CN106668002A - 芦竹碱及其衍生物在制备抗7型腺病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗病毒药物技术领域。提供了芦竹碱（Gramine）及其衍生物在制备抗7型腺病毒药物中的应用。所述芦竹碱衍生物为式G1，G2，G3，G4，G5，G10，G17，G18，G19，G20，G21所示的化合物。通过Gramine衍生物抗ADV7活性研究实验、抗ADV7药理学研究、G19对于ADV7复制的抑制作用试验，Gramine衍生物抑制ADV7在宿主细胞Hela上产生的细胞病变效应（CPE），增强细胞存活率，抑制子代病毒产量，主要抑制ADV7病毒在宿主细胞内的复制阶段。表明芦竹碱及其衍生物有制备抗ADV7病毒药物的潜力，这些化合物合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产，具有临床应用前景。

Description

芦竹碱及其衍生物在制备抗7型腺病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物领域，具体涉及芦竹碱(Gramine)及其衍生物在制备抗7型腺病毒的药物中的应用。

背景技术

腺病毒(adenovirus,ADV)为一群分布广泛的DNA病毒。人体腺病毒已知有52种，分别命名为advl～adv52，分两个属，共约100余血清型。人腺病毒约1/3的已知血清型与人类疾病相关。腺病毒可侵犯呼吸道、眼结膜、胃肠道及泌尿道等多种组织器官，以呼吸道感染为主，重者可致小儿肺炎，并可累积全身各系统。腺病毒感染所致的腺病毒性肺炎为小儿肺炎中最严重类型之一。与呼吸道疾病相关的腺病毒型别主要有ADV7、ADV3和ADV4，其中ADV7可引起严重的或致死性的婴幼儿下呼吸道感染，并容易引起暴发流行。目前临床上针对该病毒导致的感染，尚无有效的预防疫苗和治疗药物，主要采取对症治疗。

到目前为止，Gramine已经被广泛用作含有吲哚类结构化合物的先导骨架，合成具有多样性生物学活性的化合物。许多拥有极佳生物学活性的结构衍生物已经通过不同的途径被合成。本申请人在前期的研究工作中于期刊European Journal of MedicinalChemistry公开了系列Gramine衍生物的制备，并且发现此类化合物具有一定的抗肿瘤作用。

发明内容

本发明的目的是提供芦竹碱及其衍生物在制备抗7型腺病毒的药物中的应用，所述的Gramine及其衍生物G1，G2，G3，G4，G5，G10，G17，G18，G19，G20，G21，其结构式如下所示：

通过生物学实验，发现这些芦竹碱衍生物中很多化合物具有抗ADV7病毒的活性。具体表现为可以强烈抑制ADV7病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，抑制子代病毒产量。而且主要作用于ADV7感染细胞后的复制阶段。

本发明的第二个目的是提供一种抗7型腺病毒的药物，包含有效剂量的作为活性成分的芦竹碱、式G1，G2，G3，G4，G5，G10，G17，G18，G19，G20，G21中的任意一种，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

进一步地，所述的芦竹碱衍生物优选为式G18或G19。

进一步地，所述的芦竹碱衍生物优选为式G19。

本发明的第三个目的是提供芦竹碱及其衍生物在制备抑制7型腺病毒在细胞内复制的药物。

初步机理研究表明，这些衍生物的目标是ADV7感染细胞后的复制阶段。在病毒感染后加入G19作用，可以强烈抑制ADV7的子代病毒产量。40μg/mL G19处理时，在Hep-2细胞中其子代病毒滴度呈现了约4.0log的减少，在Hela细胞中其子代病毒滴度呈现了约2.0log的减少。

进一步地，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

由此表明这些芦竹碱衍生物有潜力制备抗ADV7感染的特异治疗药物，具有大的临床应用前景。

本发明的这些Gramine衍生物的制备，参照文献European Journal of MedicinalChemistry，2012，54，248的方法，具体以吲哚或N-取代吲哚为起始原料，采用无催化剂一锅法即可便利制备。

本发明具有以下优点：

1、这些Gramine衍生物合成原料价格低廉，易于购得；合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产推广。

