MX2009002909A

MX2009002909A - Vacuna de ipv-dpt.

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Publication number: MX2009002909A
Application number: MX2009002909A
Authority: MX
Inventors: Shinobu Abe; Bunsichi Simizu
Original assignee: Japan Poliomyelitis Res Inst
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2009-03-31
Also published as: AU2007305595A1; CA2664799C; WO2008044611A1; US8753646B2; RU2009116273A; RU2447898C2; HK1129836A1; EP2075005A1; CN101522209A; CA2664799A1; US20100021497A1; AU2007305595B2; EP2075005B1; JP4874339B2; CN103223163A; KR101617464B1; ZA200902155B; KR20150080643A; NZ574776A; JP2011201913A

Abstract

Se describe un método para la preparación de una vacuna mixta que comprende una cepa Sabin inactivada del poliovirus, un antígeno protector de B. pertussis, un toxoide de la difteria y un toxoide del tétanos, que involucra el paso de producir una cepa Sabin del poliovirus que tiene un alto título. Se describe específicamente un método para la preparación de una vacuna mixta, que comprende el paso de cultivar una célula Vero que va a ser inoculada con una cepa Sabin del poliovirus, en presencia de aproximadamente 4 a 6 g/l de un microportador. El método es útil para producir una vacuna mixta que contiene un poliovirus inactivado de la cepa Sabin, eficientemente.

Description

VACUNA DE IPV-DPT Campo de la Invención La presente invención se refiere a una vacuna combinada, en particularmente una vacuna combinada que tiene una cepa Sabin inactivada del poliovirus (sIPV) , y un método de preparación de la misma. Antecedentes de la Invención La polio es una enfermedad infecciosa provocada por un poliovirus. Los poliovirus infectan a los humanos mediante una ruta oral, proliferan en el tracto intestinal, y entran en el sistema nervioso central a través de la sangre. La proliferación dentro de las neuronas motoras mayores de los poliovirus que han entrado al sistema nervioso central, provocan degeneración neuronal y necrosis, disparando una parálisis flácida aguda en las extremidades. Además, cuando el poliovirus afecta el centro respiratorio medular, puede resultar la muerte por parálisis respiratoria. Las vacunas para la polio son ampliamente utilizadas para suprimir el inicio de la poliomielitis que dispara tales síntomas severos . Se utilizan dos tipos de vacunas para la polio, vacunas orales vivas para la polio y vacunas para la polio inactivadas . Las vacunas para la polio vivas, orales, son vacunas que usan cepas atenuadas del poliovirus (cepas Ref.: 199720 Sabin) . Las cepas atenuadas del poliovirus que son administradas oralmente provocan infecciones normales. Los poliovirus provenientes de las vacunas para la polio vivas, orales, se desarrollan bien en los intestinos, dando como resultado la formación e inmunidad localizada dentro de los intestinos. Además, cuando los poliovirus provenientes de una vacuna para la polio viva, oral, entran a la sangre y provocan viremia, esto también estimula la producción de anticuerpos dentro de la sangre. Sin embargo, debido a que la habilidad a las cepas atenuadas de los poliovirus para proliferar dentro del sistema nervioso central es muy débil, éstas en general no provocan parálisis. En el cuerpo de los inoculados, los poliovirus provenientes de la vacuna para la polio viva, oral, se multiplican y son excretados en las heces aproximadamente 4 a 6 semanas después de la inoculación. Los virus excretados infectarán a las personas alrededor de los inoculados quienes tienen una inmunidad débil y ninguna inmunidad hacia la polio, confiriendo inmunidad o mostrando un efecto potenciador de la misma manera que en el inoculado. Sin embargo, en el curso del crecimiento repetido dentro del cuerpo del inoculado o en el curso del crecimiento repetido en el cuerpo de una persona infectada por los virus excretados, una cepa atenuada del poliovirus proveniente de una vacuna para la polio viva, oral, algunas veces da origen a mutaciones en un dirección altamente virulenta. En casos muy raros, tales mutantes provocan parálisis asociada con la vacuna . Una vacuna para la polio inactivada es una vacuna que ha perdido su infectividad por inactivación del poliovirus con formalina. Debido a que una vacuna para la polio inactivada no se multiplica dentro del cuerpo del inoculado ni tampoco infecta a las personas alrededor del inoculado, ésta no provocará parálisis asociada con la vacuna. Las cepas altamente virulentas han sido utilizadas hasta la fecha para preparar vacunas inactivadas para la polio, pero han sido realizados también avances recientemente en el desarrollo de cepas atenuadas (cepas Sabin) {Biologicals 34, 151-154 (2006); Dev. Bil. Basel . Karger 105, 164-169 (2001), Clinical Virology 30, No. 5, 336-343 (Diciembre 2002) . El crecimiento algo más pobre de las cepas atenuadas (cepas Sabin) que las cepas altamente virulentas han sido consideradas como un inconveniente. Las vacunas que contienen un antígeno protector de Bordetella pertussis, un toxoide de la difteria y un toxoide el tétanos, son ampliamente utilizados como vacunas combinadas de difteria-tétanos-pertusis . Las vacunas polivalentes compuestas de una vacuna de pertusis acelular, un toxoide de la difteria, un toxoide del tétanos, y los poliovirus inactivados, son conocidos (Traducción Japonesa Publicada de una Solicitud del PCT No. 2000-504032) . Las células Vero son células de paso provenientes de ríñones de monos verdes. Debido a que estas células tienen una amplia sensibilidad hacia diversos tipos de virus, éstas son ampliamente utilizadas en el cultivo de virus. Un método para preparar una vacuna del enterovirus tipo 71 ha sido reportada en la literatura e incluye el cultivo de las células Vero sobre un microportador , y el uso de las células Vero cultivadas para desarrollar enterovirus 71 ( "Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development" , por Suh-Chin Wu, et al.: Vaccine 22, 3858-3864 (2004)). Las condiciones generales de cultivo de células que utilizan un microportador, han sido también descritas (Microcarrier cell cultura principies & methods . Pharmacia LKB, Biotechnology, 1988) . Breve Descripción de la Invención Bajo tales circunstancias, ha existido un deseo para un proceso para producir una vacuna combinada que contenga una cepa Sabin inactivada del poliovirus (slPV) y también que contenga un antígeno protector de B. pertussis, un toxoide de la difteria y un toxoide del tétanos (DPT) , cuyo proceso incluye el paso de preparar un poliovirus de la cepa Sabin de alto título.

Los inventores han conducido investigaciones extensas con el fin de resolver el problema anterior. Como resultado, los inventores han descubierto que un poliovirus de la cepa Sabin de alto título puede ser preparada mediante el cultivo en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/litro de un microportador , las células Vero inoculadas con una cepa Sabin del poliovirus. Después de conducir investigaciones repetidas con base en estos hallazgos, los inventores al final llegaron a la presente invención. La presente invención proporciona de este modo: (1) Un proceso para preparar una vacuna combinada que contiene : (A) una cepa Sabin inactivada del poliovirus, (B) un antígeno protector de Bordetella pertussis, (C) un toxoide de la difteria, y (D) un toxoide del tétanos, el proceso comprende (a) un paso de cultivar, en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 de un microportador, las células Vero que van a ser inoculadas con una cepa Sabin del poliovirus, (2) El proceso de acuerdo a (1) anterior, que comprende además : (b) un paso de infectar las células Vero con una cepa Sabin de poliovirus, (c) un paso de permitir que el poliovirus prolifere, (d) un paso de recuperación de un fluido viral que contiene el poliovirus, y (e) un paso de inactivación del poliovirus, (3) El proceso de conformidad con (1) anterior, en donde el microportador tiene una concentración de aproximadamente 5 g/i, (4) El proceso de conformidad con (1) anterior, en donde el microportador es un microportador de dextrano, (5) El proceso de conformidad con (1) anterior, en donde el paso de desarrollar la células Vero (paso (a) ) es llevado a cabo en una escala de al menos aproximadamente 3 litros, (6) El proceso de conformidad con (1) anterior, en donde el paso de desarrollar las células Vero (paso (a) ) es llevado a cabo en una escala de al menos aproximadamente 30 litros, (7) El proceso de conformidad con (2) anterior, porque comprende además : (d-2) un paso de purificar el fluido viral (8) El proceso de conformidad con (7) anterior, en donde el paso de purificación (paso d-2) ) comprende: (i) la formación del fluido viral recuperado en el paso (d) en una pelotilla mediante ultracentrifugación; (ii) la sonicación de una re-suspensión de la pelotilla; y (üi) la purificación mediante cromatografía en columna (9) El proceso de conformidad con (8) anterior, en donde la purificación mediante cromatografía en columna (iii) es llevada a cabo solo una vez, (10) Una vacuna preparada mediante el proceso de conformidad con (1) anterior, (11) El proceso de conformidad con (1) anterior, en donde el paso de cultivo de las células Vero (paso (a) ) es llevado a cabo en una escala de al menos aproximadamente 3 litros (11) El proceso de conformidad con (1) anterior, en donde el paso de cultivo de las células Vero (paso (a) ) es llevado a cabo en una escala de al menos aproximadamente 30 litros Mediante el cultivo, en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 de un microportador , las células Vero que van a ser inoculadas con una cepa Sabin del poliovirus, es posible obtener el poliovirus de la cepa Sabin de alto título. Mediante el uso del poliovirus de la cepa Sabin de alto título, puede ser eficientemente producido un poliovirus de cepa Sabin inactivada. Por lo tanto, un proceso para producir una vacuna combinada que incluye el paso de cultivo, en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 de un microportador, las células Vero que van a ser inoculadas con una cepa Sabin del poliovirus (el proceso de producción de la presente invención) es útil como un proceso para la producción eficiente de vacunas combinadas que contienen una cepa Sabin inactivada del poliovirus. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es una gráfica que muestra las curvas de crecimiento de las células Vero en un cultivo de las células Vero por un método del microportador. Aquí, "3L" indica un número de células inicial de aproximadamente 2 x 105 células/ml (baja concentración) y 3 g/1 del microportador. "3H" indica un número de células inicial de aproximadamente 10 x 105 células/ml (alta concentración) y 3 g/1 del microportador. "5L" indica un número de células inicial de aproximadamente 2 x 105 células/ml (baja concentración) y 5 g/1 del microportador. "5H" indica un número de células inicial de aproximadamente 10 x 105 células/ml (alta concentración) y 5 g/1 de microportador. La Figura 2 es una gráfica que muestra los títulos de infectividad (títulos del virus) de poliovirus tipo I obtenido en células Vero cultivadas bajo células Vero cultivadas bajo diversas condiciones. Aquí, "3L" representa los poliovirus del tipo I obtenidas en células Vero cultivadas a partir de un número de células iniciales de aproximadamente 2 x 105 células/ml (baja concentración) sobre 3 g/1 del microportador. "5L" indica el poliovirus del tipo I obtenido en células Vero cultivadas a partir de un número de células iniciales de aproximadamente 2 x 105 células/ml (baja concentración) sobre 5 g/1 del microportador. "5H" indica el poliovirus del tipo I obtenido en células Vero cultivadas a partir de un número de células iniciales de aproximadamente 10 x 105 células/ml (alta concentración) sobre 5 g/1 del microportador . "Ref" indica los poliovirus del tipo I desarrollados utilizando células de riñon de mono verde . Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona un proceso para producir una vacuna combinada que contiene una cepa Sabin inactivada del poliovirus (sIPV) junto con un antígeno protector de B . pertussis, un toxoide de difteria y un toxoide del tétanos (DPT) , cuyo proceso incluye el paso de producir una cepa Sabin de alto titulo del poliovirus. La invención es descrita más completamente adelante. 1. Poliovirus de la cepa Sabin inactivado: (1) Poliovirus de la cepa Sabin En la presente especificación, "cepa Sabin del poliovirus" se refiere a una cepa del poliovirus derivado de una cepa atenuada del poliovirus aislada por el Dr. Albert B.

