CN113278067A - 一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法，所述特异性COVID‑19猪源性免疫球蛋白的制备方法包括如下步骤：S1，使用灭活疫苗抗原免疫健康猪；S2，制备免疫血浆；S3，低温乙醇法纯化猪源性免疫球蛋白中间品；S4，制备猪源性免疫球蛋白半成品；S5，制备猪源性免疫球蛋白成品。

Description

一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎，是指新型冠状病毒感染导致的肺炎。国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为 SARS-CoV-2，世界卫生组织(WHO)将该病毒引起的疾病命名为新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)。新型冠状病毒感染性极强，其致死率约为2％到4％。R0是用来衡量传染性的参数， 它的大小取决于各种生物、环境和社会行为因素。SARS-CoV-2的R0值为2-3，而西班牙流感R0值为0.9-2.1。
2020年初的被人们给予厚望的瑞德西韦(Gilead公司)，在随机对照临床试验中证实，其对重症新冠 肺炎患者无明显改善效果。截止目前为止，临床医学对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎 (COVID-19)，尚无特效的治疗药物和手段。根据人类与传染病斗争的经验，最有效而经济的手段之一是 抗血清及其特异性免疫球蛋白的被动免疫治疗，这一方法在某些重要传染病的治疗和预防上至今仍被使 用，并发挥了重要的作用。抗血清一般为含有抗体的人血清和动物血清(如马血清、猪血清等)，但因为 直接应用血清容易带来较严重的血清病隐患，因此临床应用多采取纯度更高，安全性更好的特异性球蛋白。
目前国内外开展的研究项目多为康复期人血浆/血清的利用。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试 行第四版)》提及“可以考虑恢复期血浆治疗”，也说明了抗新型冠状病毒血浆的疗效。但康复期血浆方案 存在着血浆来源有限，同时还存在病毒传播的风险(乙肝、丙肝、艾滋、梅毒等)，因此该方案仅可作为 一种非常规的应急治疗方法，无法被大规模推广应用。
面对全球巨大的临床需求，动物来源的免疫球蛋白因具备来源广泛，制备工艺成熟、稳定、简单、效 果确切等优点，可作为预防及治疗COVID-19的一种可能有临床前景的途径。
但开发动物源性免疫球蛋白同样存在着各种困难。针对特定病毒的动物源性免疫球蛋白的开发过程本 身就存在极大的不确定性，这可以从艾滋病毒抗体的开发过程窥见一斑。第一，由于SARS-CoV-2出现时 间较短，对其特性了解不够深入，使得动物源性COVID-19免疫球蛋白的开发存在天然性困难；第二，免 疫动物的选择上也存在困难。免疫动物与人的亲缘关系，对SARS-CoV-2的敏感性，是否容易引入外源病 毒等都是需要考虑的因素，在这些因素的限制下，可供选择的免疫动物并不多，这也增加开发动物源性 COVID-19免疫球蛋白的失败风险；第三，目前还没有成熟的动物源性新型冠状病毒免疫球蛋白产品上市，可能意味着常规的动物源性免疫球蛋白的制备工艺并不能适应COVID-19免疫球蛋白的生产。即使选择到 合适的免疫动物，将免疫血浆制备成免疫球蛋白制品也存在着很大的不确定性，其制备工艺也需要研究者 进行大量的工作。
目前常用的动物如狗、羊等均已有文献报道，但免疫后效价较低，如CN202010205050.9的专利中公 开了一种马抗SARS-CoV-2病毒抗体。对检疫合格的马经免疫后，采集琼扩效价大于1:32的血清，经灭活 和除去热源，用胃蛋白酶进行酶切，酶切产物经rProteinA FF亲和层析去除Fc抗体片段，再用rProteinG FF 亲和层析收集和洗脱F(ab’)2片段，在亲和层析步骤中，同时对层析液进行除菌，除病毒处理，然后经超 滤浓缩、分装、冻干得到该发明的马抗SARS-CoV-2抗体。但该发明的免疫血清的效价较低，马源性制品 因其免疫源性，在临床上副反应较大，需要采用酶切方式去除抗体Fc段，以降低其免疫源性，且制备工 艺效益低下，不适合大规模的工业化生产。