2、众多Gramine衍生物具有对于ADV7的抑制活性，易于从中找到最佳药效学、适合临床应用的化合物；而且可以通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步制备药物开发提供有价值的导向作用。

3、本发明中的Gramine衍生物兼具抗肿瘤及抗病毒活性，这可以大大减低后期开发应用的风险，提高制备抗肿瘤及抗病毒活性药物的应用价值和市场竞争力。

附图说明

图1是不同浓度的Gramine及其衍生物对于ADV7作用的Hela细胞存活率的影响。

图2是Gramine及其衍生物G19对于ADV7引起的Hela细胞CPE的抑制效应。

图3是Gramine衍生物G19不同加药方式处理下对于ADV7的抑制活性。

图4是Gramine衍生物G19对于ADV7在Hep-2和Hela细胞中复制的影响。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

【实施例1】对Gramine及其衍生物抗ADV7活性进行评估

1、试验方法：

1.1 Gramine及其衍生物对于宿主Hela和Hep-2细胞的毒性

将Hela和Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD₄₉₂值/细胞对照组平均OD₄₉₂值)×100％。

1.2 Gramine及其衍生物对于ADV7的抑制活性

将Hela和Hep-2细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID50的ADV7病毒液感染细胞1h，在病毒感染前，感染期间，感染后均加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

CPE观察完毕后，利用MTT方法检测药物对ADV7的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD₄₉₂值)。利用如下公式计算药物对ADV7的抑制率。用SPSS11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％ of maximal effect，EC50)。

1.3药物的治疗指数(SI)

SI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

2、试验结果

表1 Gramine及其衍生物细胞毒性及抗ADV7活性

a“-”未检测到活性或低于50％的抑制率。：ND:未进行实验

Gramine及其衍生物细胞毒性及抗ADV7活性测试结果如表1所示。浓度依赖的化合物对于ADV7作用的Hela细胞存活率的影响如图1所示。本发明检测到母体Gramine对于ADV7有一定的抑制活性，可以达到约50％的抑制效果。衍生物G1、G4、G5有类似母体Gramine的抑制作用，G2、G3、G10，G17，G18，G19，G20，G21可以明显提高其抗病毒性能。在这些衍生物中，G18和G19有着最高的治疗指数(SI为12.6和13.7)，显示出最强的应用潜力，优于对照药物利巴韦林(EC50为31.9,SI为6.2)。母体Gramine及其代表衍生物G19抑制ADV7引起的Hela细胞CPE效应如图2所示。ADV7感染的Hela细胞变圆，从细胞板壁脱离，母体Gramine(40μg/mL)处理对于其病变效应有一定的抑制作用，衍生物G19(40μg/mL)呈现了强的抗ADV7活性，可以几乎完全抑制ADV7引起的Hela细胞病变效应。

【实施例2】对Gramine衍生物进行抗ADV7活性药理学研究

1、试验方法

1.1衍生物对于ADV7的直接杀伤作用分析

高滴度的ADV7悬液与Gramine及其衍生物(选择可以最大限度抑制细胞CPE的浓度)在4℃冰箱孵育24h，病毒悬液稀释一定倍数，使其远小于化合物对于病毒抑制的有效浓度，滴定于提前准备好的已贴壁长满单层的Hela细胞中，通过Reed和Muench方法计算病毒悬液的TCID₅₀值。

1.2衍生物对于ADV7作用方式的分析

通过三种不同的加药方式(ADV7感染前，感染之间，感染之后加入测试化合物)分别测定化合物对于ADV7的影响。

(1)预防作用：在ADV7感染之前加入衍生物作用。

Hela细胞在96孔板中长满单层后，吸弃培养液，加入含不同浓度测试化合物孵育2h，弃掉药物培养液之后，100TCID₅₀的ADV7悬液吸附1h，去掉病毒悬液，加细胞培养维持液继续培养。48h时观察细胞CPE，测定细胞存活率。

(2)抑制吸附作用:在ADV7感染期间加入衍生物作用。

将ADV7悬液和测试化合物混匀，直接滴定于已长满单层96孔板的Hela细胞中，37℃，5％CO₂培养箱吸附1h后，弃去感染液，加细胞维持液继续培养。48h时测定细胞存活率。

