TWI749281B - 肝遞送恩替卡韋前體藥物核苷環磷酸酯化合物及應用 - Google Patents

肝遞送恩替卡韋前體藥物核苷環磷酸酯化合物及應用 Download PDF

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Abstract

本發明提供基於肝臟特異性遞送技術(肝遞送)(Liver Specific Delivery(LSD))的恩替卡韋抗病毒前體藥物核苷環磷酸酯化合物及應用。具體地，本發明提供了式I化合物及其異構體、可藥用鹽、水合物、溶劑化物，以及相應的藥物組合物。本發明還提供了本發明化合物單獨或與其它抗病毒藥物聯合在抗病毒中的應用，特別是在抗乙型肝炎病毒(HBV)中的應用。

Description

肝遞送恩替卡韋前體藥物核苷環磷酸酯化合物及應用
本發明涉及基於肝臟特異性遞送技術(肝遞送)(Liver Specific Delivery (LSD))的抗病毒前體藥物，核苷環磷酸酯化合物的製備及應用，或其光學異構體、水合物、溶劑化物、可藥用鹽以及藥物組合物。
乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等病毒嚴重威脅人類健康。以乙型肝炎病毒為例，乙型病毒性肝炎(乙型肝炎)是一種由乙型肝炎病毒引起的，以肝臟炎性病變為主，並可引起多器官損害的疾病。據世界衛生組織(WTO)調查結果顯示，估計全球有2.4億人是慢性乙型肝炎感染者，每年估計有78萬人死於乙型肝炎感染，其中65萬人死於慢性乙型肝炎導致的肝硬化和肝癌，13萬人死於急性乙型肝炎感染，是全球健康的一個重要問題。
抗乙型肝炎病毒的藥物，最主要的一類是核苷酸類藥物，例如：阿德福韋酯、替諾福韋酯(TDF)、替諾福韋艾拉酚胺(TAF)、恩替卡韋、拉米夫定、替比夫定等，其作用機理是在細胞內活化成三磷酸代謝物，抑制病毒的DNA聚合酶的活性，阻止病毒DNA 的合成，從而抑制病毒複製。
抗乙型肝炎病毒的核苷類化合物包括帶單磷酸的核苷酸類似物和不帶單磷酸的核苷類似物。核苷酸類似物如阿德福韋和替諾福韋等，一般以磷酸酯的形式成藥，如阿德福韋酯和替諾福韋酯，其在體內可直接代謝為單磷酸產物。核苷類似物如恩替卡韋等，直接以核苷類似物成藥，其在體內需要經過一步磷酸化轉化為單磷酸代謝物，且該磷酸化過程為其轉化為最終活性形式三磷酸代謝物的限速步驟，造成在肝臟中有效活性成分偏低。目前，沒有恩替卡韋單磷酸酯前體藥物開發上市。
恩替卡韋體外抗病毒活性極強（EC50 =0.004 μM），是現有核苷類藥物中活性最強的化合物，其對拉米夫定耐藥的病毒株也有很強的抑制活性（EC50 =0.010-0.059 μM）。恩替卡韋能抑制HBV多聚酶（Polymerase）所有三種活性：1）HBV多聚酶的起始和啟動；2）前基因組RNA的逆轉錄合成rcDNA（鬆弛的環狀雙鏈DNA）的負鏈；3）rcDNA正鏈的合成。另外，恩替卡韋耐藥的發生率極低，6年耐藥發生率為1.2%。可見恩替卡韋在已上市的核苷類藥物中具有抗病毒活性強、耐藥屏障高的優點。
然而，臨床發現恩替卡韋可導致頭痛、疲勞、眩暈、噁心等副作用，這些副作用限制了其在臨床上的使用劑量。例如，博路定（恩替卡韋的商品名）1 mg規格僅建議適用於拉米夫定耐藥的患者，而非耐藥病人建議使用的劑量是0.5 mg。
本發明利用肝臟特異性遞送技術，繞過了激酶磷酸化步驟，並且成功提高了肝中活性成分的濃度。
環狀磷酸酯修飾的恩替卡韋前藥，在肝中經過CYP3A酶代謝，不需要磷酸激酶，生成單磷酸化合物。具體而言，環狀磷酸酯(4-芳基-2-氧代-1,3,2-二氧雜磷雜環己烷)前體結構有很好的肝臟特異性遞送性能，機理非常明確，4-芳基取代位置被肝細胞中的細胞色素P450同功酶家族中的CYP3A特異性催化，生成羥基，然後開環生成帶負電荷的磷酸中間體，該物質不易通過細胞膜而存在於細胞內，在磷酸二酯酶催化下，經過水解，β-消除反應，生成核苷單磷酸類似物，繼續在核苷酸激酶作用下，生成具有生物活性的核苷酸三磷酸類似物，同時，代謝副產物芳基乙烯基酮能與肝細胞中含量豐富的抗氧化和自由基的谷胱甘肽發生1,4-加成反應而被清除，尚未發現該加成產物具有副作用的報道。
目前，尚無活性高、肝臟遞送特異性強、且毒副作用低的恩替卡韋單磷酸酯前體藥物應用於臨床。因此，本發明所述技術領域迫切需要開發具有活性高、肝臟遞送特異性強、且毒副作用低等優點的新型恩替卡韋前體藥物。
有鑑於此，吾等發明人乃潛心進一步研究，並著手進行研發及改良，期以一較佳設作以解決上述問題，且在經過不斷試驗及修改後而有本發明之問世。
本發明合成了抗病毒的恩替卡韋單磷酸的環狀磷酸酯，然後對其芳環取代基進一步的改造，得到一類更具有肝遞送作用的前藥，使其療效更高，毒副作用更小。
本發明的第一方面，提供了一種如下式I和式II所示的化合物，或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物：
Figure 02_image003
I
其中：
各R1 獨自選自鹵素、硝基、羥基、氨基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8環烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷胺基、取代或未取代的C1-C6羧基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷醯基、取代或未取代的C2-C6烷醯胺基；其中，所述的取代指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基、硝基、羥基、氨基、氰基；
R2 、R3 各自獨立地為鹵素(F或Cl)；
m為0、1、2或3。
R4 獨自選自氫、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8環烷基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷醯基；其中，所述的取代指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基、硝基、羥基、氨基、氰基；
且式I和式II中，除已有手性外，其他各個手性中心為R型或S型；
在另一優選例中，R2 為Cl，且R3 為F；R2 為Cl，且R3 為Cl；或R2 為F，且R3 為Cl。
在另一優選例中，所述的光學異構體包括互變異構體，順反異構體，構象異構體，內消旋化合物和具有對映或非對映關係的光學異構體。
在另一優選例中，所述的化合物選自下組：
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
Figure 02_image011
在另一優選例中，所述式I和式II所示的化合物的鹽為式I和式II所示的化合物與無機酸或有機酸所形成的可藥用鹽，或所述式I和式II所示的化合物的鹽為式I和式II所示的化合物與碱反應所形成的可藥用鹽。所述的式I和式II所示的化合物或其鹽為無定形物或晶體。
本發明的第二方面，提供了一種藥物組合物，所述的藥物組合物包括治療有效量的如本發明第一方面中所述的化合物或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物；和藥學上可接受的輔助劑、稀釋劑或載體。
本發明的第三方面，提供了如本發明第一方面所述的化合物或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物的用途，用於製備治療和/或預防與乙型肝炎病毒(HBV)感染相關的急性或慢性疾病的藥物組合物。
本發明的第四方面，提供了一種如本發明第一方面所述的式I化合物的製備方法，所述方法包括步驟：
Figure 02_image013
II　　　　　　　　　　　　　　　　　　I
(i-a)在惰性溶劑中，用式II化合物和酸、醯氯、鹵代烷基反應，形成式I化合物；
式中，各基團的定義如上文中所述。
在另一優選例中，所述的步驟(i-a)中，所述的試劑選自下組：二環己基碳二亞胺(DCC)、三乙胺、N,N-二異丙基乙胺或其組合；優選為DCC和三乙胺。
在另一優選例中，所述的步驟(i-a)中，所述的惰性溶劑選自下組：N,N-二甲基甲醯胺、二氯甲烷、四氫呋喃或其組合；優選為N,N-二甲基甲醯胺和二氯甲烷溶劑。
在另一優選例中，所述的步驟(i-a)的反應溫度為-0-100℃(優選在25±5℃左右)。
在另一優選例中，所述的步驟(i-a)的去保護反應的反應時間為0.5-24小時，較佳地為0.5-8小時。
Figure 02_image015
IIa　　　　　　　　　　　　　　　　　II
(i-b)在惰性溶劑中，用式IIa化合物脫除TBS，形成式II化合物；