综上，在全球COVID-19全面爆发的背景下，研制一种高效的、可规模化生产的动物源性COVID-19 免疫球蛋白是本技术领域迫切需要解决，但始终还未解决的技术问题。解决该技术问题的技术方案存在着 巨大的商业价值和社会价值。
发明内容
本发明首先涉及一种新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1，使用灭活疫苗抗原免疫健康猪(Sus scrofa domesticus)：雌雄各半，普通级，初始体重60-70kg， 无猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒和乙型脑炎病毒感染；优选的健康猪品系为长白猪、 杜克猪、大约克夏猪等品系；
S2，制备免疫血浆；
S3，低温乙醇法纯化猪源性免疫球蛋白中间品；
S4，制备猪源性免疫球蛋白半成品；
S5，制备猪源性免疫球蛋白成品
其中，
步骤S1所述的免疫方法为：使用灭活疫苗抗原免疫健康猪并监控免疫效果，至免疫后猪血浆中新型 冠状病毒的中和抗体EC50＞4000时，采集免疫血浆。
优选的免疫方法为，使用免疫佐剂(优选为弗氏完全佐剂)与灭活的疫苗原液(疫苗原液的制备方法 参见CN202010559132.3)等体积配比混匀后，免疫三次(0天、21天、42天)，每次免疫剂量为10-100μg 抗原/头。
步骤S2所述的制备免疫血浆的方法为：经检验合格(抗体中和滴度EC50＞4000)后，进行颈动脉插 管放血，并采用预先加入抗凝剂(肝素钠或枸橼酸钠)的无菌血浆袋收集，然后400×g离心10分钟，将 上清转移至另一无菌血浆袋中-20℃保存；
步骤S3所述的猪源性免疫球蛋白中间品的制备，采用四步法进行纯化，所述四步法包括以下步骤：
S3-1，对免疫血浆进行分离，获得初步纯化的FⅡ+Ⅲ上清液和待废弃的FⅠ沉淀；
S3-2，对初步纯化FⅡ+Ⅲ上清液进行分离，获得FⅡ+Ⅲ沉淀和待废弃的上清液；
S3-3，将FⅡ+Ⅲ沉淀溶解后进行分离，获得FⅡ上清液和待废弃的FⅢ沉淀；
S3-4，对FⅡ上清液进行分离，得到精制FⅡ沉淀(中间品)和待废弃的上清液。
所述步骤S3-1包括以下步骤：
S3-1-1(8％乙醇制作)，称量新型冠状病毒免疫猪血浆量，按血浆量加入20％～30％的生理盐水溶液， 搅拌均匀，调整混合溶液的pH值为7.00±0.50，再将混合液的温度降至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙 醇至终浓度8％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-1-2(FⅠ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离出FⅠ沉淀废弃，收集上清液；
所述步骤S3-2包括以下步骤：
S3-2-1(25％乙醇制作)，调整上清液的pH值为7.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％ 乙醇至终浓度25％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-2-2(FⅡ+Ⅲ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离，沉淀为FⅡ+Ⅲ，上清液废弃；
所述步骤S3-3包括以下步骤：
S3-3-1(17％乙醇制作)，用所述免疫血浆重量1.0～2.0倍预冷注射用水溶解FⅡ+Ⅲ沉淀，搅拌后调 整到pH值5.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终浓度17％，搅拌1～6小时后， 停止搅拌静置8～24小时；
S3-3-2(FⅢ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离出FⅢ沉淀废弃，收集上清液；
