JP3527238B2 - 新規なａ型肝炎ウイルス株、新規なａ型肝炎ウイルス株の分離方法及びａ型肝炎ワクチン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）の
免疫学的特性を示す血清型を有するＡ型肝炎ウイルス
（HAV）に関するものである。特に本発明は新規なＡ型
肝炎ウイルス株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）に関
するものである。本発明はさらに該HAVの構造的構成因
子に関するものである。さらに本発明は該HAVの分離方
法に関するものである。本発明のHAV及びその構造的構
成因子は、ワクチン及び診断用組成物の製造に使用する
ことができる。最後に、本発明は、係る新規HAVに対す
るポリクローナル及びモノクローナル抗体に関するもの
である。

Ａ型肝炎感染は、世界の殆どの開発途上地域に固有で
あって、食物及び水源を広く汚染しており、より開発の
進んだ地域からの旅行者にとって非常な危険を呈するも
のである。先進国においては、おむつを付けている子供
を扱う保育所、並びに薬物乱用及び同性愛行為に伴う発
生が、ますます認識されている。ピコルナウイルス群の
エンテロウイルスとして分類されるＡ型肝炎ウイルス
（HAV）は、細胞培養中で分離するのが困難であり、初
期のインビトロ継代において増殖貧困であり、また一般
に細胞変性性でない。このウイルスのゲノムがクローニ
ングされ配列決定され、ただ一つの血清型が同定され
た。HAV感染は決して慢性化しないものの、これは重大
な人間の罹患率及び生産性の損失の原因となる。

これらの理由により、Ａ型肝炎ウイルスの予防に対す
る将来的必要性が存する。受動免疫による予防は有効で
あるが一次的な効果があるだけであり、能動免疫がこの
感染の制御に対するより実際的な試みであろう。

Ａ型肝炎ワクチンの開発はかなり進歩してきた。常套
的な、不活性化及び生きた弱毒化ワクチンが、細胞培養
中で複製されたHAVから製造された。組み替えDNA技術を
適用して、Ａ型肝炎ワクチンの開発のための別な方法が
開発された。これらの方法は、インビトロにおけるウイ
ルス抗原の発現、ウイルス抗原のインビボでの発現のた
めの生きたウイルスベクターの使用、及び、該ウイルス
の遺伝子産物を表わす合成ペプチドの産生を含む［ブリ
トゥン・オブ・ザ・WHO（Bulletin of the WHO）、
第66巻（４）（1988）、443頁］。

このウイルスの中和のための重要なエピトープは線状
でなく配座性のものであるらしいことから、これら新技
術に基づくＡ型肝炎ワクチンが入手できるまでにはさら
なる研究が必要とされるであろう。常套的なホルムアル
デヒド不活性化HAVワクチン開発の実行可能性が証明さ
れ、この後、急性感染したマーモセットS.ラビアトゥス
の肝臓から部分精製されたHAV株CR326のインビトロでの
増殖に成功した［P.J.プロビスト及びM.R.ヒルマン、プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ソサイアティ・フォア・
エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディス
ン（Proc.Soc.Exp.Biol.Med.）第159巻（1978）201
頁］。複数の用量の水性ワクチンが、マーモセットS.ラ
ビアトゥスに投与された。この方法により免疫された動
物は全て抗体を産生し、そして全てがチャレンジ感染に
対し免疫性であった。続いて、高度に精製されたホルム
アルデヒド不活性化HAVワクチンが、形質転換されたア
カゲザル腎臓セルラインLLC−MK2細胞培養中で増殖させ
た同じ株から製造された。しかしながらこのワクチンは
現在人間のワクチン開発には使用できない［P.J.プロビ
スト等、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー
（L.Med.Virol.）第19巻（1986）23頁］。その他の原型
のホルムアルデヒド不活性化HAVワクチンが、他の形質
転換セルラインで、または一次動物細胞培養での継代に
よって製造された：メルク・アンド・Co.、Inc.（P.J.
プロボスト、M.R.ヒルマン及びJ.ヒューズ）、米国特許
79−71648号、US80−171621及びUS83−541836号、ユー
・エス・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒュ
ーマン・サービシズ（ロバートソン）、US88−211973
号、R.シーリング等、EP84−105066号、ベーリングベル
ケAG（ローレンツ）、EP7461、U.S.A.（デーマー等）US
84−652067A号。