在另一優選例中，所述的步驟(i-b)中，所述的脫TBS試劑選自下組：TBAF、冰醋酸、稀鹽酸或其組合；優選為鹽酸乙醇溶液和TBAF。
在另一優選例中，所述的步驟(i-b)中，所述的惰性溶劑選自下組：N,N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃或其組合；優選為四氫呋喃溶劑。
在另一優選例中，所述的步驟(i-b)的反應溫度為-50-30℃(優選在25±5℃左右)。
在另一優選例中，所述的步驟(i-b)的去保護反應的反應時間為0.5-6小時，較佳地為0.5-3小時，更佳地為0.5-2小時。
在另一優選例中，所述的式IIa化合物是通過以下方法製備的：
Figure 02_image017
Ic　　　　　　　　　　　　　　　　　　　IIa
(i-c)在惰性溶劑中，將式Ic化合物與PA3001-3進行取代反應，得到式IIa化合物；
在另一優選例中，在步驟(i-c)中，所述反應在格氏試劑存在下進行；較佳地，所述的格氏試劑選自下組：叔丁基氯化鎂(t-BuMgCl)。
在另一優選例中，所述的步驟(i-c)的取代反應在-50-30℃下(優選在25±5℃左右)進行。
在另一優選例中，所述的步驟(i-c)的取代反應的反應時間為1-72小時，較佳地為3-48小時，更佳地為6-24小時。
在另一優選例中，所述的步驟(i-c)的惰性溶劑選自下組：N,N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、或其組合；優選為四氫呋喃溶劑。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
關於吾等發明人之技術手段，茲舉數種較佳實施例配合圖式於下文進行詳細說明，俾供 鈞上深入瞭解並認同本發明。
本發明人經過長期而深入的研究，通過對大量化合物的篩選研究，首次發現：一類具有特定結構的式I和式II化合物(其中苯環部分的2位和5位為特定的鹵素)，令人意外地具有非常優異的抗病毒活性、顯著提高的肝遞送性以及顯著降低的毒副作用。基於上述發現，發明人完成了本發明。
術語
如本文所用，術語“C1-C6烷基”指具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基，或類似基團。
如本文所用，術語“C2-C6烷醯基”指形如“具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基-羰基”結構的取代基，如乙醯基、丙醯基、丁醯基，或類似基團。
如本文所用，術語“C1-C6烷胺基”指形如“具有1～6個碳原子的直鏈或支鏈烷基-胺基”結構的取代基，如甲胺基、二甲胺基、乙胺基、丙胺基、二乙胺基，或類似基團。
術語“鹵素”指F、Cl、Br和I。
本發明中，術語“含有”、“包含”或“包括”表示各種成分可一起應用於本發明的混合物或組合物中。因此，術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”中。
本發明中，術語“藥學上可接受的”成分是指適用於人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激和變態反應)，即有合理的效益/風險比的物質。
本發明中，術語“有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。對於某一對象的精確有效量取決於該對象的體型和健康狀況、病症的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對於某給定的狀況而言，可以用常規實驗來確定該有效量，臨床醫師是能夠判斷出來的。
在本文中，除特別說明之處，術語“取代”指基團上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代：鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基、硝基、羥基、氨基、氰基。
除非特別說明，本發明中，所有出現的化合物均意在包括所有可能的光學異構體，如單一手性的化合物，或各種不同手性化合物的混合物(即外消旋體)。本發明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任選地為R構型或S構型，或R構型和S構型的混合物。
如本文所用，術語“本發明化合物”指式I和式II所示的化合物。該術語還包括及式I和式II化合物的各種晶型形式、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。
如本文所用，術語“藥學上可接受的鹽”指本發明化合物與酸或碱所形成的適合用作藥物的鹽。藥學上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。一類優選的鹽是本發明化合物與酸形成的鹽。適合形成鹽的酸包括但並不限於：鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有機酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
本發明中的一些化合物可能用水或各種有機溶劑結晶或重結晶，在這種情況下，可能形成各種溶劑化物。本發明的溶劑合物包括化學計量的溶劑化物如水合物等，也包括在用低壓升華乾燥法製備時形成的包含可變量水的化合物。
應理解，本發明的化合物製備後可能存在各種熱力學穩定的異構體，如互變異構體、構象異構體、內消旋化合物和具有對映或非對映關係的光學異構體等，上述改變形式在閱讀了本發明的公開之後，對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言是顯而易見的。
式 I 化合物及其製備
為了提供一種能夠通過肝遞送機制，讓抗病毒的核苷酸類藥物集中在肝細胞中釋放的高效、低毒的肝遞送前體藥物，發明人製備了式I化合物：
Figure 02_image019
I
其中：
各R1 獨自選自鹵素、硝基、羥基、氨基、氰基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8環烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C1-C6烷胺基、取代或未取代的C1-C6羧基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷醯基、取代或未取代的C2-C6烷醯胺基；其中，所述的取代指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基、硝基、羥基、氨基、氰基；
m為0、1、2或3；
R2 、R3 各自獨立地為鹵素(F或Cl)；
R4 獨自選自氫、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8環烷基、取代或未取代的C1-C6酯基、取代或未取代的C2-C6烷醯基；其中，所述的取代指具有一個或多個選自下組的取代基：鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基、硝基、羥基、氨基、氰基；
且式I中，除已有手性外，其他各個手性中心為R型或S型。
所述的化合物可以是消旋體，或為光學異構體，兩者皆具有一定的抗病毒活性。優選的所述的式I化合物具有選自下組的結構：
Figure 02_image021
在另一優選例中，所述的P2與磷酸酯環結構中4位的芳香基團互為順式，且P2為R構型，C4為S型。
在另一優選例中，R2 為Cl，且R3 為F；R2 為Cl，且R3 為Cl；或R2 為F，且R3 為Cl。
在另一優選例中，所述的光學異構體包括互變異構體，順反異構體，構象異構體，內消旋化合物和具有對映或非對映關係的光學異構體。
在另一優選例中，所述的化合物選自下組：
Figure 02_image023
Figure 02_image025
或
Figure 02_image027
通式 I 化合物的製備方法如下：
在四氫呋喃溶液中，加入PA3001-3化合物，然後0℃下，滴加叔丁基氯化鎂，反應30分鐘，然後一次性加入Ic化合物，反應過夜，淬滅，矽膠柱層析純化，得中間體IIa，IIa加入鹽酸乙醇溶液，脫去保護基TBS，得通式II化合物，II和酸、醯氯、鹵代烷基反應得通式I化合物。
Figure 02_image029
其中，各個反應物可以通過市售途徑購得，也可以採用市售的原料，通過本發明所屬技術領域常規的方法製備。
藥物組合物和施用方法
由於本發明化合物具有優異的對乙型肝炎病毒的抑制活性，因此本發明化合物及其各種晶型，藥學上可接受的無機或有機鹽，水合物或溶劑合物，以及含有本發明化合物為主要活性成分的藥物組合物可用於治療、預防以及緩解由乙型肝炎病毒所導致的疾病。根據現有技術，本發明化合物可用於治療以下疾病：HBV、HCV、HIV和HCMV等感染而引起的疾病。