Sabin (ver por ejemplo, Sabin, Ab, Boulger, LR: "History of Sabin attenuated poliovirus oral live vaccine strains", J.

Biol. Satandard 1, 115-118 (1973)) . Los poliovirus de la cepa Sabin incluye las cepas Sabin tipo I del poliovirus, las cepas Sabin tipo II del poliovirus y las cepas Sabin tipo III del poliovirus. Los ejemplos de cepas Sabin tipo I del poliovirus incluyen las cepas LSc y 2ab. Los ejemplos de cepa Sabin tipo II del poliovirus incluyen las cepas P712, Ch y 2ab. Los ejemplos de cepas Sabin tipo III del poliovirus incluyen las cepas León y 12aib. (2) Inactivación En la presente especificación "inactivación" del virus se refiere a una eliminación de la habilidad infecciosa de un virus. Los métodos de inactivación incluyen, pero no están limitados a, métodos físicos (por ejemplo, métodos que involucran el uso de radiación con rayos x, calor o ultrasonido) y métodos químicos (por ejemplo, métodos que involucran el uso de formalina, mercurio, alcohol o cloro) . La inactivación de poliovirus puede ser llevada a cabo mediante un método conocido (ver por ejemplo, Biologicals 34, 151-154 (2006)). Por ejemplo, la inactivación puede llevarse a cabo mediante tratamiento del poliovirus con formalina. (3) Inmunogenicidad de las cepas Sabin inactivadas del poliovirus Dos antígenos virales conocidos como antígenos D y antígenos C están en general presentes en mezcla dentro de las cepas Sabin inactivadas del poliovirus. Los antígenos D son partículas virales completas . Los anticuerpos para los antígenos D tienen habilidad para neutralizar la infectividad de los virus vivos, y funcionan con anticuerpos protectores. Los antígenos C, llamados partículas defectuosas, son partículas que carecen del ácido nucleico AR del núcleo y parte de las proteínas virales de una partícula viral completa; estas partículas son huecas en el centro. Los anticuerpos para los antígenos C tienen poca o ninguna habilidad para neutralizar la infectividad de los virus vivos. Por lo tanto, cuando una cepa Sabin inactivada del poliovirus va a ser utilizada como una vacuna, son requeridos los antígenos D. Existen tres tipos de poliovirus: tipo I, tipo II, y tipo III. La inmunidad hacia la infección por el poliovirus es específica para tres tipos de virus - tipo I, tipo II, y tipo III; la inmunidad cruzada que puede existir entre los tipos es mínima. Los antígenos D de las cepas Sabin tipo I, tipo II, y tipo III inactivadas del poliovirus tienen inmunogenicidades capaces de producir anticuerpos neutralizadores para, respectivamente, las cepas silvestres tipo I, tipo II, y tipo III (altamente virulentas) del poliovirus. Las inmunogenicididades de los antígenos D de las cepas de Sabin inactivadas del poliovirus difieren para cada uno de los tipos I, II, y III; por lo tanto, la cantidad del antígeno D requerido para producir suficiente anticuerpo para neutralizar las cepas silvestres tipo I, tipo II, y tipo III (altamente virulentas) del poliovirus difiere de acuerdo al tipo de virus. Como se mencionó anteriormente, existen tres tipos de poliovirus - tipo I, tipo II, y tipo III, cada uno de los cuales provoca la misma poliomielitis. Por lo tanto, cuando una cepa Sabin inactivada del poliovirus es utilizada como una vacuna (vacuna inactivada para la poliomielitis) , ésta debe tener una inmunogenicidad capaz de producir suficientes anticuerpos para neutralizar las cepas silvestres (cepas altamente virulentas) de los poliovirus de cada uno de los tipos I, II, y III. Además, es deseable que la inmunogenicidad sea cercana a la inmunogenicidad de las vacunas inactivadas para la poliomielitis provenientes de cepas altamente virulentas que han sido utilizadas hasta la fecha. Para mostrar tal inmunogenicidad, la vacuna contiene preferentemente las cepas Sabin inactivadas del tipo I, tipo II, y tipo III del poliovirus en una proporción, en peso de los respectivos antígenos D, preferentemente de (2 a 4) (80 a 120): (80 a 120), y lo más preferentemente (de aproximadamente 3) (aproximadamente 100) : (aproximadamente 100). Las cepas inactivadas Sabin del poliovirus utilizadas en la presente invención, al incluir los tipo I, tipo II, y tipo III en una proporción especifica como lo anterior, muestran una inmunogenicidad similar a agüella de las vacunas inactivas para la poliomielitis provenientes de cepas altamente virulentas (por ejemplo, la vacuna Sauk) . 2. Producción de las cepas Sabin inactivadas del poliovirus Las cepas Sabin inactivadas del poliovirus, adecuadas para el uso en la presente invención, pueden ser producidas mediante el método descrito más adelante . Primeramente, las células Vero son cultivadas en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 del microportador , con lo cual dan las células para el cultivo del poliovirus. Las células del cultivo de poliovirus resultante son inoculadas con virus semilla (poliovirus de las cepa Sabin) y los virus son cultivados, produciendo los poliovirus de las cepas Sabin que han proliferado. Los poliovirus de las cepas Sabin resultantes son inactivados para dar poliovirus de la cepa Sabin, inactivados. Los poliovirus de la cepa Sabin inactivados pueden ser obtenidos, los cuales corresponden a los virus semilla utilizados (cepas Sabin tipo I, cepas Sabin tipo II, o cepas Sabin tipo III) . Los virus pueden ser concentrados y/o purificados antes de o después de la inactivación del virus . Como se mencionó anteriormente, la vacuna inactivada para la poliomielitis debe tener una inmunogenicidad capaz de producir suficientes anticuerpos para neutralizar las cepas silvestres (cepas altamente virulentas) de cada uno de los tipos I, II, y III. Sin embargo, los antígenos D de las cepas Sabin inactivadas del poliovirus tienen inmunogenicidades que difieren entre los tipos I, II y III. En consecuencia, la vacuna inactivada para la poliomielitis que posee una inmunogenicidad capaz de producir suficientes anticuerpos para neutralizar las cepas de tipo silvestre (cepas altamente virulentas) de cada uno de los tipos I, II y III, pueden ser obtenidas mediante el ajuste de las cantidades de los poliovirus inactivados tipo I, tipo II, y tipo III, contenidos. (Células Vero) Las células Vero son células de paso provenientes de los ríñones de los monos verdes {Cercopi thecus aethiops), y están depositadas en American Type Culture Collection (ATTC) . Las células Vero son ampliamente utilizadas para cultivar virus debido a que éstas muestran una morfología fibroblástica , tienen una amplia sensibilidad a diversos tipos de virus y son fáciles de mantener como células de paso. Las células Vero que son conocidas son disponibles de la ATCC e incluyen los Nos. del ATCC CCL-81 y CRL-1587. (Microportador ) En esa especificación, "microportador" se refiere a un portador que tiene superficies a las cuales se adhieren las células, y hacen posible que el cultivo celular sea llevado a cabo en un estado suspendido dentro de un medio líquido. El microportador no está sujeto a ninguna limitación particular con respecto al material, a la forma y al tamaño, con la condición de que éste sea un portador a la superficie del cual las células se adhieren, y que hace posible que el cultivo celular sea llevado a cabo en un estado suspendido dentro de un medio líquido. Los ejemplos del material microportador incluyen dextrano, gelatina, colágeno, poliestireno, polietileno, poliacrilamida , vidrio y celulosa. La celulosa es preferida como el material microportador. Los ejemplos de la forma del microportador incluyen formas esféricas (esferas) y discoidales. El microprotador tiene preferentemente una forma esférica. El microportador esférico tiene un tamaño de, por ejemplo, aproximadamente 0.01 a aproximadamente 1 mm, preferentemente de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.5 mm, y lo más preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.3 mm. El microportador puede ser poroso. Los ejemplos de microportadores esféricos que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen Cytodex 1 (nombre comercial), Cytodex 3 (nombre comercial) y Cytopore (nombre comercial) (todos los productos de GE Healthcare Biosciences ) . Los ejemplos de microportadores discoidal incluyen Cytoline 1 (nombre comercial) , Cytoline 2 (nombre comercial) (ambos productos de GE Healthcare Biosciences ) . Los ejemplos de microportadores porosos incluyen Cytopore (nombre comercial) , Cytoline 1 (nombre comercial) y Cytoline 2 (nombre comercial) (todos los productos de GE Healthcare Biosciences) . El microportador utilizado en la presente invención es lo más preferentemente un microportador esférico de dextrano. El microportador esférico de dextrano es preferentemente Cytodex 1 (nombre comercial) , Cytodex 3 (nombre comercial) o Cytopore (nombre comercial) , más preferentemente Cytodex 1 (nombre comercial) o Cytodex 3 (nombre comercial) , y lo más preferentemente Cytodex 1 (nombre comercial) . (Cultivo de células Vero) En la presente invención, las células Vero son desarrolladas mediante cultivo en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 del microportador. La concentración del microportador es preferentemente de aproximadamente 4.5 g/1 a aproximadamente 5.5 g/1, y más preferentemente de aproximadamente 5 g/1. El paso de crecimiento de las células Vero anteriormente descrito es llevado a cabo en una escala, en términos del volumen líquido, preferentemente de al menos 3 litros, más preferentemente al menos 30 litros, y lo más preferentemente al menos 150 litros. El paso de desarrollo o crecimiento de las células Vero es llevado a cabo en una escala en general no mayor de 1,000 litros. Cuando las células Vero son cultivadas en presencia de un microportador , el medio de cultivo utilizado puede ser, por ejemplo, medio ME que contiene de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20% en volumen de suero de ternera o suero fetal bovino {Science, 122, 501 (1952)), medio DME {Virology 8, 396 (1959)), medio RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)) o medio 199 {Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)) . El medio de cultivo es preferentemente un medio DME, más preferentemente un medio DME que contiene suero de ternera, y lo más preferentemente