このような手法によって作製されたワクチンは以下の
ような欠点を有する： （１）アレルギーまたは腫瘍形成反応を誘発し得る成長
基質からの遺伝学的物質及び外来抗原が、そのワクチン
に含まれ得る； （２）動物細胞培養での継代に由来する未知の物質が、
そのワクチンに含まれ得る； （３）そのワクチンに含まれる抗生物質が、感作された
個体にアレルギー反応を誘発し得る； （４）このようなHAVワクチンの安全性及び免疫原性
は、人間において充分立証されている訳ではない。不活
性化Ａ型肝炎ワクチン開発における重要な進歩は、前も
って動物中で継代せずにHAVをヒトの線維芽細胞培養中
で増殖させたことであった［B.フレーミッグ、EP82−10
8268号］。このHAVは急性Ａ型肝炎の患者の糞便から分
離され、一次ヒト腎臓細胞で増殖させた。ヒト二倍体線
維芽細胞中でさらに継代すると、不活性化Ａ型肝炎ワク
チンの産生のためのHAV抗原が生成した。このような手
法によって作製されたワクチンにおいてもやはり以下の
ような欠点がある： （Ｉ）糞便からHAVを分離し、そして分離物を化学的
な前処理を施すことなく一次ヒト細胞中で培養してもな
お、未知の外来物質による汚染の危険の可能性がある、 （II）ヒト線維芽細胞培養におけるHAVの連続的継代
は、大量の欠損干渉粒子（DI）を産生し［カレイン及び
L.ルー、ジャーナル・オブ・バイロロジー（J.Virolog
y）第62巻/8（1988）、2859頁］、これが係るワクチン
の免疫能を低下させる、 （III）上記DIはHAVの高力価の収穫を抑制し、故にこ
のような手法で作製されるワクチンは極めて高価なもの
となる、 （IV）述べられたHAV抗原は、H₂O中1:2000の最終希釈
でホルムアルデヒド溶液により37℃で12日間不活性化す
る。この方法はHAV抗原を変性させ、その結果該ワクチ
ンの防御能が失われ得る、そして、 （Ｖ）この手法により産生された抗原は、世界の全大
陸からのＡ型肝炎被験分離物の全てに対しては防御抗体
価を示さなかった。

このように、本発明の根底にある技術的問題は、高い
抗体価を顕在化させ得、且つ優れた免疫学的性質を有す
る、最適な耐用性のあるＡ型肝炎ワクチンを提供するこ
とである。

この技術的問題に対する解決は、請求項において特徴
付けられる態様を提供することによって達成される。特
に、これは、ブタペスト条約の要求の下に1991年４月11
日、寄託番号Ｉ−1080の下でザ・インスティテュート・
パストゥア、パリのコレクション・ナショナーレ・ドゥ
・カルトゥア・ドゥ・ミクロオーガニスム（CNCM）に寄
託されたHAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）の免疫
学的特性を示す血清型を有するHAVを提供することによ
り達成される。

好ましい態様において、本発明は新規なHAV株RG−SB
XA112（CNCM Ｉ−1080）に関するものである。

上のHAVは、優れた免疫原性を示し、さらに、HAV感染
に対する広範囲の防御を誘導する。これは、該新規HAV
株により誘導される免疫応答が、現在知られている他の
HAV血清サブタイプの殆どをも認識する抗体によって媒
介されているためである。

本発明に係るHAV及び対応するワクチンは、 第一：急性Ａ型肝炎に感染した患者の糞便から分離さ
れたウイルスを、異なった物理的精製法によって精製
し、この患者に由来する全ての可能な外来物質を除去す
るためpH1の酸溶液で処理した； 第二：該ウイルスは、ワクチン産生のため、一次動物
またはヒト細胞で継代せず、管理セルバンク（管理セル
バンクとは、その細胞を、外来性の汚染または異常の不
在について綿密に試験したバンクである）のヒト二倍体
細胞上で直接継代し、それによりこの細胞によるさらな
る汚染を減じた。この文脈において、「一次動物または
ヒト細胞」という語は、動物または人間から新たに分離
した細胞を意味する。これらはその性質において一様で
はなく、これらの細胞の継代は不可能である。故に、異
常または汚染の検出のための綿密な試験操作はこれらの
細胞については実施できない； 第三：ヒト二倍体細胞上での該ウイルスの継代を、DI
の出現が回避されるような手法で実施した；そして、 第四：該ウイルス抗原を化学物質で注意深く処理し
て、蛋白の変性を回避した、という点で先行技術とは異
なっている。