(3)治疗作用：在ADV7感染之后加入衍生物作用。

Hela细胞在96孔板中长满单层后，吸弃培养液，100TCID₅₀的ADV7悬液吸附1h，弃去病毒液，加入含不同浓度测试化合物继续培养，48h时检测细胞CPE和存活率。

为了进一步验证不同加药方式对于ADV7的抑制作用，选择代表衍生物G19，设定浓度为40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL，分别通过上述三种加药方式培养，48h时观察细胞CPE，TCID₅₀方法测定子代病毒产量。

2、试验结果

2.1 Gramine及其衍生物体外直接杀伤ADV7作用

Gramine及其衍生物处理过的ADV7悬液感染Hela细胞，48h检测其病毒滴度。结果发现，药物处理组相比病毒对照组，病毒滴度无明显变化(数据未显示)，说明这些衍生物均不具有体外直接杀伤ADV7作用。

2.2 Gramine及其衍生物抑制ADV7的作用方式

所有衍生物预处理细胞对于随后的ADV7感染无明显的CPE抑制效应(代表化合物G19如图3A所示)，且衍生物G19处理的细胞同未做处理的病毒对照组细胞相比，病毒滴度无明显差别(见图3B)，化合物与ADV7同时孵育感染细胞这种加药方式得出相似的结果，说明这些衍生物均不能通过预先作用于细胞来抑制ADV7，即Gramine及其衍生物对于病毒感染无预防作用，且Gramine及其衍生物对于ADV7的吸附内化无明显影响。

ADV7感染之后加入Gramine及其衍生物作用，发现这些衍生物显示了对于ADV7强的抑制活性，有的衍生物可以几乎完全抑制ADV7导致的细胞病变效应(代表化合物G19如图3A所示)，G19处理组的病毒滴度相对于病毒对照也明显降低，浓度为40μg/mL时可以使病毒滴度降低约2.5log(图3B)，由此说明这些衍生物主要作用ADV7感染后在细胞内的复制增殖过程，这些Gramine衍生物用于制备抗ADV7感染后在细胞内的复制增殖过程的药物。

【实施例3】Gramine衍生物G19对于ADV7子代病毒产量的抑制作用

1、试验方法

对数生长期的Hep-2和Hela细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID₅₀ADV7感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含G19的细胞维持液。分别在4、8、24或36h(pi)收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID50方法测定ADV7病毒滴度。

2、试验结果

如图4所示，在病毒对照细胞中，病毒滴度从4h到36h呈现大幅增加，说明了细胞中病毒呈现的复制状态。而在40μg/mL G19处理的Hep-2细胞中直至36h，病毒滴度都无明显增加(图4B)，说明了化合物对于ADV7强烈的抑制作用。在Hela细胞中，G19抑制病毒的作用相比在Hep-2细胞中略差，但也呈现出明显的抑制效应(图4A)。

以上结果进一步说明这些Gramine衍生物主要制备抑制病毒在细胞内的复制阶段的药物。

综上所述，这些Gramine衍生物具有较强的抑制ADV7作用，Gramine及其衍生物目标ADV7感染细胞后的复制阶段。其中包含吡啶和苯并噻唑单元的化合物G19显示了最强的应用潜力，有希望制备一种临床上有效治疗ADV7感染的药物。Gramine及其衍生物对于抗病毒药物设计、合成提供了理想的前导支架以及有价值的导向作用。

Claims (7)

1.芦竹碱及其衍生物在制备抗7型腺病毒药物中的应用，所述的芦竹碱及其衍生物为下式之一：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的芦竹碱及其衍生物是芦竹碱、式G1，G2，G3，G4，G5，G10，G17，G18，G19，G20，G21中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的芦竹碱衍生物是G18或G19。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的芦竹碱衍生物是G19。

5.权利要求1所述的芦竹碱及其衍生物在制备抑制7型腺病毒在细胞内复制的药物中的应用。

6.一种抗7型腺病毒的药物，其特征在于，包含有效剂量的作为活性成份的如权利要求1所示的芦竹碱及其衍生物的任意一种，或它们的盐，和药学上可以接受的载体。

7.根据权利要求6所述的抗7型腺病毒的药物，其特征在于，所述药物制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。