un medio DME que contiene aproximadamente 5% en volumen de suero de ternera. El medio puede, si es necesario, ser cambiado durante el periodo de cultivo celular. El pH es preferentemente de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8, más preferentemente de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5, y lo más preferentemente de aproximadamente 7. El cultivo es típicamente llevado a cabo desde aproximadamente 35SC hasta aproximadamente 40 SC por un periodo de aproximadamente 5 a 9 días. Si es necesario, puede ser llevada a cabo la aireación y la agitación durante el cultivo. La concentración de oxígeno disuelto (DO) al tiempo de cultivo de las células es preferentemente de aproximadamente 60 hasta aproximadamente 90%, más preferentemente de aproximadamente 70 hasta aproximadamente 80%, y lo más preferentemente aproximadamente de 75%. El número de células Vero en el medio al inicio del cultivo en presencia del microportador (número inicial de células) puede ser establecido como sea apropiado para factores tales como el tipo de medio, el tipo del microportador, la escala de cultivo. El número inicial de células es preferentemente de 2 x 104 células/ml a 10 x 105 células/ml, y lo más preferentemente de 2 x 105 células/ml hasta 10 x 105 células/ml. (Cultivo del poliovirus) El cultivo del poliovirus puede ser llevado a cabo mediante la inoculación y de este modo la infección de las células Vero cultivadas, con una cepa Sabin del poliovirus (virus semilla) , y cultivando el poliovirus dentro de las células. El cultivo de las células infectadas puede ser llevado a cabo de la misma manera que se describió anteriormente para el cultivo de células Vero. El medio utilizado para el cultivo del poliovirus es preferentemente un medio 199, más preferentemente un medio 199 que contiene bicarbonato de sodio, y lo más preferentemente un medio 199 que contiene 0.3% p/v de carbonato de sodio. La temperatura de incubación durante el cultivo del virus es preferentemente de aproximadamente 30aC hasta aproximadamente 3 8aC, más preferentemente de aproximadamente 32 2 C hasta aproximadamente 3 6 S C , y lo más preferentemente de aproximadamente 332C hasta aproximadamente 3 52C. El periodo de cultivo del virus es preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 días, más preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 días, y lo más preferentemente de aproximadamente 3 días. El cultivo del virus puede ser llevado hasta la finalización utilizando los efectos citopáticos del poliovirus (redondeo de las células infectadas por el poliovirus, y desprendimiento de las células del microportador) como el indicador. Una cepa Sabin del poliovirus que ha sido cultivada utilizando células de riñon de cultivo primario, de mono verde, pueden ser empleadas como el virus semilla. (Recuperación del fluido viral que contiene poliovirus) Después de la terminación del cultivo del virus, el microportador es eliminado y el fluido viral que contiene el poliovirus (algunas veces denominado en la presente como "fluido del poliovirus") es recuperado. La eliminación del microportador puede ser llevada a cabo por medio de, por ejemplo, una malla de Teflón (tal como una que tiene un tamaño de poro de 120 um) . Debido a que los poliovirus permanecen presentes (adheridos) al microportador dejado sobre la malla, estos poliovirus remanentes pueden ser recuperados mediante enjuague con, por ejemplo, el medio de cultivo de virus. El fluido de poliovirus resultante puede ser filtrado utilizando una membrana de filtro (por ejemplo, una membrana de filtro de 0.2 µp? o similar para eliminar los desechos celulares . El fluido del poliovirus puede ser concentrado y/o purificado antes o después de la inactivación. Los ejemplos ilustrativos del método de concentración incluyen ultraf iltración, ultracentrifugacion y diálisis. El método de concentración es preferentemente ultrafiltración o ultracentrifugacion. Es más preferible llevar a cabo la ultrafiltración y la ultracentrifugacion, y aún más preferible llevar a cabo la ultrafiltración, seguida por ultracentrifugacion. La membrana utilizada en la ultrafiltración puede ser una membrana de ultrafiltración comúnmente empleada para la concentración de virus. La membrana de ultrafiltración tiene un corte de peso molecular que es preferentemente de aproximadamente 100 kDa . La membrana de ultrafiltración es preferentemente elaborada de un material tal como polietersulfona . La concentración del poliovirus mediante ultracentrifugacion puede ser llevada a cabo al someter el fluido del poliovirus a 4 horas de centrifugación a 4aC y 100,000 g para formar una pelotilla. La pelotilla puede ser re-suspendido en, por ejemplo, un amortiguador de fosfato. Es también posible romper la masa de los virus agregados mediante sonicación de la re-suspensión de la pelotilla. La sonicación puede ser llevada a cabo utilizando un aparato comercialmente disponible, tal como Insonator Modelo 200M (Kubota) . Las condiciones de sonicación deben ser suficientes para romper la masa de los virus agregados, y pueden ser seleccionadas como sea apropiado para factores tales como el recipiente utilizado en la sonicación, la salida de ultrasonido y la concentración de la re-suspensión. Las condiciones de sonicación son ejemplificadas mediante tratamiento a 200 W por un periodo de 3 a 10 minutos. Aún cuando se lleve a cabo tal sonicación, la cepa Sabin del poliovirus no pierde su inmunogenicidad, haciendo posible que ésta sea ventajosamente utilizada como una vacuna para el poliovirus . Los métodos de purificación incluyen, pero no están limitados a, métodos que utilizan las características físicas de la sustancia que es purificada, tal como el tamaño, la densidad y el coeficiente de sedimentación, y los métodos que utilizan reacciones químicas o fisicoquímicas (por ejemplo, adsorción-desorción) . Los ejemplos ilustrativos de los métodos de purificación incluyen centrifugación en gradiente de densidad, filtración (incluyendo ultrafiltración) , cromatografí en columna de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de filtración en gel y desplazamiento salino. El método de purificación es preferentemente cromatografía en columna, más preferentemente cromatografía en columna de intercambio iónico, y lo más preferentemente cromatografía en columna de DEAE-intercambio iónico. El número de veces en que la purificación es llevada a cabo mediante cromatografía en columna, no está sujeto a ninguna limitación particular. Es decir, la purificación mediante cromatografía en columna puede ser llevada a cabo repetidamente hasta que se logre la pureza requerida. Sin embargo, desde el punto de vista de eficiencia de producción y otras consideraciones, es preferible llevar a cabo tal purificación en tan pocos pasos como sea posible. La concentración y la purificación son preferentemente llevadas a cabo mediante la formación del fluido del poliovirus en una pelotilla mediante ultracentrifugación, sonicación, re-suspensión de la pelotilla resultante, luego purificación mediante cromatografía en columna. Además, desde el punto de vista de eficiencia de producción, es preferible llevar a cabo la purificación mediante cromatografía en columna únicamente una vez. Al llevar a cabo la formación del fluido del poliovirus en una pelotilla mediante ultracentrifugación, la sonicación de una resuspensión de la pelotilla y la purificación mediante cromatografía en columna únicamente una vez, el fluido del poliovirus puede ser eficiente y adecuadamente concentrado y purificado. (Inactivación del poliovirus) La inactivación de poliovirus puede ser llevada a cabo mediante el método comúnmente empleado. Específicamente, el poliovirus puede ser inactivado mediante la adición de un inactivador al fluido del poliovirus, y con esto efectuar una reacción entre el poliovirus y el inactivador. El inactivador es preferentemente formalina. Las condiciones de inactivación no están sujetadas a ninguna limitación particular, siempre y cuando el poliovirus sea inactivado. Para evitar la presencia residual de los poliovirus insuficientemente inactivados, el periodo de tratamiento de inactivación es en general de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces, preferentemente de aproximadamente 2 . 5 a aproximadamente 3 . 5 veces, y más preferentemente de aproximadamente 3 veces, la longitud del periodo para el cual ha sido confirmada la inactivación del poliovirus . Por ejemplo, cuando se utiliza formalina como el inactivador, la cantidad de adición es preferentemente de aproximadamente 0 . 001 hasta aproximadamente 0 . 1 % p/v, más preferentemente de aproximadamente 0 . 005 hasta aproximadamente 0 . 05% p/v, y lo más preferentemente aproximadamente 0 . 1% p/v. La temperatura de inactivación es lo más preferentemente de aproximadamente 372C. El periodo de inactivación puede variar también dependiendo del tipo de inactivador, la concentración del inactivador, y la temperatura de inactivación. Por ejemplo, cuando aproximadamente 0.01% p/v de formalina es utilizado como el inactivador, y la temperatura de inactivación es de aproximadamente 372C, el periodo de inactivación es preferentemente de aproximadamente 8 hasta aproximadamente 16 días, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 14 días y lo más preferentemente aproximadamente 12 días. Cuando aproximadamente 0.01% p/v de formalina es utilizado y el tiempo de inactivación es de aproximadamente 37 SC, los poliovirus de la cepa Sabin son en general inactivados dentro de 4 días. 3. Toxoide de la difteria, antígeno protector de B. pertussis y toxoide tetánico (DPT) El antígeno protector de B. pertussis, el toxoide de la difteria y el toxoide del tétanos utilizados en la presente invención no están sujetos a ninguna limitación particular. El antígeno protector de B. pertussis, el toxoide de la difteria y el toxoide del tétanos son comercialmente disponibles como vacunas combinadas de difteria-pertussis-tétanos (tales como aquellas fabricadas por Takeda Chemical Industries, Ltd., The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University (Biken) , y the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute (Kaketsuken) ) .