さらに本発明は、本発明に係るHAVの構造的構成因子
に関するものである。好ましくはこれらの構造的構成因
子はウイルスmRNA、コア蛋白、またはVP（ウイルス蛋
白）１、VP2、VP3またはVP4蛋白である。さらに本発明
は、該構造的構成因子の生物学的に活性なもしくは機能
的な部分または誘導体に関するものである。係る構造的
構成因子の生物学的に活性な部分とは、例えば、抗HAV
抗体の生成を誘導し活性ウイルスを中和するVP1の一部
である。

特に好ましい態様において、本発明に係るHAVの構造
的構成因子は、本発明のHAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ
−1080）の免疫学的特性の惹起に関与している。

別の態様において本発明は、以下の工程： （ａ）急性相のHAV感染患者の糞便を緩衝溶液に懸濁
し； （ｂ）この懸濁液を遠心し； （ｃ）上清を超遠心し； （ｄ）ウイルス含有画分を分離しこれを透析し； （ｅ）管理セルバンクからのヒト二倍体細胞を（ｄ）の
ウイルス調製物に感染させ； （ｆ）感染した細胞を培養し； （ｇ）工程（ｆ）の細胞を継代しHAV活性の継代を検定
し； （ｈ）工程（ｇ）のHAV陽性継代物のウイルス含有細胞
抽出物を分離し；そして、 （ｉ）さらに継代し、引続き端点希釈（好ましくは各々
三回目の継代後に）によりHAV株のクローニングを行な
う、 ［ここで、該ウイルス含有懸濁液または画分は、該ヒト
二倍体細胞に感染させる前に、２より低いpH、好ましく
はpH1を有する酸で処理する］からなるHAVウイルスの分
離方法に関するものである。

エンテロウイルスのみがpH1において安定な感染性を
示すことが知られている。他のウイルスは全てこの低い
pHにおいて不活性化される。他のエンテロウイルスと比
較してHAVはこの低いpHにおいて極めて高い安定性を表
す。本発明者等は、全てのヒトエンテロウイルスのうち
HAVだけが、pH1で37℃で５時間インキュベーションした
後になお感染性のあることを示すことができた。使用さ
れたこの方法により、他のヒト外来性感染性物質による
分離物の汚染が除外できるという結論が得られる。

本発明方法の好ましい態様において、工程（ｇ）まで
の培養及び継代は37℃で実施し、工程（ｉ）のさらなる
継代及びクローニングは32℃で実施する。ヒト二倍体細
胞における32℃への「冷順応工程」は、37℃で順応させ
たウイルスよりヒトにおける病原性がはるかに少ない弱
毒化HAVを導く。

この文脈中「弱毒化HAV」という語は、その病原性を
低下させたHAVを意味する。

本発明方法のもう一つの好ましい態様において、ウイ
ルス増殖のための宿主細胞は、ヒト二倍体有限寿命細
胞、好ましくはMRC−５（寄託番号ATCC CCL171の下で
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATC
C）から入手可能）、MRC−９（ATCC CCL 212）または
ウィスター38細胞である。「ヒト二倍体有限寿命細胞」
とは、死滅するまでに培養中で約60細胞サイクルを経る
細胞を意味する。これらの細胞を使用する利点は、基質
としてのこれらの安全性にある。使用される有限寿命細
胞は、レトロウイルスを含む付随的微生物物質、染色体
異常または発癌性の不在に関して綿密な管理の下にあ
る。さらに、均一の集団倍化（PD）レベルを持ち且つセ
ルバンク（寄託所）から調製された細胞は、異なった個
体由来の一次細胞よりも再現性の高い結果を与えること
が明らかである。

もう一つの態様において本発明は、本発明に係るHAV
の非病原性免疫原性誘導体、本発明に係るHAV株RG−SB
XA112（CNCM Ｉ−1080）、及び／または本発明に係
る任意のHAVの免疫原性構造的構成因子、並びに所望に
より薬学上許容し得る担体、アジュバント及び／または
希釈剤を含有するHAVワクチンに関するものである。

無傷の不活性化HAVの全体の使用の外に、４つのサブ
ユニットキャプシド蛋白VP1、VP2、VP3及びVP4の一つま
たはその組合せを、ワクチンの製造に使用することがで
きる。ウイルス全体またはサブユニットの構成員は、水
酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、他のウイルス、
リポソーム、ウイロソームまたはイムノソームのような
既知の担体物質に吸着させて免疫原性を高めることがで
きる。

