C6烷酰基”指形如“具有1～6个碳原子的直链或支链烷基-羰基”结构的取代基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基，或类似基团。
如本文所用，术语“C1-C6烷胺基”指形如“具有1～6个碳原子的直链或支链烷基-胺基”结构的取代基，如甲胺基、二甲胺基、乙胺基、丙胺基、二乙胺基，或类似基团。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。
本发明中，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、氨基、氰基。
除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。
如本文所用，术语“本发明化合物”指式I和式II所示的化合物。该术语还包括及式I和式II化合物的各种晶型形式、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
本发明中的一些化合物可能用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂化物。本发明的溶剂合物包括化学计量的溶剂化物如水合物等，也包括在用低压升华干燥法制备时形成的包含可变量水的化合物。
应理解,本发明的化合物制备后可能存在各种热力学稳定的异构体,如互变异构体、构象异构体、内消旋化合物和具有对映或非对映关系的光学异构体等,上述改变形式在阅读了本发明的公开之后,对于本领域技术人员而言是显而易见的。
式I化合物及其制备
为了提供一种能够通过肝递送机制，让抗病毒的核苷酸类药物集中在肝细胞中释放的高效、低毒的肝递送前体药物，发明人制备了式I化合物：
其中：
各R1独自选自卤素、硝基、羟基、氨基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷胺基、取代或未取代的C1-C6羧基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷酰基、取代或未取代的C2-C6烷酰胺基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、氨基、氰基；
m为0、1、2或3；
R2、R3各自独立地为卤素(F，Cl，Br或I)；
R4选自下组：氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C2-C12烷酰基、取代或未取代的-CO-O-C1-C10烷基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、-NRaRb、氰基，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、或C1-C3卤代烷基；
且式I中，除已标示的手性外，其他各个手性中心为R型或S型。
所述的化合物可以是消旋体，或为光学异构体，两者皆具有一定的抗病毒活性。优选的所述的式I化合物具有选自下组的结构：
在另一优选例中，所述的P2与磷酸酯环结构中4位的芳香基团互为顺式，且P2为R构型，C4为S型，即以下化合物
在另一优选例中，R2为Cl，且R3为F；或R2为Cl，且R3为Br。
在另一优选例中，所述的光学异构体包括互变异构体，顺反异构体，构象异构体，内消旋化合物和具有对映或非对映关系的光学异构体。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
通式I化合物的制备方法如下：
本发明还提供了制备式I化合物的方法。一种优选的方法如流程I所示。
在合适的溶剂(如四氢呋喃)中，加入PA3001-3化合物，然后在合适的温度(如-10至10℃)下，滴加格氏试剂(如叔丁基氯化镁)，反应一段时间(如30分钟)，然后一次性加入Ic化合物，反应过夜，淬灭，硅胶柱层析纯化，得中间体Ib，Ib加入脱保护剂(如盐酸乙醇溶液)，脱去保护基TBS，得中间体Ia，Ia和R4-Y化合物进行反应(如酸、酰氯、卤代烷基)反应得通式I化合物。
其中，各个反应物可以通过市售途径购得，也可以采用市售的原料，通过本领域常规的方法制备。
式II化合物及其制备
为了提供一种能够通过肝递送机制，让抗病毒的核苷酸类药物集中在肝细胞中释放的高效、低毒的肝递送前体药物，发明人制备了式II化合物：
其中：
各R1独自选自卤素、硝基、羟基、氨基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷胺基、取代或未取代的C1-C6羧基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷酰基、取代或未取代的C2-C6烷酰胺基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、氨基、氰基；