Alternativamente, el antigeno protector de B. pertussis, el toxoide de la difteria y el toxoide del tétanos pueden ser obtenidos mediante métodos conocidos. Específicamente, el antígeno protector de B. pertussis puede ser obtenido mediante, por ejemplo, extracción, aislamiento y purificación de la fracción del antígeno filáctico a partir de un caldo de cultivo de cepas de JB. pertussis en fase I (cepa Tohama) , utilizando un método fisicoquímico tal como el fraccionamiento centrífugo en gradiente de densidad de sucrosa/ fraccionamiento con sulfato de amonio, atenuando luego la virulencia remanente con formalina. El toxoide de la difteria puede ser obtenido, mediante, por ejemplo, la purificación y la concentración de la toxina producida por Corynebacterium dihptheriae (cepa No. 8 de Park-Williams ) utilizando un método fisicoquímico tal como la cromatografía en columna, seguido por destoxificación con formalina. El toxoide del tétanos puede ser obtenido mediante, por ejemplo, la purificación y concentración de la toxina producida por Clostridium tetani (cepa Harvard) utilizando un método fisicoquímico tal como cromatografía en columna, seguido por la destoxificación con formalina. El antígeno protector de B. pertussis contiene la toxina de pertussis (antígeno PT) , hemaglutinina filamentosa (antígeno FHA) , proteína de la membrana externa (antígeno de 69 D) , y fimbrias (también llamado antígeno FB, aglutinógeno (FGG) ) . El antígeno protector de B. pertussis no necesariamente necesita contener cada uno de los antígenos anteriores, siempre y cuando éste contenga al menos uno, preferentemente al menos dos, y más preferentemente al menos tres de estos antígenos. Los anticuerpos para estos antígenos protectores protegen al hospedero de pertussis. 4. Vacuna combinada La vacuna combinada de la presente invención contiene cepas Sabin inactivadas del poliovirus, antígeno protector de B. pertussis , toxoide de la difteria y toxoide del tétanos. Como se mencionó anteriormente, el antígeno protector de B. pertussis , el toxoide de la difteria y toxoide del tétanos están disponibles comercialmente como vacunas combinadas de difteria- tétanos-pertussis . Por lo tanto, la vacuna combinada de la presente invención puede ser también preparada al mezclar las cepas Sabin inactivadas del poliovirus, junto con una vacuna combinada de difteria-tétanos-pertussis. Las cepas Sabin inactivadas del poliovirus pueden ser preparadas al mezclar las cepas del poliovirus Sabin tipo I, cepas del poliovirus inactivas Sabin tipo II, y cepas de poliovirus inactivadas Sabin tipo III. Como se mencionó anteriormente, las cepas Sabin inactivadas del poliovirus contienen las cepas Sabin inactivadas tipo I, tipo II y tipo III, del poliovirus en una proporción, con base en las cantidades de los antígenos D, respectivos de las mismas, preferentemente (2 a 4): (80 a 120) :(0 a 120), y lo más preferentemente (aproximadamente 3 ): (aproximadamente 100) : (aproximadamen e 100) . El antígeno protector de B. pertussis , el toxoide de la difteria y toxoide del tétanos pueden ser incluidos dentro de la vacuna combinada de la invención en cualesquiera cantidades que sean efectivas para prevenir pertussis, difteria y tétanos. Específicamente, estas cantidades respectivas pueden ser las mismas que las cantidades correspondientes en las vacunas combinadas de difteria-tétanos-pertussis comercialmente disponibles, anteriormente mencionadas. En casos donde las inmunogenicidades del antígeno protector de B . pertussis, el toxoide de la difteria y toxoide del tétanos sean influenciadas por la cepa Sabin inactivada del poliovirus y otros ingredientes, una vacuna combinada efectiva para prevenir cada una de las enfermedades objetivo, puede ser producida al ajustar adecuadamente los contenidos respectivos . La vacuna combinada de la invención puede ser producida y utilizada por medios convencionales. Específicamente, la producción y uso puede ser llevada a cabo como se describe más adelante.

La vacuna combinada de la invención puede ser preparada como una inyección por un método convencional. Tal inyección es preparada de acuerdo con un método que es por si mismo conocido en la materia, tal como la disolución, suspensión o emulsificación de las sustancias anteriores en un liquido acuoso u oleaginoso estéril, comúnmente utilizado en inyecciones. Los ejemplos de líquidos acuosos para la inyección que pueden ser utilizados, incluyen soluciones salinas e isotónicas fisiológicas que contienen glucosa u otro adminículo. La solución inyectable que ha sido preparada es típicamente llenada dentro de una ampolleta o jeringa adecuada. La vacuna combinada de la invención puede también incluir opcionalmente aditivos farmacéuticos tales como conservadores, antioxidantes y agentes quelantes . Los ejemplos ilustrativos de los conservadores incluyen timerosal y 2-fenoxietanol . Los ejemplos ilustrativos de los agentes quelantes incluyen ácido etilen-diamino-tetraacético y ácido glicol-éter-diaminotetraacético . La vacuna combinada de la invención puede contener adicionalmente adyuvantes. Los ejemplos ilustrativos de adyuvantes incluyen hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, cloruro de aluminio. Además del poliovirus inactivado de las cepas Sabin, el antígeno protector de B . pertussis, el toxoide de la difteria y toxoide del tétanos, la vacuna combinada de la invención puede también incluir otros ingredientes inmunogénicos . Los ejemplos ilustrativos de tales ingredientes inmunogénicos incluyen ingredientes inmunogénicos para virus o bacterias diferentes del poliovirus, B. pertussis, C. diphtheriae y C. tetani . Los ejemplos de tales ingredientes inmunogénicos incluyen toxoides, virus atenuados, virus inactivados, proteínas, péptidos, polisacáridos , lipopolisacáridos , lipopéptidos y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de virus y bacterias diferentes del poliovirus, C. diphtheriae y C. tetani incluyen virus de la influenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola, virus del herpes, virus de la viruela, virus de la rabia, virus de inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, Diplococcus pne moniae, Neisseria meningitidis, bacillus tifoide y Haemophilus influenzae tipo b. La vacuna combinada de la presente invención puede ser administrada parenteralmente, tal como mediante la inyección subcutánea o la inyección intramuscular, y preferentemente mediante inyección subcutánea. La cantidad de una dosis simple de la vacuna combinada de la invención puede ser adecuadamente seleccionada de acuerdo a diversas condiciones, tales como la edad y el peso corporal del vacunado objetivo.

Específicamente, una dosis simple puede contener, por ejemplo, al menos 4 unidades internacionales del antígeno protector de B. pertussis , aproximadamente 15 Lf del toxoide de la difteria, aproximadamente 2.5 Lf del toxoide del tétanos, aproximadamente 2 a aproximadamente 4 unidades (preferentemente 3 unidades) del poliovirus inactivado Sabin tipo I (base de antígeno D) , aproximadamente 80 a aproximadamente 120 unidades (preferentemente aproximadamente 100 unidades) del poliovirus inactivado Sabin tipo II (base antígeno D) , y de aproximadamente 80 a aproximadamente 120 unidades (preferentemente aproximadamente 100 unidades) del poliovirus inactivado Sabin tipo III (base antígeno D) . El número de veces que la vacuna combinada administrada de la invención es administrada como una inmunización inicial puede ser, por ejemplo, dos o tres dosis a intervalos de 3 a 8 semanas . Cuando la vacuna combinada de la invención es administrada dos veces como una inmunización inicial, es deseable administrar también una vacuna combinada de difteria-pertussis-tétanos (vacuna DPT) a un intervalo de 3 a 8 semanas. Como una inmunización de refuerzo, la vacuna combinada de la invención puede ser administrada una vez a un intervalo de al menos 6 meses después de la inmunización inicial (por ejemplo, de 12 a 18 meses después del final de la inmunización inicial) . Ejemplos La presente invención es ilustrada más completamente más adelante por medio de los ejemplos, aunque los ejemplos no limitan el alcance de la invención. Ejemplo de referencia 1: Establecimiento de un Banco de Células de Trabajo del fabricante para virus de vacuna de la polio Se preparó un banco de células preservadas para la producción de virus para vacuna de la polio mediante el procedimiento descrito más adelante a partir de células Vero adquiridas de la ATCC . (i) Preparación del Banco Maestro de Células (MCB) Células congeladas en una ampolleta recibidas de la ATCC (CCL 81 Vero, F-6573) , número de pase 124) fueron descongeladas, y transferidas a un matraz vacío de 118.3 mm (4 onzas) vacío (un matraz que tiene una capacidad de 154 mi y un área superficial de crecimiento celular de 54 cm2) . Quince mililitros de un medio de crecimiento celular (DME, Medio Eagle Modificado de Dulbecco; Sigma, catálogo No. D5523) que contenía 5% en volumen de suero de ternera, 0.075% de bicarbonato de sodio, 20 ug/ml de eritromicina y 100 ug/ml de canamicina (concentraciones finales)) se agregó gota a gota al matraz de 118.3 mm (4 onzas) que contenía células en un periodo de aproximadamente 5 minutos . El matraz que contenía las células y el medio de crecimiento celular fueron cultivados estáticamente a 362C (un matraz de 118.3 mm (4 onzas) pase 125) . A la mañana siguiente, el cultivo de crecimiento celular fue remplazado con 15 mm de cultivo fresco y el cultivo estático fue nuevamente llevado a cabo a 36aC. En el día 6 después del inicio del cultivo estático, se llevó a cabo un subcultivo (a partir de un matraz de 118.3 (4 onzas) a cuatro matraces de 118.3 mm (4 onzas) pase 126). El método de subcultivo fue llevado a cabo como sigue. Método de subcultivo (1) Desechar caldo de cultivo. (2) Colocar 5 mi de la solución de tripsina al 25% para subcultivar un matraz de 118.3 mm (4 onzas) . (3) Sumergir las sustancias celulares por aproximadamente 1 minuto, luego desechar la solución de tripsina a 0.25% para el subcultivo. (4) Colocar el matraz de 118.3 mm (4 onzas) en descanso a 36aC, y esperar para que las células se desprendan de la superficie de vidrio. (5) Cuando las células han comenzando a desprenderse, se agregan 5 mi del medio de crecimiento celular y se inducen todas las células al desprenderse mediante toma con pipeta. (6) Se suspenden las células uniformemente mediante toma con pipeta adicional, luego se transfiere el medio de crecimiento celular a un tubo para centrífuga. (7) Se centrifuga por 5 minutos a 600 rpm, se desecha el sobrenadante, y se suspenden uniformemente las células sedimentadas en aproximadamente 8 mi del medio de crecimiento celular fresco, mediante toma con pipeta. (8) Se agregan 2 mi de la suspensión celular a cada uno de cuatro matraces de 118.3 mm (4 onzas) nuevos (en cada uno de los cuales han sido distribuidos 13 mi del medio de crecimiento celular fresco) . (9) Se colocan cuatro matraces de 118.3 mm (4 onzas) en reposo a 362C y se lleva a cabo el cultivo celular. La composición de la solución de tripsina a 0.25% para el subcultivo fue como sigue: 5% de tripsina*1, 50 ml/1 5% de polivinilpirrolidona (90 K) , 20 ml/1 0.247 mol de edetato sódico*2, 56 ml/1 EK*3, 2 ml/1 fluido de dilución de tripsina*4, 