本発明のHAVワクチンの好ましい態様において、このH
AVの該誘導体は、化学的に弱毒化したHAVまたはさらに
化学的に弱毒化される非病原性HAV株である。

化学的に弱毒化したHAVを含有するワクチンは、不活
性化されたウイルスに加えて正確に測定された量の活性
ウイルスを含有するワクチンを意味する。したがってこ
れは、「フェルミ」型狂犬病ワクチンについて記載され
た［P.レピン：ラボラトリー・テクニークス・イン・レ
イビーズ（Laboratory Techniques in Rabies）（WH
O）、第３版、1973、199頁］ような、弱毒化型及び不活
性化型ワクチンの混合物である。このようなワクチン
は、ホルムアルデヒド濃度を限定（例えば1:4000）並び
に不活性化の時間及び温度を限定（例えば４℃で４日
間）することによって生成させることができる。係るワ
クチンの利点は、高い免疫原性にある：不活性化された
粒子は人間への投与後直ちにヒト免疫系を刺激するが、
一方、弱毒化された冷順応の生きたHAVは、免疫応答を
顕在化させる前の体内における複製に幾らかの時間を必
要とする。免疫細胞は大量の不活性化されたウイルスに
よってのみ刺激され、小さな生きたウイルス断片によっ
てはこれが複製されるまでは刺激されないため、この生
きたウイルス断片は、その標的細胞に感染し、複製を受
け、そして複製後は有効用量のブースターとして働く。

本発明に係るHAVワクチンのもう一つの好ましい態様
においては、これに含まれるHAV株の少なくとも一つがH
AV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）である。

本発明の好ましい態様においては、該ワクチンに含ま
れるウイルスがホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラ
クトン（BPL）処理により化学的に弱毒化されている。
この化学的弱毒化の原理は、インフルエンザウイルス、
呼吸器のシンシチウムウイルス、またはロタウイルスを
含むもののような他のウイルスワクチンの製造にも使用
することができる。

ホルムアルデヒドは、ウイルスがその免疫原性を失わ
ずに感染性であり続けることができなくなるというふう
に、キャプシド蛋白に化学的影響を及ぼすことが知られ
ている。ホルムアルデヒドの代わりにβ−プロピオノラ
クトン（BPL）もまた不活性化剤として使用できる。

好ましい態様において、本発明は、特異的に本発明の
HAVもしくはその構造的構成因子に対するモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体に関するものである。本発
明に係るこれらの抗体は、先行文献に知られる他のいか
なるHAV血清サブタイプとも交叉反応性を示さない。し
たがって、本発明に係る新規なHAVの供給は、このよう
な特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産
生を初めて可能にするものである。

別の好ましい態様においては、該抗体は、本発明のHA
Vまたはその構造的構成因子に対するものであって、先
行文献に知られる他の殆どのHAV血清サブタイプと交叉
反応性を示す。したがって、本発明に係る新規なHAVの
供給は、殆どのヒトHAV血清サブタイプを認識する、広
スペクトルを有するモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体の産生を初めて可能にするものである。

ポリクローナル抗体は、spf（特異的病原体不含）動
物（例えばヒツジ）を、不活性化した、部分的に不活性
化したもしくは生きた本発明のHAV、例えばRG−SB XA1
12（CNCM Ｉ−1080）株またはその構造的構成因子に感
染させ、摂取した血清を既知の技術により精製すること
によって製造することができる。モノクローナル抗体
は、ボランティアの人間を、本発明に係る不活性化し
た、化学的に弱毒化した、もしくは生きたHAV、例えばR
G−SB XA112株（CNCM Ｉ−1080）、またはその構造的
構成因子を含有するＡ型肝炎ワクチンで免疫することに
よって生成させることができる。成功した免疫の二週間
後、刺激されたリンパ球を血液から分離し、ヒト骨髄腫
セルラインの細胞と融合させる。このようにして得られ
た所望のモノクローナル抗体を合成するハイブリドーマ
は、融合細胞を含む細胞培地を該所望モノクローナル抗
体の存在について試験することにより選択することがで
きる。

最後に、本発明は、本発明のHAVもしくはその非病原
性誘導体、HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）もし
くはその非病原性誘導体、本発明に係る任意のHAVの構
造的構成因子、または上に開示される抗体を含有する診
断用組成物に関するものである。

HAV抗原は、例えばELISA板を被覆して患者の血清中の
HAV抗体を検出するために使用することができる。抗体
は、例えば放射免疫検定のための複合体の製造に使用す
ることができる。