本發明的藥物組合物包含安全有效量範圍內的本發明化合物或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至於產生嚴重的副作用。通常，藥物組合物含有0.1-1000mg本發明化合物/劑，更佳地，含有0.5～500mg本發明化合物/劑。較佳地，所述的“一劑”為一個膠囊或藥片。
“藥學上可以接受的載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質，它們適合於人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能和本發明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥學上可以接受的載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫®)、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調味劑、穩定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。
本發明化合物或藥物組合物的施用方式沒有特別限制，代表性的施用方式包括(但並不限於)：口服、直腸、腸胃外(靜脈內、肌肉內或皮下)、和局部給藥。特別優選的施用方式是口服。
用於口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a) 填料或增容劑，例如，澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和矽酸；(b) 黏合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c) 保濕劑，例如，甘油；(d) 崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯澱粉或木薯澱粉、藻酸、某些複合矽酸鹽、和碳酸鈉；(e) 緩溶劑，例如石蠟；(f) 吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g) 潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h) 吸附劑，例如，高嶺土；和(i) 潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩衝劑。
固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可採用包衣和殼材製備，如腸衣和其它本發明所屬技術領域公知的材料。它們可包含不透明劑，並且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內的某一部分中釋放。可採用的包埋組分的實例是聚合物質和蠟類物質。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。
用於口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本發明所屬技術領域中常規採用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質的混合物等。
除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、嬌味劑和香料。
除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質的混合物等。
用於腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用於重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。
用於局部給藥的本發明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑。活性成分在無菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩衝劑，或必要時可能需要的推進劑一起混合。
本發明化合物可以單獨給藥，或者與其他藥學上可接受的化合物聯合給藥。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發明化合物適用於需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時劑量為藥學上認為的有效給藥劑量，對於60kg體重的人而言，日給藥劑量通常為0.2～1000mg，優選0.5～100mg。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。
本發明的主要優點包括：
(1) 肝遞送性高，化合物只能被肝細胞中的細胞色素P450同功酶家族中的CYP3A特異性催化，生成活性分子，該活性分子帶高負電荷，不容易排出肝外，在其他組織中幾乎沒有CYP3A酶的表達，所以活性分子在肝中濃度遠高於其他組織，從而達到肝遞送效果。
(2) 活性高，因為化合物只能被肝細胞中的細胞色素P450同功酶家族中的CYP3A特異性催化，生成活性分子，該活性分子帶高負電荷，不容易排出肝外，口服給藥吸收後首先經過肝臟代謝（首過效應），所以更多的活性分子聚集在肝臟，抗病毒活性也能大大的提高。
(3) 毒副作用低：同等劑量的前藥，在除肝臟以外的其他組織中代謝成活性分子的量很少，所以對腎臟、腦等主要臟器的毒性大大降低。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
實施例 1 PA3001( 對比例 )
合成路線：
Figure 02_image031
實驗部分：
步驟1) 化合物PA3001-2的合成：
化合物恩替卡韋一水合物PA3001-1(5.32g,18mmol)和咪唑(8.0g,117.6mmol)溶於DMF(40ml)中，在冰浴下慢慢加入叔丁基二甲基氯矽烷 (TBSCl,13.3g,88mmol)， 氮氣保護下，反應室溫攪拌過夜，反應結束後，緩慢加入水中(400mL)，攪拌15分鐘，用乙酸乙酯(3×150mL)萃取，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:PE:EA(V:V)=1:3)得PA3001-2(8.2g)，收率90%。
步驟2）化合物PA3001-3的合成：
化合物PA3001-2(2.5g, 4.9mmol)溶於0.5%的鹽酸乙醇溶液(50ml)中，室溫攪拌0.5小時，迅速用飽合NaHCO3 溶液中和至pH=9，旋蒸去除乙醇，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:PE:EA:CH3 OH(V:V)=30:150:4.5)得白色固體化合物PA3001-3(1.5g)，收率78%。
步驟3）化合物PA3001-5的合成：
化合物PA3001-3（484mg,1.24mmol）溶於無水四氫呋喃中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(4.9mL,4.9mmol)，攪拌1小時，加入PA3001-4(633mg,1.71mmol)，室溫攪拌過夜。加入20mL飽和氯化銨淬滅，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，旋乾，矽膠柱層析柱分離純化（DCM:MeOH(V:V)=20:1）得PA3001-5(538g)，收率70%。
步驟4）化合物PA3001的合成：
化合物PA3001-5(270mg,0.43mmol)加入2%的鹽酸乙醇溶液(10mL)中，室溫攪拌2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×50mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過 Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3001(155mg)，收率70%。
實施例 2 PA3002
合成路線：
Figure 02_image033
步驟1）化合物PA3002-2的合成：