872 ml/1 *1 Tripsina proveniente de páncreas porcino y que tiene una actividad de 1:300 fue utilizada. *2 La composición de 0.247 mol de edetato sódico fue como sigue : Edetato sódico - 2Na»2H20, 91.95 g/1 NaOH, 9.88 g/1 *3 La composición de EK fue como sigue: lactobionato de eritromicina, 10,000 µg/ml sulfato de canamicina, 50,000 ug/ml *4 La composición del fluido de dilución de tripsina fue como sigue: NaCl, 8, 000 mg/1 KC1, 400 mg/1 Na2HP04»12H20, 150 mg/1 KH2P04, 60 mg/1 El subcultivo fue subsecuentemente llevado a cabo mediante el mismo método (aunque, debido a que el área superficial de cultivo se incrementó aproximadamente a 3-4 veces en un pase simple, las botellas de cultivo y el volumen liquido se manejaron diferidos) a intervalos de 3-6 días, con lo cual se producen células en el pase 129 (el número de pases se incrementa por una vez que es llevado a cabo el subcultivo) . Las células cultivadas en el paso 129 fueron tratadas con tripsina en 33 matraces SR (matraces Roux Pequeños: matraces de cultivo que tienen un volumen de 727 mi y un área superficial de crecimiento celular de 156 cm2) de la misma manera que la que se llevó a cabo durante el subcultivo y centrifugación, después de lo cual el sedimento fue resuspendido a una concentración de aproximadamente 1.5 x 107 células /mi, en un medio criopreservado (DME (Medio Eagle Modificado con Dulbecco, Sigma, Catálogo No. D5523) que contiene 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) , 10% de volumen de suero de ternera, 0.75% de bicarbonato de sodio, 20 ug/ml de eritromicina y 100 ug/ml de canamicina (concentraciones finales). Un mililitro de la suspensión celular anterior fue surgido hacia una ampolleta, la temperatura fue descendida a -32 gC en un congelador lento (a una velocidad de enfriamiento de aproximadamente lsC/minuto) , luego transferida a nitrógeno líquido y preservada. Las células del pase 129 obtenidas como se describió anteriormente fueron utilizadas como el banco de células maestras (MCB) . (ii) Preparación del Banco de Células de Trabajo del fabricante (MWCB) Utilizando un banco de células maestras (MCB) preparadas y preservadas en la sección (i) anterior, fueron llevados a cabo los pasos a partir del descongelamiento de las células en ampolleta para el desarrollo por el subcultivo celular hasta el paso 134, básicamente de la misma manera exacta que se utilizó para preparar el banco de células maestras (MCB) en (i) anterior (aunque debido a que el número de células iniciales fue más alto, la cantidad de líquido manejado y el tipo y número de matraces de cultivo difirió) . Las células del pase 134 fueron preservadas en nitrógeno líquido de la misma manera que el banco de células maestras (MCB) . Las células del pase 134 obtenidas de este modo, fueron utilizadas como un Banco de Células de Trabajo del Fabricante (MWCB) .

Ejemplo 1 Preparación de las células para la producción de virus de vacuna de la polio (i) Paso de cultivo estático Una ampolleta del Banco de Células de Trabajo del Fabricante (MWCB) preparado y preservado en el Ejemplo de referencia 1 anterior (células del pase 134) fue descongelado de la misma manera que en la preparación del Banco de Células Maestras (MCB) y el Banco de Células de Trabajo del Fabricante (MWCB) en el Ejemplo de referencia 1, y las células fueron cultivadas estáticamente por 7 días (pase 135) en tres matraces LR (matraces Roux Grandes, los cuales son matraces de cultivo que tienen una capacidad de aproximadamente 1,540 mi y un área superficial de crecimiento celular de aproximadamente 274 cm2) . El subcultivo fue llevado a cabo hasta el día 7 desde el inicio del cultivo estático, después de lo cual la escala de cultivo fue expandida a 18 matraces LR (pase 136) y el cultivo estático fue llevado a cabo. El cultivo estático y el subcultivo del mismo fueron llevados a cabo mediante el mismo método que en la preparación del Banco de Células Maestras (MCB) y la preparación del Banco de Células de Trabajo del Fabricante (MWCB) en el Ejemplo de referencia 1 anterior. En seguida, se llevaron a cabo 7 días de cultivo estático en una Fabrica Celular de 40 charolas (Nunc, Catálogo No. 149446) (pase 137) . El subcultivo fue luego llevado a cabo en el día 7 después del inicio del cultivo estático, en adición al cual se llevaron a cabo 7 días de cultivo estático en cuatro Fábricas Celulares de 40 charolas (pase 138) . (ii) Paso de cultivo en microportador En seguida, las células de paso 138 obtenidas en el paso de cultivo estático en (i) anterior, fueron tratadas con tripsina y centrifugadas de la misma manera que durante el subcultivo en (i) anterior, y las células sedimentadas fueron uniformemente suspendidas mediante toma con pipeta en 1,000 mi de un medio de crecimiento celular para el cultivo en microportador (DME (Medio Eagle Modificado de Dulbecco, Sigma, Catálogo No. D5523) que contiene 5% en volumen de suero de ternera (Termo Trace), 0.11% de bicarbonato de sodio, 0.1% de fructosa, 20 \ig/ l de eritromicina y 100 ug/ml de canamicina (concentraciones finales). La suspensión celular fue hinchada de antemano con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , luego mezclada con un microportador (Cytodex 1 (nombre comercial), GE Healthcare Bioscences) equilibrado con el medio de crecimiento celular para el cultivo en microportador (5 g/1 de Cytodex 1 (nombre comercial), se utilizó con base en el peso previo al hinchamiento ) , y el cultivo se llevó a cabo en tres recipientes de cultivo de 50 litros a 372C, pH 7.15 y bajo agitación. Comenzando en el día 2 del cultivo, la mitad del medio de crecimiento celular fue sucesivamente remplazada una vez al día con medio de crecimiento celular fresco. Las células desarrolladas por 7 días fueron utilizadas como células (pase 139) para la producción de virus para la vacuna de la polio. E emplo 2 : Producción de la vacuna de la polio inactivada tipo 1 (i) Paso de cultivo del virus Justo antes de la inoculación de los virus semilla dentro de las células para la producción de virus para la vacuna de la polio, obtenida en el Ejemplo 1 (pase 139) , la agitación fue detenida y las células se dejaron sedimentar, luego se lavaron una vez Solución Salina Balanceada de Earl (EBSS) que contenía 0.075% de bicarbonato de sodio, 20 ug/ml de eritromicina y 100 g/ml de canamicina (concentraciones finales) . Después de retirar el sobrenadante de los 5 mi del medio de crecimiento celular recolectado junto con el microportador, el volumen fue nuevamente llevado hasta 5 mi por la adición de solución de tripsina al 0.25%, con lo cual se desprenden las células de las esferas y se provoca que éstas sean suspendidas. La cuenta celular fue luego determinada con base en lo cual se estimó el número de células para el recipiente de cultivo completo de 50 litros. Virus semilla Sabin tipo I atenuados (LSc, cepas 2ab) fueron inoculados en una concentración de aproximadamente 10~3 CCID50 por célula. Después de la inoculación de los virus semilla, se vaciaron inmediatamente dentro del recipiente de cultivo 50 litros de un medio de cultivo de virus (M199 (Medio 199) que contenía 0.3% de bicarbonato de sodio, 20 ug/ml de eritromicina y 100 ug/ml de canamicina (concentraciones finales) . Los virus semilla utilizados fueron virus que habían sido cultivados de antemano aproximadamente a 33.32C utilizando células de riñon cultivadas primarias, de mono verde africano, luego empaquetadas en porciones pequeñas y criopreservadas a -702C. El cultivo del virus fue llevado a cabo a 349C ± laC por 3 días. Utilizando los efectos citopáticos por el poliovirus (redondeo de las células infectadas con el poliovirus, seguido por el desprendimiento de las células desde el microportador) como el indicador, el cultivo viral fue llevado hasta la finalización cuando desde 95 a 100% de las células se habían desprendido del microportador. Después de la terminación del cultivo del virus, el microportador fue retirado con una malla de teflón (tamaño de poro, 120 um) y la suspensión del virus fue recuperada. El microportador remanente sobre la malla fue lavada una vez con aproximadamente 3 litros del medio de cultivo viral por recipiente de cultivo de 50 litros. El fluido de lavado resultante fue agregado a la suspensión viral recuperada, con lo cual se da un "fluido de virus de la polio tipo I". (ii) Paso de concentración/purificación del virus Aproximadamente 150 litros del fluido del poliovirus tipo I obtenido en (i) anterior, se hicieron pasar a través de una membrana de filtro de 0.2 um (Pall Corporation, SLK7002NRP) para eliminar los desechos celulares. El filtrado se concentró a 1.2 litros con una membrana de ultrafiltración (Sartorius, PESU (polietersulfona) de 100 kDa, 0.1 m2, 3051466801E-SG) . El fluido viral concentrado fue formado en una pelotilla por 4 horas de centrifugación a 62C y 100,000 g, y después de lo cual la pelotilla fue resuspendido en 0.1 mol/1 de amortiguador de fosfato (PB) (la pelotilla proveniente de un tubo de centrifuga (aproximadamente 100 mi) fue resuspendida en 5 mi de PB) . La resuspensión de la pelotilla se agitó toda la noche a 42C, luego se sónico (Kubota, Insonator Modelo 200M) por 8 minutos a 200 W, con lo cual se rompe la masa de virus agregados. En seguida, después de 30 minutos de centrifugación a 115,000 rpm, se recolectó el sobrenadante. El sobrenadante obtenido de este modo fue purificado con DEAE Sepharose CL-6B (nombre comercial, GE Healthcare Biosciences, GE 17-0710-05) . El amortiguador de fosfato (PB) , 0.1 mol/1, fue utilizado como el eluido. La absorbancia a 280 nm fue monitorizada y el primer pico fue recuperado como "fluido de poliovirus purificado tipo I". La absorbancia a 260/280 nm para el pico muestreado fue calculada y confirmada por ser mayor de 1.5 (la absorbancia a 260/280 nm para las partículas de poliovirus completas es de 1.6 a 1.7) . (iii) Paso de inactivación El fluido del poliovirus tipo I purificado obtenido en (ii) anterior fue diluido a aproximadamente 10 veces con una solución de dilución de pre-inactivación (M199 que contenía 5% de ácido aminoacético (concentración final) , pero que no contenía calcio, magnesio, rojo de fenol o bicarbonato de sodio) , pasado a través de una membrana de filtro de 0.2 ]i (Pall Corporation, SLK7002NRP) , y la masa de los virus agregados fue removida. Después de la preparación del filtrado, la inactivación fue rápidamente comenzada de una manera tal como para evitar la agregación de los virus nuevamente. Una hora antes del inicio de la inactivación, el filtrado y la formalina diluidos a 1:200 fueron separadamente calentados a 37 aC. Mientras que se agitaba perfectamente el filtrado, la formalina fue agregada a una concentración final de 1:4,000, la mezcla fue calentada a 37-C, y fue iniciada la inactivación. Durante el tratamiento con formalina, la inactivación del virus fue hecha para proceder uniformemente mediante la agitación de la mezcla dos veces al día - una vez en la primera mitad del día y una vez más en la segunda mitad del día. Anticipando que los virus insuficientemente inactivados podrían adherirse al tapón del recipiente y a ciertos sitios específicos dentro del recipiente, el tapón fue cambiado en los días 2 y 4 después del inicio de la inactivación, y el recipiente mismo fue cambiado en el día 6.