m为0、1、2或3；
R2、R3各自独立地为卤素(F，Cl，Br或I)；
R4选自下组：氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C2-C12烷酰基、取代或未取代的-CO-O-C1-C10烷基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、-NRaRb、氰基，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、或C1-C3卤代烷基；
且式II中，除已标示的手性外，其他各个手性中心为R型或S型。
所述的化合物可以是消旋体，或为光学异构体，两者皆具有一定的抗病毒活性。优选的所述的式II化合物具有选自下组的结构：
在另一优选例中，所述的P2与磷酸酯环结构中4位的芳香基团互为顺式，且P2为R构型，C4为S型，即以下化合物：
在另一优选例中，R2为Cl，且R3为F；或R2为Cl，且R3为Br。
在另一优选例中，所述的光学异构体包括互变异构体，顺反异构体，构象异构体，内消旋化合物和具有对映或非对映关系的光学异构体。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
通式II化合物的制备方法如下：
本发明还提供了制备式II化合物的方法。一种优选的方法如流程II所示。
在合适的溶剂(如四氢呋喃)中，加入PA3001-3化合物，然后在合适的温度(如-10至10℃)下，滴加格氏试剂(如叔丁基氯化镁)，反应一段时间(如30分钟)，然后一次性加入IIc化合物，反应过夜，淬灭，硅胶柱层析纯化，得中间体IIb，IIb加入脱保护剂(如盐酸乙醇溶液)，脱去保护基TBS，得中间体IIa，IIa和R4-Y化合物进行反应(如酸、酰氯、卤代烷基)反应得通式II化合物。
其中，各个反应物可以通过市售途径购得，也可以采用市售的原料，通过本领域常规的方法制备。
药物组合物和施用方法
由于本发明化合物具有优异的对乙型肝炎病毒的抑制活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由乙型肝炎病毒所导致的疾病。根据现有技术，本发明化合物可用于治疗以下疾病：HBV、HCV、HIV和HCMV等感染而引起的疾病。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.1-1000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有0.5～500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。特别优选的施用方式是口服。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.2～1000mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
(1)肝递送性高，化合物只能在肝细胞中的细胞色素P450同功酶家族中的CYP3A特异性催化，生成活性分子，该活性分子带高负电荷，不容易排出肝外，所以在肝中浓度更高，达到肝递送效果。
(2)活性高，因为肝递送性，所以更多的药物存在肝中，抗病毒活性也能大大的提高。
(3)毒副作用低：同等剂量的前药，在肝外代谢成活性分子的量很少，所以对肾脏、脑等主要脏器的毒性大大降低。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1PA3001(对比例)
合成路线：
实验部分：
步骤1)化合物PA3001-2的合成：
化合物恩替卡韦一水合物PA3001-1(5.32g,18mmol)和咪唑(8.0g,117.6mmol)溶于DMF(40ml)中，在冰浴下慢慢加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl,13.3g,88mmol),氮气保护下，反应室温搅拌过夜,反应结束后，缓慢加入水中(400mL)，搅拌15分钟，用乙酸乙酯(3×150mL)萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，硅胶层析柱分离纯化(洗脱剂:PE:EA(V:V)＝1:3)得PA3001-2(8.2g)，收率90％。
步骤2)化合物PA3001-3的合成：