実施例１ 感染性材料からのHAV株RG−SBの分離 糞便をpH7.4の燐酸塩緩衝液に懸濁し、遠心し、30％
サッカロースのシュクロースクッションにより超遠心す
ることにより上清中のウイルスをペレット化することに
よって野生型HAVをＡ型肝炎感染の急性相にある患者の
糞便から取得し、そして1.1及び1.5g/mlの間の密度を有
するCsCl₂勾配を用いる密度勾配遠心によってさらに精
製した。HAV含有画分を、改良固相RIA技術により同定し
た。この改良は、抗体の代わりに抗原を測定することを
意味する。この測定は、いわゆる競合試験を実施するこ
とにより達成できる：一定量の抗HAV抗体をHAV抗原と混
合する。次いで測定された非結合抗体の量は、結合した
抗HAV抗体部分を中和したHAV抗原の量の尺度となる。

約1.3g/mlの密度を有する画分を、生理食塩水に対し
て２回透析した。溶液のpHはHCl（1m）でpH1に調節し
た。室温で５時間後にpHをNaOH（10％）でpH7に調節し
た。

実施例２ ヒト二倍体細胞（MRC−５）へのHAVの順応 実施例１から分離されたHAV材料1mlを、BME培地（ジ
ブコ）及び10⁷MCR−５細胞を含有する懸濁液10mlと混合
することにより、精製された野生型ウイルスをMCR−５
（ATCC CCL 171）に順応させた。この順応の工程は、
ウイルスの該MRC−５細胞中での複製を可能にする。こ
の懸濁液を室温に維持し、10分毎に穏やかに攪拌した。
１時間後、懸濁液を、150cm²の表面を有するコーニング
組織フラスコに移し、10％FBSを加えたBME70mlを添加し
た。続いて組織フラスコ中の気相にCO₂を最終濃度５％
まで加え、37℃でインキュベートした。HAVに感染したM
RC−５細胞を1:2の比率で毎週分割した。これらの細胞
の半分を順応工程に使用し、他の細胞をHAV抗原の試験
に使用した。10回のブラインド継代（即ち、HAVを検出
せずに継代）の後、HAV抗原が改良RIAを使用して初めて
検出できた。この目的のために、細胞に付随したウイル
スを、コーニングフラスコの内容物を３回凍結−融解し
次いで超音波処理することによって抽出した。低速の遠
心により細胞の破片を除去した。

さらなる弱毒化のために、13回目のブラインド継代の
HAVを使用した。細胞を凍結−融解により破壊した後に
ウイルスを分離した。

実施例３ MCR−５細胞上のHAV株RG−SBの弱毒化 75cm²のプラスチックフラスコ（コーニング）中で増
殖させた融合性のMRC−５細胞培養をBME培地で２回洗浄
し、順応させたHAVを含むウイルス接種物1.0mlを接種し
た。32℃における４時間のウイルス吸着の後、10％FBS
を含有するBME培地を加えた。この培養を32℃でインキ
ュベートし、その後７日間の間隔で培地を交換した。各
継代の後にウイルスを抽出し、新しい新鮮な融合性組織
培養を通過させた。２回目の継代を４週間、３回目を３
週間、そして４回目を２週間続けた。各継代の後に、凍
結−融解によってウイルスを細胞の溶菌液から抽出し
た。４回目の継代後に、端点希釈10^-5ないし10^-9とする
５回目の継代のための幾つかの接種物を調製した。次い
でウイルスが検出できる最大希釈の培養由来のウイルス
をさらなる継代に使用した。継代は、ウイルス吸着細胞
を32℃で２週間インキュベートし（培地は１週間後に変
えた）、そして２回の継代後毎には端点希釈継代を行な
うことにより実施した。この手法を反復し、23回目の継
代で、Ａ型肝炎ワクチンのための順応した弱毒化された
産生種菌ウイルス（即ち、この継代からのウイルスがワ
クチンの製造に使用された）が得られた。

実施例４ 生きた弱毒化Ａ型肝炎ワクチンの製造 大量のMRC−５細胞培養をNUNC細胞生産工場（NUNC、
コペンハーゲン、デンマーク）で増殖させた。稠密な細
胞層を、感染の多重度が約0.1の産生種菌由来のHAV株RG
−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）に感染させた。ウイル
スは32℃で４時間吸着させた。次いで10％FBSを含有す
る新鮮なBME培地を感染細胞に加え、この後細胞生産工
場を32℃でインキュベートした。１週間インキュベート
した後、培地を新鮮な培地に交換した。もう１週間イン
キュベートした後、HAVを細胞培養から抽出した。ほう
酸塩100mM及びNa−EDTA5mMを含み10％NaOHでpH8に調節
した抽出溶液を培養に加えた。引続き、NUNC細胞生産工
場を−30℃の急速冷凍室に移動させた。細胞を完全に凍
結させた後、細胞生産工場を懸濁液が融解するまで37℃
のインキュベーション室に移した。この操作を２回反復
した。次にこの懸濁液をポンプで遠心瓶に入れ、超音波
処理した（ブランソニック、ブランソン・ユアロップ・
BV、振動数50kHz±10％）。10秒間の超音波衝撃を、各
々10秒間の間隔の後に２回繰り返して最良の結果を得
た。