所述步骤S3-4包括以下步骤：
S3-4-1(25％乙醇制作)，用预冷注射用水将上清液稀释至所述免疫血浆量的1.0～2.0倍，加入固体氯 化钠(0.0195％，wt)，调整混合溶液的pH值为7.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇 至终浓度25％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-4-2(FⅡ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离，沉淀为FⅡ，上清液废弃；
步骤S4所述猪源性免疫球蛋白半成品的制备方法为：
S4-1(超滤透析)，用所述免疫血浆量的0.2～0.5倍预冷注射用水溶解FⅡ沉淀，用1mol/L盐酸或1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶解制品至pH4.10±0.30，超滤浓缩溶液至所述免疫血浆量的15％～30％；
S4-2(配制)，将滤液超滤浓缩，使蛋白含量为3.5％～5.5％，按浓缩液体积的5～10倍配制生理氯化 钠溶液，对浓缩液进行超滤透析，透析完毕用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调整pH至4.10±0.30，按终 浓度10-30g/L比例加入甘氨酸，搅拌使其溶解完全；
S4-3(除菌及除病毒)，将配制好的免疫球蛋白经除菌滤器过滤至容器中，并取样进行半成品检定；过 滤完毕将容器放置恒温环境中或容器自带控温系统，维持配制后的低pH，进行低pH孵放病毒灭活，温度 为24±2℃，孵放时间为24天，孵放至3、7、14、24天时，对制品外观进行检查，应为澄清无混浊状，孵 放完毕后，对制品进行DV20(20nm孔径滤膜)除病毒过滤。
可选的，步骤S4所述的方法还包括：
S4-4(半成品检定)，取样做半成品检定，效价EC50值>1000；无菌检查应符合《中国药典》2020版 三部的规定；热原检查应符合《中国药典》2020版三部的规定；
步骤S5所述猪源性免疫球蛋白成品的制备方法为：
S5-1(分装)，经过24天低pH孵放病毒灭活，并且半成品检定合格后，方可进行制品分装；
S5-2(成品检定)，制品分装后取样进行成品检定，纯度不低于蛋白质总量的90.0％，IgG单体与二聚 体含量之和应不低于90.0％，多聚体含量应不高于5.0％，效价EC50值>1000，无菌检查应符合《中国药典》 2020版三部的规定；热原检查应符合《中国药典》2020版三部的规定；
本发明还涉及由所述的生产方法制备得到的新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白(P-IgG)。
本发明还涉及所述的新型冠状病毒的猪源性免疫球蛋白的生产方法在制备抗新冠病毒的药物或生物 制品中的应用。
本发明还涉及所述的新型冠状病毒猪源性免疫球蛋白(P-IgG)在制备抗新冠病毒的药物或生物制品 中的应用。
本发明的目的是提供一种采用三针法进行免疫已制备新型冠状病毒免疫球蛋白，并采用低温乙醇工艺 实现对新型冠状病毒动物源性血浆蛋白(特别是免疫球蛋白)进行分离纯化的制备方法。本发明以健康猪 血浆作为原料有明显的优点：
(1)除灵长类动物外，猪和人的基因结构最具有同源性，其血浆蛋白质的结构和理化性质与认得血 浆蛋白质相近，决定了猪的蛋白质作为异种蛋白在人体内具有较小的副反应。
(2)猪血浆易于采集，血浆量较多。
(3)猪免疫球蛋白分子量约16万KD左右，接近于人免疫球蛋白分子量，反应条件容易控制，副反 应相对较小。
(4)猪源性多抗类药物——抗人T细胞猪免疫球蛋白(anti-human T lymphocyteporcine immunogloblin， P-ATG)作为一种上市多年的广泛用于治疗重型再生障碍性性贫血、器官移植的药物，具有良好的安全性 及疗效。《再生障碍性贫血诊断与治疗中国专家共识(2017年版)》中推荐P-ATG联合CsA作为再障治疗 的一线免疫抑制治疗(immunosuppressive therapy，IST)方案。《器官移植免疫抑制剂临床应用技术规范(2019版)》中也推荐P-ATG应用于移植物抗宿主病(graft versus host disease，GvHD)的治疗。