化合物PA3001-3(561mg, 1.4mmol)溶於四氫呋喃(30ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(5.6mL,5.6mmol,4.0eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3002-1(833mg,2.1mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3002-2(600mg)，收率65%。
步驟2）目標化合物PA3002的合成：
化合物PA3002-2(310mg,0.48mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3002(170mg)，收率66%。
實施例 3 PA3003
合成路線：
Figure 02_image035
實驗部分：
步驟1）化合物PA3003-2的合成：
化合物PA3001-3(900mg, 2.3mmol)溶於四氫呋喃(50ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(4.6mL, 4.6mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3003-1(1.17g,3.5mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×150mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=10:1)得白色固體PA3003-2(700mg)，收率64%。
步驟2）目標化合物PA3003的合成：
化合物PA3003-2(600mg,1.02mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×100mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3003(200mg)，收率41%。
實施例 4 PA3004
合成路線：
Figure 02_image037
實驗部分：
步驟1）化合物PA3004-2的合成：
化合物PA3001-3(677mg, 1.73mmol)溶於四氫呋喃(40ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(6.6mL, 6.6mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3004-1(970mg,2.5mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×150mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3004-2(580mg)，收率53%。
步驟2）目標化合物PA3004的合成：
化合物PA3004-2(580mg, 0.91mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×80mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3004(250mg)，收率52%。
實施例 5 PA3005
合成路線：
Figure 02_image039
實驗部分：
步驟1）化合物PA3005的合成：
化合物PA3004(300mg, 0.57mmol)溶於DMF(10ml)中，室溫下，加入DCC(352mg, 1.71mmol)，異丁酸(60mg, 0.68mmol)和催化量的DMAP(10mg)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化鈉水溶液(40mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3005(206mg)，收率61%。
實施例 6 PA3006
合成路線：
Figure 02_image041
實驗部分：
步驟1）化合物PA3006-1的合成：
化合物PA3004(200mg, 0.38mmol)溶於DMF(10ml)中，室溫下，加入DCC(234mg, 1.14mmol),(S)-2-((叔丁氧羰基)氨基)-3-甲基丁酸(124mg, 0.68mmol)和催化量的DMAP(10mg)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化鈉水溶液(40mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3006-1(180mg)，收率65%。
步驟2）化合物PA3006的合成：
化合物PA3006-1(180mg, 0.25mmol)溶於三氟乙酸溶液(5ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，旋蒸去除三氟乙酸後用乙酸乙酯40mL溶解，加水50mL，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3006(78mg)，收率50%。
實施例 7 PA3007
合成路線：
Figure 02_image043
實驗部分：
步驟1）化合物PA3004(200mg, 0.38 mmol)， DCC(235mg，1.14mmol)，DMAP（5mg，0.038mmol）溶於N,N-二甲基甲醯胺：二氯甲烷（V;V=1:1，10ml)中，冰浴下，緩慢滴加丙酸 (45uL,0.76mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌過夜。反應液濃縮後加入飽和氯化鈉水溶液(10mL)，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3007(105mg)，收率47%。
實施例 8 PA3008
合成路線：
Figure 02_image045
實驗部分：
步驟1）化合物PA3008-1的合成：
化合物PA3004(500mg, 0.95 mmol)溶於吡啶（5mL）中，冰浴下，緩慢滴加N,N-二甲基甲醯胺二甲基縮醛(0.2 mL,1.9 mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌過夜。反應液濃縮，真空箱乾燥得PA3008-1粗品（510mg）。
步驟2）目標化合物PA3008-2的合成：
化合物PA3008-1(500mg, 0.86 mmol)溶於吡啶（5mL）中，冰浴下，緩慢滴加氯甲酸異丙酯(0.1 mL,0.86 mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌4h後， 另一半氯甲酸異丙酯(0.1 mL,0.86 mmol)緩慢滴加反應液中，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌過夜。反應液濃縮，加入飽和氯化鈉水溶液(10mL)，乙酸乙酯(3×30mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=50:1)得白色固體PA3008-2(520 mg)，收率87%。
步驟3）目標化合物PA3008的合成：
化合物PA3008-2(200mg,3.02mmol)溶於9%的鹽酸乙醇溶液(10ml)中，室溫下攪拌反應16小時。反應結束後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×300mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3008(120mg)， 收率65%。
實施例 9 PA3009
合成路線：
Figure 02_image047
實驗部分：
步驟1）化合物PA3009的合成：
化合物PA3004(300mg, 0.57mmol)溶於DMF(10ml)中，室溫下，加入DCC(352mg, 1.71mmol)，葵酸(117mg, 0.68mmol)和催化量的DMAP(10mg)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化鈉水溶液(40mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×50mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3009(243mg)，收率63%。
實施例 10 PA3010
合成路線：
Figure 02_image049
實驗部分：
步驟1）化合物PA3010-2的合成：