次いで懸濁液を2500xgで10分間遠心し、上清を瓶に移
した。ペレットを半分の容量の抽出溶液に再懸濁し、再
度凍結−融解し、その後超音波処理及び遠心した。この
操作を１回繰り返し、全ての上清を最終的にプールし
た。次いでこの上清を濾過により透明にし、孔径0.2μ
ｍのメンブレンフィルター（ミリポア）で無菌濾過し
た。

活性な薬用成分を含むこれらの上清を、ワクチンが混
和されるまで−30℃で保存した。

最終的なバルクのワクチンは無菌条件の下で製造する
が、以下の成分を含んでいる： 弱毒化HAVウイルス、RG−SB XA112株 （CNCM Ｉ−1080） 10^7.3TCID₅₀/ml NaCl 3.4mg/ml ポリゲリンまたはフィジオゲル（ハウサマン）16.0mg/m
l フェノールレッド（シグマ） 20μg/ml シュクロース 340μg/ml 実施例５ 不活性化Ａ型肝炎ワクチンの製造 HAVウイルスRG−SB XA112株（CNCM Ｉ−1080）を実
施例４に従って製造した。濾過した上清を、さらに以下
のごとく精製した： −限外濾過（ミニタン、ミリポア）により濃縮； −30％シュクロースクッション溶液による超遠心（24時
間、100000xg）により精製； −Na−EDTA5mM、ほう酸塩100mM（pH8）にペレットを再
懸濁； −密度が1.1及び1.5g/mlの間のCsCl₂勾配による100000x
gの超遠心によりさらに精製； −HAVを含有する画分（ｄ＜1.35−ｄ＞1.23）をプー
ル； −画分を透析管（スペクトラ、ポア、分子のカットオフ
が12000−14000）に移し、0.9％NaClに対して４℃で3x1
2時間透析； −HAV懸濁液をホルムアルデヒド（H₂O中1:2000の希釈）
により37゜で3.5日間及び室温で６日間不活性化； −透析または超遠心によりホルムアルデヒドを除去（上
記参照）； −不活性化したHAV懸濁液を0.9％NaCl溶液で抗原濃度10
00ng/mlに希釈； −等量のHAV懸濁液及びアジュバント溶液（Al（OH）_３
の場合0.8％の保存溶液を使用した）を混合することに
より、抗原をアジュバント（例えばAl（OH）_３またはリ
ポソーム）に吸着させる； −0.5mlの等分試料をワクチンバイアルに充填する。

実施例６ 部分的に不活性化したＡ型肝炎ワクチン（化
学的に弱毒化）の製造 このワクチンは、実施例５に従い以下の修飾を施して
製造した： 完全に不活性化する代わりに、精製されたHAV懸濁液
をホルムアルデヒド溶液（H₂O中1:2000の希釈）による
処理によって化学的に弱毒化した。この懸濁液を４℃で
４日間攪拌した。ウイルスを超遠心（100000xg、１時
間）により２回ペレット化することにより、ホルマリン
を除去した。HAVを0.9％NaCl溶液に再懸濁し、次いでワ
クチンの容量当り100ngの抗原濃度に希釈した。

実施例７ HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）を含
有するワクチンによる人間のボランティアのワクチン接
種 実施例４、５及び６に従って三つのＡ型肝炎ワクチン
を製造した。全てのワクチンは、ヒト二倍体細胞におい
て産生された不活性化及び生きた弱毒化ワクチンのため
の国際管理当局の標準に適合する。

15人の健康な血清陰性の成人を、実施例４に記載のよ
うに製造されたワクチン（ワクチンＡ）の10⁵組織培養
感染用量50％（TCID₅₀）により経口的に免疫した。TDID
₅₀においては、ウイルスの保存溶液が10⁵の係数によっ
て希釈された場合、培養中の全細胞の50％が感染する。

15人の健康な血清陰性の成人を、実施例５に記載のよ
うな不活性化されたHAV抗原250ngを含有する不活性化Ａ
型肝炎ワクチン（ワクチンＢ）で非経口的に免疫した。