在此基础上，本发明使用低温乙醇法纯化新型冠状病毒猪免疫球蛋白，可产生以下有益效果：
(1)可获得新型冠状病毒免疫球蛋白，作为一种特异性针对新型冠状病毒的特效药物，具有极高的 临床使用价值。
(2)较之康复期血浆/血清、抗新型冠状病毒化药、抗新型冠状病毒中药等药物，纯化后的新型冠状 病毒免疫球蛋白，具有纯度高，安全性好，副反应小，疗效确切的特性。
(3)可实现大规模生产，利用低温反应罐每次可投入血浆50～200万毫升，易于工业化大规模生产。
(4)生产周期短，生产周期主要包括免疫、纯化、吸收、除病毒过滤和病毒灭活、半成品检定、分 装、成品检定等步骤，只需要约90天即可将成品入库，可快速稳定的获得大量制品。
(5)产品质量稳定，低温乙醇法反应条件较为温和，低pH环境有利于蛋白质溶解，蛋白纯度和单体 加双体含量较高，制品外观、性质均一，批间次差异较小。
(6)制备过程简单，操作者易于掌握。采用特定的免疫程序可稳定地获得具有高效价的免疫血浆/血 清，同时采用低温乙醇法生产，主要纯化全过程经3步即可完成，而且3步反应细节具有80％以上的相似 性；全过程涉及化学试剂8种，而且绝大多数溶液是在反应前集中配制，工艺过程相对简单，易于掌握。
(7)所用的原材料之一的乙醇安全无毒，不与其它成分发生化学反应，适合工业化生产，且容易进 行质量控制。
(8)乙醇具有良好的互溶性，能与水以任意比例混合；形成终产品前乙醇可通过超滤透析方法除去。
(9)低温及乙醇本身有抑制细菌生长的作用，避免生产过程中的污染；乙醇还具有去除和杀灭病毒 的效果，有助于提高制品的安全性。
(10)环保效果显著，低温乙醇法生产过程中排出的废液主要成分是乙醇，是低分子有机物，易于回 收再利用，也易于自然降解。
(11)社会效益效益显著，研究取得预期效果形成产业化后，能缓解国内市场暂无新型冠状病毒特效 药的局面，满足患者的需求。
采用本发明方法后，可获得纯化的新型冠状病毒免疫球蛋白，且通过三批工艺验证表明(详见实施例 3：三批低温乙醇法纯化新型冠状病毒猪免疫球蛋白)，免疫后猪血浆中和抗体EC50＞4000，与临床上康 复期血浆中和抗体水平500-1000相比，采用本方法进行免疫，可获得高效价血浆；纯化后的中和抗体EC50 值＞1000，中和抗体效价远高于《新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案》(试行第二版)中要求的IgG 抗体滴度(≥1:160)。，纯度＞95.0％，IgG单体与二聚体含量＞95.0％，说明采用低温乙醇法纯化工艺，可 获得高纯度、高效价、安全性良好的新型冠状病毒免疫球蛋白。新型冠状病毒免疫球蛋白在产品的稳定性、 病毒中和能力等各项参数指标上未见明显差异，说明本发明能适用于新型冠状病毒免疫球蛋白的实际生 产。
需要额外说明的是，其他的能够产生同样免疫效果的疫苗产品，也可以应用于本发明，通过实施本专 利的方法，制备获得合格的猪源性新型冠状病毒免疫球蛋白。
本发明采用低温乙醇法实现对新型冠状病毒动物血浆蛋白(特别是免疫球蛋白)的制备，是对用动物 血浆制备新型冠状病毒免疫球蛋白的新的尝试，试验和实际生产的结果都表明该方法有较多的优点，可极 大提升生物原料的利用率，有利于产品规模化生产，并产生良好的经济效益。。
附图说明
图1、本发明的工艺流程图。
图2、按照本发明工艺获得的三批样品的蛋白纯度图谱，2A：XG202008001批次样品，2B：XG202008002 批次样品，2C：XG202008003批次样品。
图3、按照本发明工艺获得的三批样品的蛋白纯度图谱，3A：XG202008001批次样品，3B：XG202008002 批次样品，3C：XG202008003批次样品。
具体实施方式
以下实施例中，因新型冠状病毒猪免疫球蛋白制品为非药典收载项目，其主要技术指标参考《中国药 典》2020年版三部《抗人T细胞猪免疫球蛋白成品规定》和新型冠状病毒中和抗体效价检测等方法与指标， 主要指标如下：