化合物PA3001-2(2.5g,4.9mmol)溶于0.5％的盐酸乙醇溶液(50ml)中，室温搅拌0.5小时,迅速用饱合NaHCO3溶液中和至pH＝9，旋蒸去除乙醇，硅胶层析柱分离纯化(洗脱剂:PE:EA:CH3OH(V:V)＝30:150:4.5)得白色固体化合物PA3001-3(1.5g)，收率78％。
步骤3)化合物PA3001-5的合成：
化合物PA3001-3(484mg,1.24mmol)溶于无水四氢呋喃中，冰浴下，缓慢滴加1M的叔丁基氯化镁溶液(4.9mL,4.9mmol)，搅拌1小时，加入PA3001-4(633mg,1.71mmol)，室温搅拌过夜。加入20mL饱和氯化铵淬灭，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，硅胶柱层析柱分离纯化(DCM:MeOH(V:V)＝20:1)得PA3001-5(538g)，收率70％。
步骤4)化合物PA3001的合成：
化合物PA3001-5(270mg,0.43mmol)加入2％的盐酸乙醇溶液(10mL)中，室温搅拌2小时。反应结束以后，用饱和NaHCO3溶液中和至pH值为中性,旋蒸去除乙醇后用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，通过Combiflash色谱柱纯化，得浅白色固体PA3001(155mg)，收率70％。
实施例2PA3002
合成路线：
步骤1)化合物PA3002-2的合成：
化合物PA3001-3(561mg,1.4mmol)溶于四氢呋喃(30ml)中，冰浴下，缓慢滴加1M的叔丁基氯化镁溶液(5.6mL,5.6mmol,4.0eq),滴加完毕，反应液在室温下搅拌1小时,再冷却到0℃，加入PA3002-1(833mg,2.1mmol)，然后反应液在室温下搅拌过夜，用饱和氯化铵水溶液(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，硅胶层析柱分离纯化(洗脱剂:DCM:MeOH(V:V)＝20:1)得白色固体PA3002-2(600mg)，收率65％。
步骤2)目标化合物PA3002的合成：
化合物PA3002-2(310mg,0.48mmol)溶于3.6％的盐酸乙醇溶液(15ml)中，室温下搅拌反应2小时。反应结束以后，用饱和NaHCO3溶液中和至pH值为中性,旋蒸去除乙醇后用乙酸乙酯(2×60mL)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，通过Combiflash色谱柱纯化，得浅白色固体PA3002(170mg)，收率66％。
实施例3PA3003
合成路线：
实验部分：
步骤1)化合物PA3003-2的合成：
化合物PA3001-3(900mg,2.3mmol)溶于四氢呋喃(50ml)中，冰浴下，缓慢滴加1M的叔丁基氯化镁溶液(4.6mL,4.6mmol),滴加完毕，反应液在室温下搅拌1小时,再冷却到0℃，加入PA3003-1(1.17g,3.5mmol)，然后反应液在室温下搅拌过夜，用饱和氯化铵水溶液(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(3×150mL)萃取，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，硅胶层析柱分离纯化(洗脱剂:DCM:MeOH(V:V)＝10:1)得白色固体PA3003-2(700mg)，收率64％。
步骤2)目标化合物PA3003的合成：
化合物PA3003-2(600mg,1.02mmol)溶于3.6％的盐酸乙醇溶液(15ml)中，室温下搅拌反应2小时。反应结束以后，用饱和NaHCO3溶液中和至pH值为中性,旋蒸去除乙醇后用乙酸乙酯(2×100mL)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，通过Combiflash色谱柱纯化，得浅白色固体PA3003(200mg)，收率41％。
实施例4PA3004
合成路线：
实验部分：
步骤1)化合物PA3004-2的合成：
化合物PA3001-3(677mg,1.73mmol)溶于四氢呋喃(40ml)中，冰浴下，缓慢滴加1M的叔丁基氯化镁溶液(6.6mL,6.6mmol),滴加完毕，反应液在室温下搅拌1小时,再冷却到0℃，加入PA3004-1(970mg,2.5mmol)，然后反应液在室温下搅拌过夜，用饱和氯化铵水溶液(30mL)淬灭反应，乙酸乙酯(3×150mL)萃取，无水Na2SO4干燥，过滤，旋干，硅胶层析柱分离纯化(洗脱剂:DCM:MeOH(V:V)＝20:1)得白色固体PA3004-2(580mg)，收率53％。