化合物PA3001-3(300mg, 0.77mmol)溶於四氫呋喃(5 ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(2.7mL,2.7mmol,3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3010-1(370 mg, 0.92mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3010-2(300mg)，收率66%。
步驟2）目標化合物PA3010的合成：
化合物PA3010-2(300mg,0.47mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10 ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為7.5左右，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×80mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得粗品，粗品通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3010(45 mg)，收率18%。
實施例 11 PA3011
合成路線：
Figure 02_image051
實驗部分：
步驟1）化合物PA3011-2的合成：
化合物PA3001-3(300mg, 0.77mmol)溶於四氫呋喃(5 ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(2.7mL,2.7mmol,3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3011-1(0.37g，0.99mmol，1.3eq)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3011-2(320mg)，收率65%。
步驟2）目標化合物PA3011的合成：
化合物PA3011-2(0.32g, 0.5mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10 ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為7.5左右，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×80mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得粗品，粗品通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3011(115mg)，收率44%。
實施例 12 PA3012
合成路線：
Figure 02_image053
實驗部分：
步驟1）化合物PA3012-2的合成：
化合物PA3001-3(300mg, 0.77mmol)溶於四氫呋喃(5 ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3012-1(446mg, 1.2mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3012-2(300mg)，收率66%。
步驟2）目標化合物PA3012的合成：
化合物PA3012-2(300mg,0.47mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10 ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為7.5左右，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得粗品，粗品通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3012(45 mg)，收率18%。
實施例 13 PA3013
合成路線：
Figure 02_image055
實驗部分：
步驟1）化合物PA3013-2的合成：
化合物PA3001-3(300mg, 0.77mmol)溶於四氫呋喃(10ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(2.7mL, 2.7mmol, 3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3013-2(446mg,1.2mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3013-2(350mg)，收率71%。
步驟2）目標化合物PA3013的合成：
化合物PA3013-2(350mg,0.55mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)，通過製備板純化，（展開劑:DCM:MeOH(V:V)=10:1），和Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3013(20mg)，收率7%。
實施例 14 PA3014
合成路線：
Figure 02_image057
實驗部分：
步驟1）化合物PA3014-2的合成：
化合物PA3001-3(230mg, 0.58mmol)溶於四氫呋喃(20ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(1.75mL,1.75mmol,5.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3014-1(0.27g,0.69mmol,1.3eq)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(20mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3014-2(298mg)，收率79%。
步驟2）目標化合物PA3014的合成：
化合物PA3014-2(298mg, 0.46mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(3.5ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3014(61mg)，收率36%。
實施例 15 PA3016
合成路線：
Figure 02_image059
實驗部分：
步驟1）化合物PA3016-2的合成：
化合物PA3001-3(230mg, 0.59mmol)溶於四氫呋喃(10ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(2.1mL,2.1mmol,3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3016-1(340mg,0.88mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3016-2(250mg)，收率66%。
步驟2）目標化合物PA3016的合成：
化合物PA3016-2(250mg,0.39mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(2×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3016(20mg)，收率51%。
實施例 16 PA3017
合成路線：
Figure 02_image061
實驗部分：
步驟1）化合物PA3017-2的合成：
化合物PA3001-3(300mg, 0.77mmol)溶於四氫呋喃(5 ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(2.7mL,2.7mmol,3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3017-1(446mg,1.2mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3017-2(300mg)，收率66%。
步驟2）目標化合物PA3017的合成：