1.纯度不低于蛋白质总量的90.0％。
2.IgG单体与二聚体含量之和应不低于90.0％，多聚体含量应不高于5.0％。
3.效价EC50值>1000。
4.无菌检查为合格。
5.热原检查为合格。
一、纯度检测方法
依醋酸纤维素薄膜电泳法测定，应不低于蛋白质总量的90.0％。
二、分子大小分布检测方法
依分子排阻色谱法测定，IgG单体与二聚体含量之和应不低于90.0％，多聚体含量不高于5.0％。
三、新型冠状病毒免疫球蛋白效价检测方法
依细胞攻毒法、空斑法等方法检测免疫球蛋白抗病毒效价，效价EC50值>1000。
四、无菌检查法方法
依薄膜过滤法检查，应无菌生长。
五、热原检查法方法
用生理氯化钠溶液将供试品按1∶4稀释，注射剂量按家兔体重每1kg注射3mL，应符合规定。
实施例1、免疫程序的优化比较
本实施例中所用的疫苗为灭活疫苗原液，具体的灭活新型冠状病毒疫苗原液(疫苗原液的制备参见 CN202010559132.3)，其他的能够产生同样免疫效果的疫苗产品，也可以应用于本发明。
本实施例所用的佐剂为：弗氏完全佐剂。
设备：搅拌器。
一、接种方案的优化
1.按灭活新型冠状病毒抗原与弗氏完全佐剂1:1比例，配制免疫用抗原。
2.将实验用健康猪根据不同免疫程序进行分组，每组3头，按表1方式进行免疫，并采血进行中和抗 体浓度检测。
3.不同免疫程序完成后7天进行采血和血清中和抗体效价检测。
表1免疫程序分组与采样检测表
Figure BDA0002941165540000051
Figure BDA0002941165540000061
4.血清中和抗体检测结果见表2。
表2不同免疫程序中和抗体EC50效价表
Figure BDA0002941165540000062
Figure BDA0002941165540000071
到以下结论：
①两针法在二免后7天(28天)获得的最高中和抗体滴度均值为790.7，较三针法和五针法，所产生的 中和抗体滴度较低，因而不适用；
②三针法在三免后7天(49天)获得的最高中和抗体滴度均值为5613.3；
③五针法在四免后7天获得最高中和抗体滴度均值为9546.3，与三针法相比，其中和抗体浓度较高，随 后降低，在完成全部免疫后7天，其中和抗体滴度降低5109.6，降低至最高滴度的53.5％；
综上所述，考虑到抗原剂量和生产周期等综合因素，三针法为最优免疫程序。
二、不同抗原接种浓度的比较
材料：灭活新型冠状病毒疫苗，弗氏完全佐剂。
设备：搅拌器。
1.按灭活新型冠状病毒抗原与弗氏完全佐剂1:1的比例，配制免疫用抗原。
2.将实验用健康猪根据不同抗原免疫剂量进行分组，每组3头，按表3方式进行免疫，并采血进行中 和抗体浓度检测。
表3免疫剂量分组与采样检测表
Figure BDA0002941165540000072
3.血清中和抗体检测结果见表4。
表4不同免疫剂量中和抗体效价表
Figure BDA0002941165540000073
Figure BDA0002941165540000081
4.根据表4结果可以得到以下结论：
①各剂量组抗体滴度均在三免后7天(49天)达到峰值；
②高剂量组中中和抗体滴度最高，均值为16233.7，但免疫过程中猪多次出现精神沉郁、厌食、呕吐(黄 色、饲料色)、呼吸急促、体温升高的现象，因此判断此剂量过高，且此剂量所需抗原量较大成本较高， 因此该剂量不适用于大规模免疫生产；
③中剂量组抗体滴度较之低剂量组高，均值为5773.7，但所需抗原量为低剂量组的一倍，而抗体滴度 并未高于低剂量组一倍以上；
④低剂量组抗体均值为4235.3，与中剂量组效价比为1:1.36，其所需抗原量比为1:2。
综上所述，综合考虑确定采用低剂量组作为首选免疫剂量。在三免后14天(56天)出现明显下降，下 降幅度为三免后7天的一半以上，提示应在三免后7天～三免后14天范围内进行血浆采集，可获得较高滴度 的中和抗体。
通过上述研究确定了最终的免疫方式为：所述接种方案为三针法，免疫剂量为20-80μg/头，免疫间隔 为21天。