步骤2)目标化合物PA3004的合成：
化合物PA3004-2(580mg,0.91mmol)溶于3.6％的盐酸乙醇溶液(15ml)中，室温下搅拌反应2小时。反应结束以后，用饱和NaHCO3溶液中和至pH值为中性,旋蒸去除乙醇后用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，通过Combiflash色谱柱纯化，得浅白色固体PA3004(250mg)，收率52％。
表1各个实施例中所制备得到的化合物如下表中所示
表2各个实施例中所制备得到的化合物核磁如下表中所示
实施例5体外人肝微粒体代谢的评价
测定方法：
1)试剂来源
人肝微粒体(HLM，Human Liver Microsomes)购自IVT(In Vitro Technologies)，批号SSP X008070。大鼠肝微粒体(RLM，Rat Liver Microsomes)购自BD，批号16298，和小鼠肝微粒体(MLM，Mice Liver Microsomes)购自瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司，批号BQNI。
测试化合物PA3001、PA3002、PA3003、PA3004，溶解于甲醇(国药试剂)，制成浓度为25mM的存储液。
2)反应过程
酶促反应在100mM KH2PO4缓冲溶液(pH 7.4)中进行，测试化合物浓度为25uM，人肝微粒体浓度为2mg/ml，NADPH浓度为2mM。反应由最后加入的NADPH启动，在恒温震荡水浴锅内反应5min后，立即加入1.5倍体积的甲醇以终止反应。
3)样品处理和分析方法
I样品前处理：
用Eppendorf台式离心机以最大转速13,600rpm离心20分钟。取上清液，用氮吹仪吹干之后重新溶解至流动相A(0.1％甲酸v/v的水溶液)。
II液相梯度：
时间(分钟) 流动相A(0.1％FA in H2O) 流动相B(乙腈)
0 99 1
1.1 90 10
1.5 20 80
2.5 99 1
分析柱：Waters,Acquity UPLC HSS T3column
流速：0.5ml/min
柱温：40摄氏度
III质谱条件
离子源：电喷雾电离源
离子模式：正离子模式
毛细管电压：3.0kV
温度：500℃
去溶剂气流速度：100L/h
扫描时间：0.025s
锥孔电压：40V
碰撞能量：18eV
Q1(m/z)：358
Q3(m/z)：152
表3体外肝微粒体代谢化合物释放单磷酸产物ETVMP的速率
注释：S构型顺式：如无特殊表述，指磷酸酯环结构中C4为S构型，P2与其4位的芳香基团互为顺式，N.A＝Not Available
结果分析：在体外，化合物PA3001、PA3003和PA3004均被人、大鼠、小鼠肝微粒体活化成单磷酸代谢产物ETVMP，PA3002和PA3004被人肝微粒体活化成单磷酸代谢产物ETVMP的效率显著大于对照化合物PA3001，不同化合物的转化速率存在显著差异(表3)，其中PA3004在所有物种中的转化速率都是最高的。
实施例6化合物组织分布实验
6.1方法：
6.1.1动物实验
雄性SD大鼠，体重180～300g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。雄性动物适应环境3天以上，实验前一天晚上禁食12小时，不禁水。制备PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦的溶液剂(Cremophor EL：乙醇：生理盐水＝10：10：80，V/V/V)。给药前查看动物体重是否与实验要求相符，选取12只大鼠进行分组，每组2只大鼠，灌胃给予0.036mmol/kg的药液。分别于0.5h、1h、3h、6h、12h和24h，用二氧化碳气体将大鼠安乐死后采集样品。
6.1.2.单磷酸和去磷酸代谢产物分别为ETVMP和ETV在生物样品中含量测定
样品前处理
通过心脏抽取血液，贮存于肝素抗凝管中，4℃下以6000rpm离心5min，取上清血浆立即加入5倍体积的10％三氯乙酸沉淀剂(含内标PMPA，浓度为100ng/mL)，获得血浆样品液；冰上称取适量大鼠的肝脏和脑浆样品于匀浆管中，如上立即加入5倍体积的10％三氯乙酸沉淀剂，每个匀浆管中加入2颗陶瓷珠进行匀浆，获得组织匀浆液样品。
取生物样品100μL，置1.5mL试管中，离心5min。取20μL上清液，加入180μL水，混匀，进行LC-MS/MS分析。
色谱条件
LC-MS/MS-AJ(Triple Quad 5500,AB SCIEX)用于样品的分析。色谱柱：AcquityUPLC HSS T3(2.1×50mm，1.8μm)；柱温：40℃；流速：0.5mL/min。流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：乙腈溶液。样品分离采用梯度洗脱，程序如表4。