Además, dada la posibilidad de que los virus podrían agregarse durante el paso de inactivación, en el día 6 de la inactivación, se llevó a cabo la filtración utilizando una membrana de filtro de 0.2 um (Pall Corporation, SL 7002NRP) . El paso de tratamiento con formalina fue llevado hasta la finalización después de 12 días. En el día 12, la formalina libre en el fluido viral tratado con formalina, fue neutralizada con sulfito de sodio (agregado a una concentración de 0.0264 mol/1) , después de lo cual se agregó edetato sódico (0.0009 mol/1) , como un estabilizador, con lo cual se da un material a granel de la "vacuna de la polio tipo I inactivada" . (iv) La cantidad del antígeno es medida por un método de ELISA indirecto utilizando anticuerpos que tienen una alta especificidad del tipo y el antígeno D. El método de ELISA indirecto comienza mediante el recubrimiento de una microplaca con, como el anticuerpo primario, un anticuerpo monoclonal (derivado de ratón) específico para los antígenos D del mismo tipo que el antígeno que va a ser evaluado. El antígeno que va a ser evaluado es luego diluido y colocado sobre éste. En seguida, un anticuerpo policlonal de conejo del mismo tipo que el antígeno que va a ser evaluado es colocado sobre éste sobre el anticuerpo secundario, además de lo cual el anticuerpo IgG anti-conejo marcado con HRPO es colocado sobre éste, efectuando una reacción. Después de la reacción, se lleva a cabo un desarrollo de color utilizando una solución de o-fenilendiamina, y se mide la absorbancia a 492 nm. La cantidad del antígeno (antígeno ensayado) es determinada mediante comparación de la absorbancia medida para el anticuerpo evaluado y la absorbancia medida para un antígeno de referencia por un análisis cuantitativo en línea paralela . Ej emplo 3 : Producción de la vacuna de la polio inactivada tipo II Aparte de utilizar las cepas Sabin tipo II atenuadas (cepas P712, Ch. 2ab) en vez de las cepas Sabin tipo I atenuadas (cepas Lsc, 2ab) , se produjo un material a granel de la "vacuna de la polio tipo II inactivada" de la misma manera que en el Ejemplo 2. Ejemplo 4: Producción de la vacuna de la polio inactivada tipo III Aparte de utilizar las cepas Sabin tipo III atenuadas (cepas León, 12aib) en vez de las cepas Sabin tipo I atenuadas (cepas Lsc, 2ab) , se produjo un material a granel de la "vacuna de la polio tipo III inactivada" de la misma manera que en el Ejemplo 2. Ejemplo 5: Producción del antígeno protector de B. pertussis (1) Cultivo de Bordetella pertussis Cepas de B. pertussis en fase I (cepa Tahoma) fueron cultivadas giratoriamente de 30 a 34SC por 20 a 24 horas en un medio de Cohen-Wheeler . La B. pertussis desarrollada sobre el medio de Cohen-Wheeler fueron luego desarrolladas en un medio de Stainer-Scholte de 30 a 342C por 48 a 68 horas. El cultivo fue concentrado a l/10mo del volumen original mediante centrifugación, y el sobrenadante y las células bacterianas fueron separados mediante separación centrífuga . (2) Preparación de la toxina de Pertussis En seguida, se agregó 1 mol/1 de amortiguador de fosfato (pH 8.0) al sobrenadante obtenido en (i) anterior, para llevar el volumen hasta l/10mo del volumen original, luego, se agregó una solución de acetato de calcio al 25% p/v para llevar la concentración desde 0.1 hasta 20% p/v y un filtrado que contenía la toxina de pertussis (antígeno filáctico) fue obtenido mediante filtración. El filtrado se hizo pasar a través de una columna mediante cromatografía en columna SP (solución equilibrada: amortiguador de fosfato 0.1 mol/1 (pH 6.0) y la toxina de pertussis absorbida fue eluida con amortiguador de fosfato a 0.415 mol/1 (pH 7.0), con lo cual se fracciona una solución que contiene la toxina de pertussis. En seguida, la solución que contiene la toxina de pertussis se hizo pasar a través de una columna mediante cromatografía en columna de gel (solución equilibrada: 0.025 mol/1 de solución de fosfato de sodio (pH 8.7) que contiene 0.25 mol/1 de cloruro de sodio), luego se filtró (tamaño de poro, 0.2 µp\) , dando una solución de toxina de pertussis pura (antigeno PT) . (3) Preparación de la hemaglutinina filamentosa Las células bacterianas aisladas en (1) anterior fueron dispersadas en un amortiguador de fosfato a 0.05 mol/1 (pH 8.0) que conten a 1 mol/1 de cloruro de sodio, después de lo cual se llevó a cabo la separación centrifuga para separar nuevamente el sobrenadante y las células bacterianas . Una solución de acetato de calcio al 25% p/v se agregó al sobrenadante re-separado, a una concentración de 0.1 hasta 2.0% p/v, después de lo cual se llevó a cabo la filtración, dando una solución que contenia hemaglutinina filamentosa (antígeno filáctico) . El filtrado se concentró con sulfato de amonio, luego se purificó mediante centrifugación en gradiente de densidad, con lo cual se fracciona la hemaglutinina filamentosa pura (antígeno FHA) . (4) Preparación de la proteína de membrana externa Las células bacterianas re-separadas en (3) anterior, fueron dispersadas en un amortiguador de fosfato a 0.01 mol/1 (pH 7.0) que contenía 0.145 mol/1 de cloruro de sodio y se calentó a 602C por 90 minutos, después de lo cual el sobrenadante y las células bacterianas fueron nuevamente re-separados mediante separación centrífuga. En seguida, se agregó 1 mol/1 de amortiguador de fosfato (pH 8.0) al sobrenadante nuevamente re-separado, para llevar así el volumen hasta l/10mo, después de lo cual se agregó una solución de acetato de calcio al 25% p/v, a concentraciones desde 0.1 a 2.0% p/v y se llevó a cabo la filtración, con lo cual se da un filtrado que contiene la proteína de la membrana externa (antígeno filáctico) . La solución que contenía la proteína membranal externa (antígeno filáctico) fue sometida a cromatografía en columna SP (solución equilibrada: amortiguador de fosfato al 0.1 mol/1 (pH 6.0)) , y el líquido que pasó a través de la columna se recolectó. En seguida, el líquido se hizo pasar a través de una columna mediante cromatografía de columna en gel (solución equilibrada: 0.025 mol/1 de solución de fosfato de sodio (pH 8.7) que contenía 0.25 mol/1 de fosfato de sodio) , luego se filtró (tamaño de poro, 0.2 um) , dando así una proteína membranal externa pura (antígeno 69 K) . (5) Preparación de las fimbrias (aglutinógeno (AGG) ) Un amortiguador de fosfato a 0.01 mol/1 (pH 8.0) que contenía 1 mol/1 de cloruro de sodio se agregó al residuo dejado después de la recolección de la solución que contenía la proteína de la membrana externa en (4) anterior, en una cantidad que l/10mo la cantidad del sobrenadante, después de lo cual se llevó a cabo la filtración, produciendo un filtrado que contenía fimbrias (antígeno filáctico) . La solución resultante que contenía fimbrias fue concentrada con sulfato de amonio, luego purificada mediante centrifugación en gradiente de densidad, con lo cual se fracciona las fimbrias puras (antígeno FB) . (6) Preparación del Antígeno Protector (atenuación) Una solución que contenía el antígeno PT, el antígeno FHA, el antígeno de 69 KD y el antígeno FB obtenido en las secciones (2) a (5) anteriores mezcladas de una manera tal que la vacuna combinada de DPT preparada en el Ejemplo 8 más adelante, incluirán niveles de antígeno de 1.89 ug de antígeno PT, 3.00 ug de antígeno FHA, 0.76 ug de antígeno 69K y 0.36 ug de antígeno FB por 0.5 mi de vacuna, fue preparado como una solución de antígeno filáctico puro. Formalina (de 0.2 a 0.5% volumen) y si es necesario, el clorhidrato de lisina a una concentración no mayor de 1% p/v se agregaron a la solución de antígeno filáctico pura, después de lo cual la solución fue calentada a 37 a 412C por al menos 7 días para efectuar la atenuación, con lo cual se da una solución de antígeno protector de pertussis . La formalina en exceso y el clorhidrato de lisina en exceso fueron removidos mediante ultrafiltración, dando un material a granel de antígeno protector de pertussis . Ejemplo 6: Producción del Toxoide de la Difteria (1) Cultivo de Corynebacterium diphtheriae C. diphtheriae ( Park-Williams cepa No. 8) se cultivó en el medio de Loeffler a 32.0 a 34.0aC por 5 días. (2) Preparación de la toxina de difteria Se agregó sulfato de amonio al fluido de cultivo obtenido en (1) anterior, después de lo cual el sobrenadante se filtró (tamaño de poro, 0.45 µp\) . El filtrado resultante se hizo pasar a través de una columna mediante cromatografía en columna hidrofóbica de fenilo (solución equilibrada: 0.01 mol/1 de solución de fosfato de sodio (pH 6.5) que contenía 1.25 mol/1 de sulfato de amonio) . La solución de toxina obtenida así se hizo pasar a través de una columna mediante cromatografía en columna de intercambio iónico DEAE (solución de equilibrio: amortiguador de fosfato 0.01 mol/1 (pH 7.0)), luego se hizo pasar a través de una columna mediante cromatografía en columna del gel (solución equilibrada: 0.1 mol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.0) que contenía 0.145 mol/1 de cloruro de sodio) , con lo cual se fracciona la toxina de la difteria. Esta se utilizó como una solución de toxina pura. (3) Conversión de la Toxina de Difteria a Toxoide En seguida, se agregó clorhidrato de lisina a la solución de toxina pura obtenida en (2) anterior, a una concentración no mayor de 1% p/v, se agregó formalina a una