实施例2、三批低温乙醇法纯化新型冠状病毒猪免疫球蛋白
材料：新型冠状病毒猪血浆、95％乙醇、氯化钠、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、注射用水。
设备：冷冻离心机，pH计，搅拌器。
1. 8％乙醇制作：称量新型冠状病毒免疫猪血浆量，按血浆量加入20％～30％的生理盐水溶液，搅拌 均匀，调整混合溶液的pH值为7.00±0.50，再将混合液的温度降至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至 终浓度8％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
2.FⅠ沉淀分离：用低温冷冻离心机或压滤机分离出FⅠ沉淀废弃，收集上清液；
3. 25％乙醇制作：调整上清液的pH值为7.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇 至终浓度25％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
4.FⅡ+Ⅲ沉淀分离：用低温冷冻离心机或压滤机分离，沉淀为FⅡ+Ⅲ，上清液废弃；
5. 17％乙醇制作：用所述免疫血浆重量1.0～2.0倍预冷注射用水溶解FⅡ+Ⅲ沉淀，搅拌后调整到pH 值5.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终浓度17％，搅拌1～6小时后，停止搅拌 静置8～24小时；
6.FⅢ沉淀分离：用低温冷冻离心机或压滤机分离出FⅢ沉淀废弃，收集上清液；
所述步骤S3-4包括以下步骤：
7. 25％乙醇制作：用预冷注射用水将上清液稀释至所述免疫血浆量的1.0～2.0倍，加入固体氯化钠(0.0195％，wt)，调整混合溶液的pH值为7.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终 浓度25％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
8.FⅡ沉淀分离：用低温冷冻离心机或压滤机分离，沉淀为FⅡ，上清液废弃；
9.超滤透析：用所述免疫血浆量的0.2～0.5倍预冷注射用水溶解FⅡ沉淀，用1mol/L盐酸或1mol/L 氢氧化钠溶液调节溶解制品至pH4.00±0.30，超滤浓缩溶液至所述免疫血浆量的15％～30％；
10.配制：将滤液超滤浓缩，使蛋白含量为3.5％～5.5％，按浓缩液体积的5～10倍配制生理氯化钠溶 液，对浓缩液进行超滤透析，透析完毕用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调整pH至4.00±0.30，按终浓度 10-30g/L比例加入甘氨酸，搅拌使其溶解完全；
11.除菌及除病毒：将配制好的免疫球蛋白经除菌滤器过滤至容器中，并取样进行半成品检定；过滤 完毕将容器放置恒温环境中或容器自带控温系统，维持配制后的低pH，进行低pH孵放病毒灭活，温度为 24±2℃，孵放时间为24天，孵放至3、7、14、24天时，对制品外观进行检查，应为澄清无混浊状，孵放 完毕后，对制品进行DV20(20nm孔径滤膜)除病毒过滤。
12.半成品的检定：效价EC50值>1000；无菌检查应符合《中国药典》2020版三部的规定；热原检 查应符合《中国药典》2020版三部的规定。
13.分装：经过24天低pH孵放病毒灭活，并且半成品检定合格后，方可将制品分装，分装后留样做 成品检定。
14.成品检定：纯度不低于蛋白质总量的90.0％，IgG单体与二聚体含量之和应不低于90.0％，多聚体 含量应不高于5.0％，效价EC50值>1000，无菌检查应符合《中国药典》2020版三部的规定；热原检查应符 合《中国药典》2020版三部的规定；
14.进行成品检测结果见下表5及图2、图3：
表5三批新型冠状病毒猪免疫球蛋白检测结果表
Figure BDA0002941165540000091
15.根据表5结果可以得到以下结论：