表4ETVMP和ETV液相洗脱梯度条件
质谱条件
离子源为电喷雾电离源(Turbo Ionspray)；正离子模式；毛细管电压为3.0kV；温度为500℃；去溶剂气流1000L/h；扫描时间、锥孔电压、碰撞能量及用于定量分析的离子反应见下表5：
表5ETVMP和ETV质谱条件
注：ETVMP样品室温稳定性不太好，需在冰上操作，且立即加入沉淀剂。
6.1.3.数据分析
各化合物的代谢产物在肝脏中的浓度对应时间做成柱状分布图。ETVMP和ETV的组织浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)，使用WinNonLin6.2.1(Pharsight,CA)的非房室模型中的对数-线性梯形法进行拟合计算。
6.2实验结果
PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦释放ETVMP和ETV的结果汇总于表6。
表6大鼠灌胃给予0.036mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韦后24小时以内，单磷酸代谢产物ETVMP和无磷酸代谢产物ETV在肝脏和脑浆和血浆中的暴露量(h·nmol/g，浓度/组织重量)
N.D.＝Not detectable,未检出(代表在相应器官或组织中的暴露量低于5nmol/g或5nmol/mL)
6.2.1肝脏中代谢产物组织分布(病灶组织)
SD大鼠灌胃口服给予0.036mmol/kg试药后，肝脏组织分布的结果显示，PA3001、PA3002、PA3003和PA3004代谢释放的抑制乙肝病毒的聚合酶的活性分子ETVMP略低于或者与对应时间点的ETV持平(图1)，而PA3001、PA3002、PA3003和PA3004在肝脏中的代谢产物ETV远远低于ETV(图2)，表明前药代谢生成的ETVMP不容易逆转代谢为ETV，为前药药效的发挥提供了保证。用WinNonLin6.2.1拟合药时曲线下面积，进一步得到PA3001、PA3002、PA3003和PA3004释放ETVMP肝脏暴露量分别为ETV的97.6％、48.8％、113.9％和69.9％(表6)。这些结果表明在同等剂量下与ETV比较，肝递送基团的修饰维持了活性分子ETVMP在肝脏中的分布，根据量效关系的原则，预示着同等或者略高剂量的PA30xx系列化合物可以达到ETV在临床上的同等疗效。考虑PA30xx系列化合物在肝脏中的CYP3A4酶切释放作用明显，而ETV的单磷酸转化为其限速步骤；导致PA30XX系列化合物在肝脏中ETVMP不能显著高于ETV的原因，可能是PA30XX(而非ETV)为小肠上皮细胞高表达的多药耐药性P-糖蛋白的底物导致PA30XX在低给药浓度下的口服生物利用度低于ETV，抵消了PA30XX的肝靶向释放优势。但预计在提高口服给药剂量时，PA30XX将饱和P-糖蛋白，令PA30XX系列化合物在肝脏中释放的ETVMP明显高于ETV。
6.2.2血液和脑浆中代谢产物组织分布(正常组织)
SD大鼠灌胃口服给予0.036mmol/kg试药后，正常组织血液和脑浆的分布结果显示，PA3001、PA3002、PA3003和PA3004代谢释放的ETVMP和ETV都远低于对应时间点的ETV(图3、图4、图5和图6)。ETV在脑浆中代谢释放的，ETVMP和ETV为治疗活性分子，也是导致脑部神经毒性的活性分子(3.5和6.7h·nmol/g)；在已建立的LC-MS/MS检测方法的定量下限以上，在PA3002和PA3004的脑样品中无法被检测出这些活性分子(表6)。在血液中，PA3002和PA3004释放的ETVMP分别为ETV的5.4％和16.4％；释放的ETV分别为ETV的0.8％和2.3％，同时，也低于对照药PA3001。
肝ETVMP与血ETV的比例可以看出，PA3002和PA3004的肝递送性(32.40、和15.47)显著大于PA3001(12.46)。这些结果表明：在同等剂量下与ETV比较，肝递送基团的修饰显著降低了活性分子ETVMP和ETV在血、脑中的分布，因此具有更高的安全性和更广的用药窗口。根据量效关系的原则，预示着在提高剂量达到或者增加肝脏中ETVMP暴露量以提高药效的前体下，PA3002和PA3004将会大大改善临床上ETV导致的常见不良反应，包括头痛、疲劳、眩晕、恶心。