concentración de 0.3% en volumen, y la solución de calentó a 38.0 a 40.02C por 21 días, con lo cual se convirtió la toxina o toxoide. (4) Preparación del Toxoide de la Difteria Siguiendo la conversión al toxoide en (3) anterior, la formalina en exceso y el clorhidrato de lisina fueron eliminados mediante ultrafiltración, dando con esto un toxoide de la difteria. Ejemplo 7 Producción del Toxoide del Tétano (1) Cultivo de Clostridium tetani C. tetani (Harvard 47-A) fue cultivada en caldo de hígado a 34.5aC a 36.5fiC por 5 días. (2) Preparación de la Toxina del Tétanos Se agregó sulfato de amonio en cultivo obtenido del (1) anterior a una concentración de 1.25 mol/1 por litro del cultivo. En seguida, el cultivo se pasó a través de una columna mediante cromatografía en columna hidrofóbica de fenilo (solución equilibrada: 0.01 mol/1 de fosfato de sodio (pH 6.5) que contenía 1.25 mol/1 de sulfato de amonio) . La solución de la toxina resultante se pasó a través de una columna mediante cromatografía de intercambio iónico de DEAE (solución equilibrada: 0.01 mol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.5)), después de lo cual la solución se pasó a través de una columna mediante cromatografía en columna de gel (solución amortiguada: 0.004 mol/1 de amortiguador de fosfato (pH 7.0) que contenía 0.145 mol/1 de cloruro de sodio), con lo cual se fracciona la toxina del tétanos . Esta se utilizó como una solución de toxina pura. (3) Conversión de la Toxina del Tétanos a Toxoide En seguida, se agregó formalina a la solución de toxina pura obtenida en (2) anterior a una concentración de 0.3% en volumen, el pH se corrigió a 7.0, y la solución se calentó a 392C por 15 a 23 días, con lo cual se convirtió de toxina al toxoide. (4) Preparación del Toxoide del Tétanos Después de la conversión al toxoide en (3) anterior, la formalina en exceso y el clorhidrato de lisina fueron removidos mediante ultrafiltración, dando con esto un toxoide del tétanos. Ejemplo 8: Producción de la Vacuna Combinada (i) Preparación de la Vacuna de la Polio Inactivada Combinada Los materiales a granel de la vacuna de la polio inactivada tipo I, la vacuna inactivada de la polio tipo II, y la vacuna inactivada de la polio tipo III, obtenidas en los Ejemplos 2, 3 y 4 anteriores, se mezclaron con el medio 199 (M199) , 2-fenoxietanol (concentración final, 0.5% en volumen) y cloruro de aluminio (concentración final, 0.09% p/v) de una manera tal como para establecer los niveles relativos de los antigenos D, respectivos a 3:100:100. La mezcla resultante se ajustó a un pH de 7 con hidróxido de sodio o ácido clorhídrico, dando con esto una vacuna inactivada de la polio, combinada. (ii) Producción de la Vacuna Combinada DPT El antígeno protector de B. pertussis, el toxoide de la difteria y el toxoide del tétanos, como materiales a granel obtenidos en los Ejemplos 5, 6 y 7 anteriores, fueron mezclados con el medio 199 (M199) , 2-fenoxietanol (concentración final, 0.5% en volumen) y cloruro de aluminio (concentración final, 0.24% p/v) . La mezcla resultante se ajustó a pH de 7 con hidróxido de sodio y ácido clorhídrico, dando con esto una vacuna combinada de DPT. (iii) Producción de la Vacuna Combinada La vacuna combinada de la polio, inactivada obtenida en (i) anterior y la vacuna combinada DPT obtenida en (ii) anterior, fueron mezcladas en cantidades iguales, produciendo con esto una vacuna combinada. Ejemplo 9: Estabilidad de la Vacuna Combinada La vacuna combinada obtenida en el Ejemplo 8 fue medida al llevar a cabo una prueba acelerada de 252C. La estabilidad fue evaluada por pruebas de potencia sobre cada uno de los virus . (1) Prueba de Potencia de la Vacuna de Pertussis Pura Precipitada Un espécimen de prueba, una vacuna de pertussis estándar y la cepa de B. pertussis 18323 son utilizadas. El espécimen de prueba y la vacuna estándar son cada una diluidas a partir de las cuales son luego preparadas diluciones de cada una en un total de al menos 3 diluciones en serie a intervalos logaríticamente iguales, adecuados de 4 veces o más. Un grupo de al menos dieciséis ratones de cuatro semanas de edad se utiliza para cada dilución. A cada animal se le administran 0.5 mi de la dilución como una inyección intraperitoneal simple. Veintiún días después de las inyecciones inmunitarias , se inyectan 0.025 mi de la suspensión celular bacteriana para el reto, dentro del cerebro de cada animal, después de lo cual los animales son observados por 14 días y se registran el número de muertes. A partir del tratamiento estadístico de la comparación de los resultados de prueba, el espécimen de prueba debe tener una potencia de al menos 8 unidades /mi. (2) Prueba de Potencia del Toxoide Precipitado de la Difteria Un espécimen de prueba, un toxoide de la difteria precipitado control, y una solución de toxina adecuada son utilizados. La dilución del espécimen de prueba y el control se lleva a cabo con solución salina fisiológica; la dilución de la solución de toxina es llevada a cabo con 0.017 mol/1 de solución de amortiguador .de fos fato / cloruro de sodio (pH 7.0) que contiene 0.2% p/v de gelatina. El espécimen de prueba y el control son cada uno diluidos, creando diluciones seriales a intervalos logarítmicamente iguales. Utilizando un grupo de al menos diez ratones de 5 semanas de edad para cada dilución del espécimen de prueba y el control, cada animal es subcutáneamente inyectado con 0.5 mi. Cuatro a seis semanas después de las inyecciones inmuni tarias , la sangre es extraída de cada animal, y se mide el título de antitoxina sanguínea. A partir del tratamiento estadístico y la comparación de los resultados de prueba, el espécimen de prueba debe tener una potencia de al menos 47 unidades /mi . (3) Prueba de Potencia del Toxoide Tetánico Precipitado Un espécimen de prueba, un toxoide del tétanos precipitado control, y una solución de toxina adecuada son utilizados. La dilución del espécimen de prueba y el control se lleva a cabo con solución salina fisiológica; la dilución de la solución de toxina es llevada a cabo con 0.017 mol/1 de solución de amortiguador de fosfato/cloruro de sodio (pH 7.0) que contiene 0.2% p/v de gelatina. El espécimen de prueba y el control son cada uno diluidos, creando diluciones seriales a intervalos logarítmicamente iguales. Utilizando un grupo de al menos diez ratones de 5 semanas de edad para cada dilución del espécimen de prueba y el control, cada animal es subcutáneamente inyectado con 0.5 mi. Cuatro a seis semanas después de las inyecciones inmunitarias , cada ratón es retado con aproximadamente 100 LD50 de toxina y observado por 4 días. A partir del tratamiento estadístico y la comparación de los resultados de prueba, el espécimen de prueba debe tener una potencia de al menos 27 unidades/ml . ( 4 ) Prueba de Inmunogenicidad en Rata Un espécimen de prueba, un control para una prueba de potencia IPV, sueros estándares para cada tipo, y cepas Sabin del poliovirus (tipos I, II y III) para los retos de prueba de neutralización, son utilizados. El espécimen de prueba y el control son cada uno diluidos, creando diluciones a intervalos logarítmicamente iguales. Un grupo de al menos diez ratas hembra Wister de 8 semanas de edad se utiliza para cada dilución. Cada animal es intramuscularmente inoculado con 0 . 5 mi en la región femoral de la pata posterior. Veintiún días después de la inoculación, es extraída la sangre individualmente de cada animal y se recolecta el suero, y luego se calienta a 56 aC por 30 minutos. El suero para cada animal y el suero estándar son colocados en al menos dos pozos para cada suero, y se diluyen serialmente 2 veces con medio MEM. Además, los pozos respectivos son inoculados a aproximadamente 100 CCID50 con suspensiones virales neutralizadoras de los tipos respectivos. En seguida, todas las placas son colocadas en una incubadora de C02 a 36 ± 12C por 3 horas, luego se dejan reaccionar toda la noche a aproximadamente 4aC. La suspensión celular que contiene 1 x 104 células es agregada al día siguiente a cada pozo, y se cultiva en una incubadora de C02 a 3 6 + lffiC por 7 días. Después de la terminación del cultivo, el CPE para cada pozo son examinadas, la proporción de dilución del suero al tiempo de la neutralización al 50% es calculada, y el reciproco de la misma es tratado como el título de anticuerpo neutralizador . A partir del tratamiento estadístico y la comparación de los resultados de prueba, el espécimen de prueba debe tener una potencia igual a o mayor que el control . Los resultados para la prueba acelerada son mostrados en la Tabla 1 . Se utilizó el Lote 04C (Japan Polio Research Institute) como el IPV control. Tabla 1 Especificación Al inicio 1 2 3 de la mes meses meses prueba Vacuna inactivada de Igual a o mayor que el 1.7 1.7 1.5 2.1 la polio tipo I control IPV Vacuna inactivada de Igual a o mayor que el 2.1 2.0 1.6 1.5 la polio tipo II control IPV Vacuna inactivada de Igual a o mayor que el 20.3 12.3 5.9 6.0 la polio tipo III control IPV Vacuna de pertussis 8 unidades/ml 15.8 13.8 14.6 27.3 pura precipitada Toxoide de la difteria 47 unidades/ml 97.9 109.3 85.9 102.9 precipitada Toxoide del tétanos 27 unidades/ml 72.3 88.6 105.5 79.4 precipitado Microportador , y Cultivo de Poliovirus (i) Cultivo de Células Vero Las células que habían sido