化合物PA3017-2(300mg,0.47mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10 ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為7.5左右，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得粗品，粗品通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3017(80 mg)，收率28%。
實施例 17 PA3018
合成路線：
Figure 02_image063
實驗部分：
步驟1）化合物PA3018-2的合成：
化合物PA3001-3(391mg, 1.0mmol)溶於四氫呋喃(40ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(3.5mL, 3.5mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3018-1(371mg,1.0mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×70mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3018-2(262mg)，收率42%。
步驟2）目標化合物PA3018的合成：
化合物PA3018-2(262mg, 0.42mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3018(96mg)，收率45%。
實施例 18 PA3019
合成路線：
Figure 02_image065
實驗部分：
步驟1）化合物PA3019-2的合成：
化合物PA3001-3(200mg, 0.51mmol)溶於四氫呋喃(10ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(1.8mL, 1.8mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3019-1(285mg,0.77mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×150mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=10:1)得白色固體PA3019-2(180mg)，收率56%。
步驟2）目標化合物PA3019的合成：
化合物PA3019-2(180mg,0.29mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3019(20mg)，收率13.5%。
實施例 19 PA3020
合成路線：
Figure 02_image067
實驗部分：
步驟1）化合物PA3020-2的合成：
化合物PA3001-3(200mg, 0.52mmol)溶於四氫呋喃(5 ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(1.8mL,1.8mmol,3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3020-1(190mg, 0.52mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(20mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×80mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3020-2(170mg)，收率53%。
步驟2）目標化合物PA3020的合成：
化合物PA3020-2(170mg,0.27mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10 ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為7.5左右，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得粗品，粗品通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3020(25 mg)，收率18%。
實施例 20 PA3022
合成路線：
Figure 02_image069
實驗部分：
步驟1）化合物PA3022-2的合成：
化合物PA3001-3(391mg, 1.0mmol)溶於四氫呋喃(40ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(3.5mL, 3.5mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3022-1(371mg,1.0mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3022-2(240mg)，收率38.5%。
步驟2）目標化合物PA3022的合成：
化合物PA3022-2(240mg, 0.38mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×80mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3022(103mg)，收率53%。
實施例 21 PA3023
合成路線：
Figure 02_image071
實驗部分：
步驟1）化合物PA3023-2的合成：
化合物PA3001-3(200mg, 0.51mmol)溶於四氫呋喃(10ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(1.8mL, 1.8mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3023-1(309mg,0.77mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×150mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=10:1)得白色固體PA3023-2(120mg)，收率36%。
步驟2）目標化合物PA3023的合成：
化合物PA3023-2(120mg,0.18mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(15ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3023(22mg)，收率22%。
實施例 22 PA3024
合成路線：
Figure 02_image073
實驗部分：
步驟1）化合物PA3024-2的合成：
化合物PA3001-3(200mg, 0.52mmol)溶於四氫呋喃(5 ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(1.8mL,1.8mmol,3.5eq)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌2小時，再冷卻到0℃，加入PA3024-1(200mg, 0.52mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(20mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×80mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3024-2(150mg)，收率45%。
步驟2）目標化合物PA3024的合成：
化合物PA3024-2(150mg,0.23mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10 ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為7.5左右，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得粗品，粗品通過Combiflash色譜柱純化，得淺白色固體PA3024(80mg)，收率65%。
實施例 23 PA3026
合成路線：
Figure 02_image075
實驗部分：
步驟1）化合物PA3026-2的合成：