別の15人の健康な血清陰性の成人の群を、実施例６に
従って製造された10⁵TCID₅₀のHAV及び不活性化HAV抗原1
00ngを含有する化学的に弱毒化したＡ型肝炎ワクチン
（ワクチンＣ）によって非経口的に免疫した。

ワクチンＡは１回、ワクチンＢ及びＣは以下の計画に
従って投与した:0日目に２回のワクチン接種、そして７
日目にブースター用量を接種した。全ボランティアの抗
体力価を、ワクチンＡについては28日目に、ワクチンＢ
及びＣについては21日目に監視した。抗HAV抗体は市販
のRIAキット（アボット）で測定した。結果を第１表に
表す。

この結果は、RG−SB XA112株（CNCM Ｉ−1080）を
含む全てのHAV調製物が高度に免疫原性であることを示
している。全てのワクチンは、接種後に有意な血清変換
を示した。

さらに、三つのワクチンは全て良好な耐用性があっ
た：接種後の全身性反応は報告されず、僅かな局所反応
が報告されたに過ぎなかった。どの群においても肝臓の
酵素の値の上昇は検出されなかった。

実施例８ HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）を接
種したボランティアからの血清による、異なったHAV株
の中和 地理的に広く異なった地域から回収された８つのHAV
株を使用する中和試験を、HAV株RG−SB XA112（CNCM
Ｉ−1080）によるワクチン接種後の人間のボランティア
から得られた血清試料について実施した。各ボランティ
アからの血清は、カンザス（LV−374）、アラスカ（FrA
L）、ドイツ（Gr8）、パナマ（PA21）、北アフリカ（MB
B）、オーストラリア（HM−175）、スイス（CLF）及び
シャンハイ（シャンハイ）由来のHAVを中和した。これ
らの結果は、該ワクチンが世界の異なった地域由来のHA
Vを防御するであろうことを示している。

実施例９ HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）に対
するポリクローナル抗体の製造 HAV抗原の測定または抗HAV抗体の測定のための診断的
手段として使用するための強力なポリクローナル血清を
得るために、spfヒツジの成体を、実施例５に従って製
造したワクチンによって、０、７、14及び44日目に免疫
した。０日目に４つの用量を各々のヒツジの異なった場
所（腿）にi.m.で投与した。７、14及び44日目に、二つ
の用量をi.m.で両後肢に注射した。58日目に350mlの血
液を各ヒツジから採取した。血清画分を分離し、既知の
技術に従ってさらに精製した［E.J.コーン等、ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ（J.Am
er.Chem.Soc.）第69巻（1946）459頁］。