subcultivadas en un cultivo estático comenzado a partir de un banco de trabajo de células Vero (MWCB93) se desprendieron con una solución de tripsina-EDTA (0.25% de tripsina, EDTA 0.14 M) , luego se centrifugaron a 600 rpm por 10 minutos y se suspendieron subsecuentemente en un medio de crecimiento celular (Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DME) que contenía 5% en volumen de suero de ternera, 0.11% de bicarbonato de sodio (NaHC03) , 0.1% de fructosa, 20 ug/ml de eritromicina y 100 xg/ l de canamicina) . Un microportador (Cytodex 1 (nombre comercial) fue hinchado en PBS (-), esterilizado en autoclave a 121SC por 15 minutos, luego sustituido con el medio de crecimiento y utilizado . Los biorreactores Celligen Plus y Celligen fabricados por New Brunswick Scientific fueron utilizados como los aparatos de cultivo. La suspensión del microportador y las células fueron agregadas al biorreactor, después de lo cual se agregó el medio de crecimiento celular hasta un volumen final de 4.8 litros (en el caso del biorreactor Celligen, 3.5 litros) y el cultivo fue llevado a cabo a una temperatura de 37.02C, con una concentración de oxígeno disuelto (DO) de 15%, un pH de 7.15 y una velocidad rotacional de 35 a 50 rpm. El intercambio del medio utilizando el medio del crecimiento celular que tenía NaHC03 a la concentración de 0.15% como el medio de intercambio, se llevó a cabo continuamente, desde el día 2 del cultivo a una velocidad de aproximadamente 4 1/día (en el caso del biorreactor Celligen, la cantidad completa del medio fue intercambiada una vez cada tercer día) . La cuenta celular se midió utilizando un contador Coulter Counter (nombre comercial ) . Los resultados del cultivo celular son mostrados en la Figura 1 (los biorreactores Celligen fueron utilizados únicamente en las pruebas 3H) . A una concentración de portador de 3 g/1, la cuenta celular alcanzó un máximo en el día 7, a un número de células inicial de baja concentración (31, aproximadamente 2 x 105 células/ml), y alcanzó un máximo en el día 8 a un número de células inicial de alta concentración (3H, aproximadamente 10 x 105 células/ml), después de lo cual ésta disminuyó. A una concentración del portador de 5 g/1, la cuenta celular incrementó en un periodo de 11 días a un número de células iniciales de baja concentración (5L, aproximadamente 2 x 105 células /mi ) , pero la cuenta celular disminuyó en el día 12. En el caso de un número de células inicial de baja concentración, la cuenta celular total a una concentración del portador de 5 g/1, fue mayor en el día 10 que la cuenta de células totales a un nivel del portador de 3 g/1, pero la diferencia no fue grande. A una concentración del portador de 5 g/1 y a un número de células inicial de alta concentración (5H, aproximadamente 10 x 105 células/ml), la cuenta celular se incrementó todavía en el día 9, con la cuenta celular en ese punto que es de aproximadamente 2.8 x 106 células/ml, representando un incremento de aproximadamente 2.7 veces sobre el número de células iniciales, (ii) Cultivo de Poliovirus Un poliovirus del tipo I (IS-90C) fue utilizado como el virus semilla o de siembra. En el día final de las mediciones de las cuentas celulares, las células fueron lavadas con un volumen de 4 veces (basado en la capacidad de cultivo del biorreactor) de EBSS que contenía NaHC03 al 0.075%. El virus semilla fue luego diluido en un litro de medio M-199 (E) que contenía 0.3% de NaHC03 , 20 ug/ml de eritromicina y 100 ug/ml de canamicina (medio de crecimiento del virus) . La dilución resultante del virus fue inoculada en las células lavadas, y el medio de cultivo viral fue agregado hasta las capacidades de cultivo de los biorreactores respectivos. El cultivo del virus fue llevado a cabo a una temperatura de cultivo de 33.3SC, 15% de oxígeno disuelto (DO), un pH de 7.40 y una velocidad rotacional de 35 a 50 rpm. El cultivo del virus fue detenido cuando las células se habían desprendido completamente del microportador , debido a los efectos citopáticos (CPE) del virus, punto en el cual el fluido viral fue cosechado. El fluido viral cosechado fue criopreservado a -80eC. En esta prueba, el cultivo viral fue comenzado en el día final de la medición sobre las curvas de crecimiento celular respectivas mostradas en la Figura 1. La medición del título viral fue llevada a cabo como sigue: las células GMK-2 cultivadas por 3 días en un tubo giratorio fueron lavadas dos veces con 1 mi de HBSS que contenía 0.075% de NaHC03, 200 µ/ml de penicilina y 200 g/ml de estreptomicina, después de lo cual se agregó 1 mi de un fluido de mantenimiento celular (medio M-199 que contiene 0.1% de albúmina sérica bovina, 0.0225% de NaHC03, 200 µ/ml de penicilina y 200 ug/ml de estreptomicina) . El fluido viral de prueba fue diluido serialmente a 0.5 logio con el fluido de mantenimiento celular, y 0.2 mi del fluido viral a 10"7 a 10"8'5 por tubo fue inoculado en tubos a cada nivel de dilución. Después de la inoculación, el cultivo fue llevado a cabo por 7 días por una incubadora de 36SC. El título de infectividad (CCID50/0.02 mi) fue computado por el método de Reed & Muench basado en un juicio de observación de los efectos citopáticos (CPE) en el día 7. La Figura 2 muestra los títulos de infectividad (títulos virales) del poliovirus tipo I obtenido en las células Vero cultivadas bajo diversas condiciones. Como resultado del cultivo del virus, el más alto título de infectividad fue obtenido en el sistema que tenía una concentración del portador de 5 g/1, y un número de células inicial de alta concentración (5H) ; este sistema alcanzó una densidad celular en el día 9 de 2.8 x 106 células/ml. Los sistemas, acomodados de acuerdo al tamaño de los títulos de infectividad de los mismos en orden descendente, fueron 5H, 5L y 3L. Estos resultados estuvieron en concordancia con las cuentas celulares totales. Además, en comparación con el fluido viral obtenido mediante el cultivo en células de riñon del mono verde como el control, se obtuvo un título de infectividad más de 10 veces mayor en el sistema 5H. El título viral mostrado en la Figura 2 (logio CCID50/0.2 mi) fue de 8.18 en el sistema 3L, 8.51 en el sistema 5L, 9.59 en el sistema 5H, y 7.50 en Ref (control) . Posibilidad de Aplicación Industrial Las cepas Sabin de alta potencia del poliovirus, pueden ser obtenidas mediante el cultivo, en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 de un microportador , las células Vero inoculadas con los poliovirus de las cepas Sabin. Los poliovirus de las cepas Sabin inactivados pueden ser eficientemente producidos mediante el uso del poliovirus de la cepa Sabin de alta potencia. Por lo tanto, un proceso para producir una vacuna que incluye el paso de cultivar, en presencia de aproximadamente 4 g/1 hasta aproximadamente 6 g/1 del microportador, las células Vero inoculadas con los poliovirus de las cepas Sabin (el proceso de producción de la presente invención) es útil como un proceso para producir eficientemente vacunas combinadas que contienen poliovirus de las cepas Sabin inactivados. Además, debido a que la vacuna combinada de la presente invención es capaz de suprimir efectivamente el inicio de la poliomielitis, pertussis, difteria y tétanos, ésta es útil como una vacuna para la polio, pertussis, difteria y tétanos. Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un proceso para producir una vacuna combinada, que contiene: (A) una cepa Sabin inactivada del poliovirus, (B) un antígeno protector de Bordetella pertussis,
(C) un toxoide de la difteria, y (D) un toxoide del tétanos, caracterizado el proceso porque comprende (a) un paso de ¦ cultivar, en presencia de aproximadamente 4 g/1 a aproximadamente 6 g/1 de un microportador , células Vero que van a ser inoculadas con una cepa Sabin del poliovirus. 2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: (b) un paso de infectar las células Vero con una cepa Sabin del poliovirus, (c) un paso de permitir que el poliovirus prolifere, (d) un paso de recuperación de un fluido viral que contiene poliovirus, y (e) un paso de inactivar el poliovirus.
3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microportador tiene una concentración de aproximadamente 5 g/1.
4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microportador es un microportador de dextrano.
5. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo de las células Vero (paso (a) ) es llevado a cabo en una escala de al menos 3 litros.
6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el paso de cultivo de las células Vero (paso (a)) es llevado a cabo en una escala de al menos 30 litros.
7. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende además: (d-2) un paso de purificar el fluido viral.
8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el paso de purificación (paso d-2) comprende: (i) la formación del fluido viral recuperado en el paso (b) en una pelotilla mediante ultracentrifugación, (ii) sonicar una resuspensión de la pelotilla, y (iii) purificar mediante cromatografía en columna.
9. El proceso de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la purificación mediante cromatografía en columna (iii) es llevada a cabo solamente una vez.
10. Una vacuna, caracterizada porque es producida mediante el proceso de conformidad con la reivindicación 1.