化合物PA3001-3(391mg, 1.0mmol)溶於四氫呋喃(40ml)中，冰浴下，緩慢滴加1M的叔丁基氯化鎂溶液(3.5mL, 3.5mmol)，滴加完畢，反應液在室溫下攪拌1小時，再冷卻到0℃，加入PA3026-1(402mg,1.0mmol)，然後反應液在室溫下攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液(30mL)淬滅反應，乙酸乙酯(3×100mL)萃取，無水Na2 SO4 乾燥，過濾，旋乾，矽膠層析柱分離純化(洗脫劑:DCM:MeOH(V:V)=20:1)得白色固體PA3026-2(100mg)，收率15.3%。
步驟2）目標化合物PA3026的合成：
化合物PA3026-2(100mg, 0.15mmol)溶於3.6%的鹽酸乙醇溶液(10ml)中，室溫下攪拌反應2小時。反應結束以後，用飽和NaHCO3 溶液中和至pH值為中性，旋蒸去除乙醇後用乙酸乙酯(3×60mL)萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，旋乾，通過Combiflash色譜柱純化，得白色固體PA3026(32mg)，收率32.5%。
【表1】各個實施例中所製備得到的化合物如下表中所示
Figure 02_image077
Figure 02_image079
Figure 02_image081
Figure 02_image083
Figure 02_image085
Figure 02_image087
Figure 02_image089
Figure 02_image091
Figure 02_image093
Figure 02_image095
Figure 02_image097
Figure 02_image099
Figure 02_image101
Figure 02_image103
Figure 02_image105
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
Figure 02_image113
Figure 02_image115
Figure 02_image117
Figure 02_image119
Figure 02_image121
【表2】各個實施例中所製備得到的化合物核磁如下表中所示
Figure 107146542-A0304-0001
實施例 24 體外人、小鼠和大鼠肝微粒體代謝的評價
測定方法：
1）試劑來源
人肝微粒體（HLM，Human Liver Microsomes）購自IVT （In Vitro Technologies），貨號 X008070，批號 SSP。大鼠肝微粒體（RLM，Rat Liver Microsomes）購自BD，批號16298，和小鼠肝微粒體（MLM，Mice Liver Microsomes）購自瑞德肝臟疾病研究（上海）有限公司，批號BQNI。
測試化合物PA3001、PA3002、PA3003、PA3004由浙江柏拉阿圖醫藥科技有限公司合成，溶解於甲醇（國藥試劑），製成濃度為25 mM的存儲液。
2）反應過程
酶促反應在100 mM KH2 PO4 緩衝溶液(pH 7.4)中進行，測試化合物濃度為25 μM，人肝微粒體濃度為2 mg/ml，NADPH濃度為2 mM。反應由最後加入的NADPH啟動，在恒溫震蕩水浴鍋內反應5min後，立即加入1.5倍體積的甲醇以終止反應。
3）樣品處理和分析方法
I 樣品前處理：
用Eppendorf臺式離心機以最大轉速13,600 rpm離心20分鐘。取上清液，用氮吹儀吹乾之後重新溶解至流動相A(0.1%甲酸v/v的水溶液)。
II 液相梯度：
Figure 107146542-A0304-0002
分析柱：Waters, Acquity UPLC HSS T3 column
流速： 0.5 ml/min
柱溫： 40攝氏度
III 質譜條件
離子源：電噴霧電離源
離子模式：正離子模式
毛細管電壓：3.0 kV
溫度：500 ℃
去溶劑氣流速度：100 L/h
掃描時間：0.025 s
錐孔電壓：40 V
碰撞能量：18 eV
Q1(m/z)：358
Q3(m/z)：152
【表3】體外肝微粒體代謝化合物釋放單磷酸產物ETVMP的速率
Figure 107146542-A0304-0003
注釋： ND= Not Determined
結果分析：在體外，化合物PA3001、PA3003和PA3004均被人、大鼠、小鼠肝微粒體活化成單磷酸代謝產物ETVMP，PA3002和PA3004被人肝微粒體活化成單磷酸代謝產物ETVMP的效率顯著大於對照化合物PA3001，不同化合物的轉化速率存在顯著差異【表3】，其中PA3004在所有物種中的轉化速率都是最高的。
實施例 25 體外人肝微粒體代謝的評價
測定方法：
1）試劑來源
人肝微粒體（HLM，Human Liver Microsomes）購自IVT （In Vitro Technologies），貨號 X008070，批號 IQF。
測試化合物PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3010、PA3011、PA3012A、PA3013、PA3014、PA3016、PA3017、PA3018、PA3019、PA3020、PA3022、PA3023、PA3024、PA3026由浙江柏拉阿圖醫藥科技有限公司合成，溶解於甲醇（國藥試劑），製成濃度為25 mM的存儲液。
2）反應過程
酶促反應在100 mM KH2 PO4 緩衝溶液(pH 7.4)中進行，測試化合物濃度為25 μM，人肝微粒體濃度為2 mg/ml，NADPH濃度為2 mM。反應由最後加入的NADPH啟動，在恒溫震蕩水浴鍋內反應5min後，立即加入1.5倍體積的甲醇以終止反應。
3）樣品處理和分析方法
I 樣品前處理：
用Eppendorf臺式離心機以最大轉速13,600 rpm離心20分鐘。取上清液，用氮吹儀吹乾之後重新溶解至流動相A(0.1%甲酸v/v的水溶液)。
II 液相梯度：
Figure 107146542-A0304-0004
分析柱：Waters, Acquity UPLC HSS T3 column
流速： 0.5 ml/min
柱溫： 40攝氏度
III 質譜條件
離子源：電噴霧電離源
離子模式：正離子模式
毛細管電壓：3.0 kV
溫度：500 ℃
去溶劑氣流速度：100 L/h
掃描時間：0.025 s
錐孔電壓：40 V
碰撞能量：18 eV
Q1(m/z)：358
Q3(m/z)：152
【表4】體外人肝微粒體代謝化合物釋放單磷酸產物ETVMP的速率
Figure 107146542-A0304-0005
結果分析：在體外，化合物均可被人肝微粒體活化成單磷酸代謝產物ETVMP。不同化合物的轉化速率存在顯著差異(表4)， PA3017、PA3016、PA3004被人肝微粒體活化成單磷酸代謝產物ETVMP的效率顯著大於對照化合物PA3001，分別是PA3001轉化速率的4.6倍、3.0倍和1.5倍。
實施例 26 化合物組織分布實驗
26.1 方法：
26.1.1 動物實驗
雄性SD大鼠，體重180～300g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供。雄性動物適應環境3天以上，實驗前一天晚上禁食12小時，不禁水。製備PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韋的溶液劑(Cremophor EL ：乙醇：生理鹽水=10：10：80，V/V/V)。給藥前查看動物體重是否與實驗要求相符，選取12只大鼠進行分組，每組2只大鼠，灌胃給予0.036 mmol/kg的藥液。分別於0.5h、 1h、3h、6h、12h和24h，用二氧化碳氣體將大鼠安樂死後採集樣品。
26.1.2. 單磷酸和去磷酸代謝產物分別為 ETVMP 和 ETV 在生物樣品中含量測定
樣品前處理
通過心臟抽取血液，貯存於肝素抗凝管中，4℃下以6000rpm離心5min，取上清血漿立即加入5倍體積的10 %三氯乙酸沉澱劑（含內標PMPA，濃度為100 ng/mL），獲得血漿樣品液；冰上稱取適量大鼠的肝臟和腦漿樣品於勻漿管中，如上立即加入5倍體積的10 %三氯乙酸沉澱劑，每個勻漿管中加入2顆陶瓷珠進行勻漿，獲得組織勻漿液樣品。
取生物樣品100 μL，置1.5 mL 試管中，離心5 min。取20 μL上清液，加入180 μL水，混勻，進行LC-MS/MS分析。
色譜條件
LC-MS/MS-AJ (Triple Quad 5500, AB SCIEX)用於樣品的分析。色譜柱：Acquity UPLC HSS T3 (2.1×50 mm， 1.8 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL/min。流動相A：0.1 % 甲酸水溶液，流動相B：乙腈溶液。樣品分離採用梯度洗脫，程序如【表5】。
【表5】ETVMP和ETV液相洗脫梯度條件
Figure 107146542-A0304-0006