综上，由于本发明式I和式II化合物具有更高的活性和更高的肝递送组织特异性，因此治疗时所需的用量更低，具有更高的安全性和更低的毒副作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种如下式I和式II所示的化合物，或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物：
其中：
各个R1各自独立地选自卤素、硝基、羟基、氨基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷胺基、-COOH、取代或未取代的C2-C6羧基、取代或未取代的C2-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷酰基、取代或未取代的C2-C6烷酰胺基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、氨基、氰基；
R2、R3各自独立地为卤素(F，Cl，Br或I)；
R4选自下组：氢、取代或未取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的C2-C12烷酰基、取代或未取代的-CO-O-C1-C10烷基；其中，所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、硝基、羟基、-NRaRb、氰基，其中Ra和Rb各自独立地为H、C1-C3烷基、C3-C6环烷基、或C1-C3卤代烷基；
m为0、1、2或3。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的化合物选自下组：
3.如权利要求1-2所述的化合物，或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其特征在于，R2为Cl，且R3为F；或R2为Cl，且R3为Br。
4.如权利要求1-3任一所述的化合物，或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其特征在于，所述的化合物选自下组：
5.如权利要求1-3任一所述的化合物，或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，其特征在于，所述式I和式II所示的化合物的盐为式I和式II所示的化合物与无机酸或有机酸所形成的可药用盐，或所述式I和式II所示的化合物的盐为式I和式II所示的化合物与碱反应所形成的可药用盐。所述的式I和式II所示的化合物或其盐为无定形物或晶体。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括治疗有效量的如权利要求1-5任一项中所述的化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；和药学上可接受的辅助剂、稀释剂或载体。
7.如权利要求1-5任一所述的化合物或其光学异构体、药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物的用途，其特征在于，用于制备治疗和/或预防与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关的急性或慢性疾病的药物组合物。
8.如权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(i-a)在惰性溶剂中，用式Ia化合物和R4-Y化合物进行反应，其中，Y为-OOH、OCl、Cl或Br，形成式I化合物；
式中，各基团的定义如权利要求1中所述；
优选地，所述的式Ia化合物是通过以下方法制备的：
(i-b)在惰性溶剂中，用式Ib化合物脱除TBS，形成式Ia化合物；
式中，各基团的定义如权利要求1中所述；
优选地，所述的式Ib化合物是通过以下方法制备的：
(i-c)在惰性溶剂中，将式Ic化合物与PA3001-3进行取代反应，得到式Ib化合物。
9.如权利要求1所述的式II化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(j-a)在惰性溶剂中，用式IIa化合物和R4-Y化合物进行反应，其中，Y为-OOH、OCl、Cl或Br，形成式II化合物；
式中，各基团的定义如权利要求1中所述；
优选地，所述的式IIa化合物是通过以下方法制备的：
(j-b)在惰性溶剂中，用式IIb化合物脱除TBS，形成式IIa化合物；
式中，各基团的定义如权利要求1中所述；
优选地，所述的式IIb化合物是通过以下方法制备的：
(j-c)在惰性溶剂中，将式IIc化合物与PA3001-3进行取代反应，得到式IIb化合物。
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