本发明制备的新型冠状病毒猪免疫球蛋白的蛋白纯度均＞96.5％，单体加二聚体纯度均＞99.83％。采 用低温乙醇法可有效纯化合格的新型冠状病毒猪免疫球蛋白，其批间一致性良好，可用于大规模生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任 何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种抗COVID-19的猪源性免疫球蛋白的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1，使用灭活疫苗抗原免疫健康猪(Sus scrofa domesticus)，所述的健康猪的品系为长白猪、杜克猪、大约克夏猪；
S2，制备免疫血浆；
S3，低温乙醇法纯化猪源性免疫球蛋白中间品；
S4，制备猪源性免疫球蛋白半成品；
S5，制备猪源性免疫球蛋白成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤S1所述的免疫方法为：
使用疫苗免疫健康猪并监控免疫效果，免疫剂量10-100μg疫苗蛋白量/头，优选的，免疫剂量为10-30μg疫苗蛋白量/头，至免疫后猪血浆中新型冠状病毒的中和抗体检验合格时，采集猪血浆得所述免疫血浆。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1所述的免疫方法为：
使用免疫佐剂与疫苗原液等体积配比混匀后，进行多次免疫，所述的剂量为灭活疫苗中的蛋白量；
优选的，在第0天、21天、42天分别免疫三次(低剂量抗原)；
优选的，所述的免疫佐剂为弗氏完全佐剂；
优选的，所述的疫苗原液为按照CN202010559132.3所述方法制备的疫苗原液。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
步骤S2所述的制备免疫血浆的方法为：
经检验合格后，对经步骤S1免疫完毕后第7天的健康猪进行颈动脉插管放血并采集血浆，
所述的采集血浆的方法为：采用预先加入抗凝剂的无菌血浆袋收集，然后400×g离心10分钟，将上清转移至另一无菌血浆袋中-20℃保存；
所述的检验合格的标准：抗体中和滴度EC50＞4000。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
步骤S3所述的猪源性免疫球蛋白中间品的制备，采用四步法进行纯化，所述四步法包括以下步骤：
S3-1，对免疫血浆进行分离，获得初步纯化的FⅡ+Ⅲ上清液和待废弃的FⅠ沉淀；
S3-2，对初步纯化FⅡ+Ⅲ上清液进行分离，获得FⅡ+Ⅲ沉淀和待废弃的上清液；
S3-3，将FⅡ+Ⅲ沉淀溶解后进行分离，获得FⅡ上清液和待废弃的FⅢ沉淀；
S3-4，对FⅡ上清液进行分离，得到精制FⅡ沉淀(中间品)和待废弃的上清液；
所述步骤S3-1包括以下步骤：
S3-1-1(8％乙醇制作)，称量新型冠状病毒免疫猪血浆量，按血浆量加入20％～30％的生理盐水溶液，搅拌均匀，调整混合溶液的pH值为7.00±0.50，再将混合液的温度降至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终浓度8％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-1-2(FⅠ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离出FⅠ沉淀废弃，收集上清液；
所述步骤S3-2包括以下步骤：
S3-2-1(25％乙醇制作)，调整上清液的pH值为7.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终浓度25％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-2-2(FⅡ+Ⅲ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离，沉淀为FⅡ+Ⅲ，上清液废弃；