質譜條件
離子源為電噴霧電離源（Turbo Ionspray）；正離子模式；毛細管電壓為3.0 kV；溫度為500℃；去溶劑氣流1000 L/h；掃描時間、錐孔電壓、碰撞能量及用於定量分析的離子反應見下【表6】：
【表6】ETVMP和ETV質譜條件
Figure 107146542-A0304-0007
注：ETVMP樣品室溫穩定性不太好，需在冰上操作，且立即加入沉澱劑。
26.1.3. 數據分析
各化合物的代謝產物在肝臟中的濃度對應時間做成柱狀分布圖。ETVMP 和 ETV 的組織濃度-時間曲線下面積(AUC0-t )，使用WinNonLin6.2.1(Pharsight, CA)的非房室模型中的對數-線性梯形法進行擬合計算。
26.2 實驗結果
PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋釋放ETVMP 和 ETV 的結果匯總於【表7】。
【表7】大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和恩替卡韋後24小時以內，單磷酸代謝產物ETVMP和無磷酸代謝產物ETV在肝臟和腦漿和血漿中的暴露量(AUC0-24h，h·nmol/g，濃度/組織重量)
Figure 107146542-A0304-0008
N.D.=Not detectable, 未檢出(代表在相應器官或組織中的濃度低於5 nmol/g或5 nmol/mL)
26.2.1 代謝產物在肝臟、血漿和腦漿組織中的分布
SD大鼠灌胃口服給予0.036 mmol/kg試藥後，肝臟組織分布的結果顯示，PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和PA3017代謝釋放的抑制乙肝病毒的聚合酶的活性分子ETVMP略低於或者與對應時間點的ETV持平 (第1圖)，而PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和PA3017在肝臟中的去磷酸代謝產物ETV遠遠低於ETV (第2圖)，表明前藥代謝生成的ETVMP不容易逆轉代謝為ETV，為前藥藥效的發揮提供了保證。式II化合物在肝臟中直接由CYP3A4酶促釋放單磷酸產物ETVMP，而ETV的單磷酸轉化為其限速步驟，而ETVMP不容易逆轉代謝成ETV。因此，式II化合物能夠提高活性代謝產物在肝臟的分布比例，降低代謝產物在血漿、腦漿等組織的分布比例。
SD大鼠灌胃口服給予0.036 mmol/kg試藥後，血液和腦漿的分布結果顯示，PA3001、PA3002、PA3003、PA3004和PA3017代謝釋放的ETVMP和ETV都遠低於對應時間點的ETV (第3圖、第4圖、第5圖和第6圖)。表明ETV可通過血腦屏障，ETV本身及其代謝產物ETVMP是導致腦部神經毒性的活性分子；用建立的LC-MS/MS檢測方法（檢測下限LOD=5 nmol/g或5 nmol/mL），在口服PA3004和PA3017的大鼠的腦樣品中無法檢測出這些活性分子（表7）。在血液中， PA3004和PA3017釋放的ETVMP分別為ETV的16.4%和14.5%；釋放的ETV分別為ETV的2.3%和1.8%，同時，也低於對比例PA3001。
可以用肝中ETVMP與血中ETV的AUC的比例（肝靶向指數）來反映化合物的肝靶向性， PA3004和PA3017的肝靶向指數分別為15.52和15.47，顯著大於PA3001和ETV（肝靶向指數分別為12.46和0.51）。這些結果表明在同等劑量下與ETV比較，肝遞送基團的修飾顯著降低了活性分子ETVMP和ETV在血、腦中的分布。PA3017和PA3014能夠改善臨床上ETV導致的常見不良反應，包括頭痛、疲勞、眩暈、噁心等。
綜上，由於本發明式I和式II化合物具有更高的活性和更高的肝遞送組織特異性 ，因此治療時所需的用量更低，具有更高的安全性和更低的毒副作用。
在本發明提及的所有文獻都在本發明申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本發明之申請專利範圍所限定的範圍。
綜上所述，本發明所揭露之技術手段確能有效解決習知等問題，並達致預期之目的與功效，且申請前未見諸於刊物、未曾公開使用且具長遠進步性，誠屬專利法所稱之發明無誤，爰依法提出申請，懇祈 鈞上惠予詳審並賜准發明專利，至感德馨。
惟以上所述者，僅為本發明之數種較佳實施例，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
無
第1圖顯示了大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋後，單磷酸活性分子ETVMP在肝臟中濃度-時間柱狀分布圖(nmol/g，摩爾濃度/組織重量)。 第2圖顯示了大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋後，ETV在肝臟中濃度-時間柱狀分布圖(nmol/g，摩爾濃度/組織重量)。 第3圖顯示了大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋後，單磷酸活性分子ETVMP在血漿中濃度-時間柱狀分布圖(nmol/g，摩爾濃度/組織重量)。 第4圖顯示了大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋後， ETV在血漿中濃度-時間柱狀分布圖(nmol/g，摩爾濃度/組織重量)。 第5圖顯示了大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋後，單磷酸活性分子ETVMP在腦漿中濃度-時間柱狀分布圖(nmol/g，摩爾濃度/組織重量)。 第6圖顯示了大鼠灌胃給予0.036 mmol/kg PA3001、PA3002、PA3003、PA3004、PA3017和恩替卡韋後， ETV在腦漿中濃度-時間柱狀分布圖(nmol/g，摩爾濃度/組織重量)。 注釋： ETV：恩替卡韋，2-氨基-9-[(1S,3S,4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮 （CAS：142217-69-4） ETVMP：2-氨基-9-((1S,3R,4S)-4-羥基-3-(單磷酸酯亞甲基)-2-甲烯基環戊基)-3H-嘌呤-6(9H)-酮(CAS: 1103994-53-1)
Figure 107146542-A0101-11-0001-1

Claims (5)

  1. 一種式PA3004所示的化合物或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物，所述式PA3004為：
    Figure 107146542-A0305-02-0055-1
  2. 如請求項1所述之式PA3004所示的化合物或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物，其中，所述式PA3004所示的化合物的鹽為式PA3004所示的化合物與無機酸或有機酸所形成的可藥用鹽，或所述式PA3004所示的化合物的鹽為式PA3004所示的化合物與鹼反應所形成的可藥用鹽，所述式PA3004所示的化合物或其鹽為無定形物或晶體。
  3. 一種藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物包括治療有效量的如請求項1或2所述之式PA3004所示的化合物或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物；和藥學上可接受的輔助劑、稀釋劑或載體。
  4. 一種如請求項1所述之式PA3004所示的化合物或其光學異構體、藥學上可接受的鹽、水合物或溶劑化物的用途，其係用於製備治療和/或預防與乙型肝炎病毒(HBV)感染相關的急性或慢性疾病的藥物組合物。
  5. 一種如請求項1所述之式PA3004所示的化合物的製備方法，其中，所述式PA3004所示的化合物是藉由以下方法製備的：
    Figure 107146542-A0305-02-0056-2
     式中的(i-b)是在惰性溶劑中，用式PA3004-2所示的化合物脫除TBS，形成所述式PA3004所示的化合物，其中，所述式PA3004-2所示的化合物是藉由以下方法製備的：
    Figure 107146542-A0305-02-0056-3
     式中的(i-c)是在惰性溶劑中，將式PA3001-3所示的化合物與式PA3004-1進行取代反應，得到所述式PA3004-2所示的化合物。
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