所述步骤S3-3包括以下步骤：
S3-3-1(17％乙醇制作)，用所述免疫血浆重量1.0～2.0倍预冷注射用水溶解FⅡ+Ⅲ沉淀，搅拌后调整到pH值5.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终浓度17％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-3-2(FⅢ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离出FⅢ沉淀废弃，收集上清液；
所述步骤S3-4包括以下步骤：
S3-4-1(25％乙醇制作)，用预冷注射用水将上清液稀释至所述免疫血浆量的1.0～2.0倍，加入固体氯化钠(0.0195％，wt)，调整混合溶液的pH值为7.00±0.50，并降温至-4.0℃±-2.0℃，加入预冷的95％乙醇至终浓度25％，搅拌1～6小时后，停止搅拌静置8～24小时；
S3-4-2(FⅡ沉淀分离)，用低温冷冻离心机或压滤机分离，沉淀为FⅡ，上清液废弃；
沉淀FⅡ即为猪源性免疫球蛋白中间品。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
步骤S4所述猪源性免疫球蛋白半成品的制备方法为：
S4-1(超滤透析)，用所述免疫血浆量的0.2～0.5倍预冷注射用水溶解FⅡ沉淀，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节溶解制品至pH4.00±0.30，超滤浓缩溶液至所述免疫血浆量的15％～30％；
S4-2(配制)，将滤液超滤浓缩，使蛋白含量为3.5％～5.5％，按浓缩液体积的5～10倍配制生理氯化钠溶液，对浓缩液进行超滤透析，透析完毕用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调整pH至4.00±0.30，按终浓度10-30g/L比例加入甘氨酸，搅拌使其溶解完全；
S4-3(除菌及除病毒)，将配制好的免疫球蛋白经除菌滤器过滤至容器中，并取样做半成品检定；过滤完毕将容器放置恒温环境中或容器自带控温系统，维持配制后的低pH，进行低pH孵放病毒灭活，温度为24±2℃，孵放时间为24天，孵放至3、7、14、24天时，对制品外观进行检查，应为澄清无混浊状，孵放完毕后，对制品进行DV20(20nm孔径滤膜)除病毒过滤，即得所述猪源性免疫球蛋白半成品。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S4所述的制备COVID-19猪源性免疫球蛋白的方法还包括：
S4-4半成品的检定：取样做半成品检定，效价EC50值>1000；
8.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，
步骤S5所述的猪源性免疫球蛋白成品的制备方法为：
S5-1(分装)，经过24天低pH孵放病毒灭活，并且半成品检定合格后，进行制品分装；
S5-2(成品检定)，取样做成品检定，纯度不低于蛋白质总量的90.0％，IgG单体与二聚体含量之和应不低于90.0％，多聚体含量应不高于5.0％，效价EC50值>1000，无菌检查应符合《中国药典》2020版三部的规定；热原检查应符合《中国药典》2020版三部的规定；
9.由权利要求1-8任一所述的方法制备得到的猪源性免疫球蛋白产品。
10.权利要求9所述的猪源性免疫球蛋白产品在制备抗新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的药物中的应用，所述的药物包含：治疗有效量的所述猪源性免疫球蛋白产品及必要的药用辅料。
11.权利要求9所述的猪源性免疫球蛋白产品在制备抗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的药物中的应用，所述的药物包含：治疗有效量的所述猪源性免疫球蛋白产品及必要的药用辅料。
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