実施例10 HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）に対
するヒトモノクローナル抗体（HMAB）の製造 成人のボランティアが、実施例４に従って製造したワ
クチンの２回の筋肉内注射を、三角筋部分に、０日目及
び７日目（ブースター用量）に受けた。ヒトの末梢血リ
ンパ球（PBL）を28日目にドナーから取得した。単核細
胞をフィコール−ハイパーグ密度勾配（ファルマシア、
ウプサラ、スウェーデン）上で分離し、プラスチックに
付着させることにより単核球を涸渇させた。次いで非付
着細胞を以下のように抗原特異的パニング検定において
試験した：細胞を遠心し、１％BSAを含有する冷PBS（pH
7.4）に再懸濁した。予めHAV抗原で被覆した、ウェルが
６個の平板（コスター、バドヒーブドルフ、オランダ）
の各ウェルにリンパ球（１％BSAを含有するPBS中10⁷/m
l;PBS/BSA溶液）を加えた。プラスチック表面上に残っ
ている非特異的結合サイトをブロックするため、ウェル
はPBS/BSA溶液で少なくとも１時間４℃でインキュベー
トしておいた。70分間のインキュベートの後、非付着細
胞を吸引した。10％牛胎児血清（FCS）を含むIMDM細胞
培養基（シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO）
及び同容量のエプスタイン−バーウイルス（Ｂ 95−８
マーモセットセルラインの培養由来の上清を含むEBV）
を、この付着細胞に加えた。この細胞を37℃で３時間培
養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、10％FC
S、リンパ芽球様セルラインJW5由来の条件培地30％、２
−メルカプトエタノール5x10^-5M、硫酸ゲンタマイシン
（シグマ）50μg/ml、及びシクロスポリンＡ（サンディ
マン、サンド、バーゼル、スイス）600ng/mlを含むIMDM
を入れた96ウェルの微量定量プレートに10⁴ないし10⁵細
胞／ウェルの密度で分配した。14ないし21日間のインキ
ュベーションの後、培養上清をELISAによってHAV株RG−
SB XA112（CNCM Ｉ−1080）に対する抗体の結合につ
いてスクリーニングした。陽性のウェルからの細胞培養
を拡大し、ELISAにより再試験し、低密度で継代培養
し、イムノブロッティング及び免疫蛍光法によってさら
に試験した。さらに拡大した後、この細胞を、平板融合
技術［J.W.ラリック、ヒューマン・ハイブリドーマズ・
アンド・モノクローナル・アンティボディーズ（Human
Hybridomas and Monoclonal Antibodies）、プレ
ナム・プレス、ニューヨーク、1985、446頁］によって
６−チオグアニン／ウワバイン耐性F3B6（NS1xヒトＢ細
胞のハイブリッド）へテロ骨髄腫セルラインと融合させ
た。ハイブリッドは、ヒポカンチン100μＭ、アゼセリ
ン５μg/ml及びウワバイン５μＭを含有するIMDM中で選
択し、供給細胞層の無い微量定量プレート中で培養し
た。HAV RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）を特異的に
結合させる抗体（中和試験）を含む上清と共にハイブリ
ドーマを限定希釈によってクローニングし、該細胞によ
り分泌されるHMAbを収穫した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ０７Ｋ 16/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ａ 33/577 33/577 Ｂ (56)参考文献 特開 昭56−39779（ＪＰ，Ａ) 特表 昭64−500485（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開25745（ＥＰ，Ａ１) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．, （1989），Ｖｏｌ．70，Ｎｏ．９，ｐ ｐ．2481−2485 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（1987），Ｖｏ ｌ．157，Ｎｏ．２，ｐｐ．268−275 Ｊ．Ｇｅｎ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．, 1995，Ｖｏｌ．90，ｐ．2491−2495 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎ ｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ, 1989，Ｖｏｌ．159，Ｎｏ．４，ｐ．621 −624 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，1988，Ｖｏｌ. 62，Ｎｏ．８，ｐ．2859−2866 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 7/00 - 7/08 C07K 16/08 C07K 14/10 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ−1080）の
   変異株であって、かつ、HAV株RG−SB XA112（CNCM Ｉ
   −1080）と同一の免疫学的特性を示す血清サブタイプを
   有するＡ型肝炎ウイルス（HAV）。
2. 【請求項２】Ａ型肝炎ウイルス株RG−SB XA112（CNCM
   Ｉ−1080）。
3. 【請求項３】請求項１または２に記載のHAV血清サブタ
   イプまたは株の構造的構成因子。
4. 【請求項４】ウイルスmRNA、コア蛋白、もしくはVP1、V
   P2、VP3、もしくはVP4蛋白、またはそれらの生物学的に
   活性なもしくは機能的な部分もしくは誘導体である、請
   求項３に記載の構造的構成因子。
5. 【請求項５】該HAV血清サブタイプまたは株の免疫学的
   特性の惹起に関与している請求項３または４に記載の構
   造的構成因子。
6. 【請求項６】請求項１に記載のHAV非病原性免疫原生誘
   導体、請求項２のHAV株、及び／または請求項３ないし
   ５のいずれか一項に記載のその免疫原生構造的構成因
   子、並びに所望により薬学上許容し得る担体、アジュバ
   ント、及び／または希釈剤を含有するHAVワクチン。
7. 【請求項７】該HAVの該誘導体が化学的に弱毒化されたH
   AVである、請求項６に記載のHAVワクチン。
8. 【請求項８】該HAV株がさらに化学的に弱毒化されてい
   る、請求項６に記載のHAVワクチン。
9. 【請求項９】該化学的弱毒化がホルムアルデヒドまたは
   β−プロピオラクトン（BPL）処理に起因する、請求項
   ７及び８のいずれか一項に記載のワクチン。
10. 【請求項１０】該HAV株の該誘導体が不活性化されてい
    る、請求項６に記載のワクチン。
11. 【請求項１１】該HAV株が不活性化されている、請求項
    ６に記載のワクチン。
12. 【請求項１２】該抗体が他の殆どのHAV血清サブタイプ
    との交叉反応性を示す、請求項１もしくは２のHAVに対
    する、または請求項３ないし５のいずれか一項に記載の
    構造的HAV構成因子に対する、ポリクローナルもしくは
    モノクローナル抗体。
13. 【請求項１３】特異的に請求項１もしくは２のHAVに対
    する、または請求項３ないし５のいずれか一項に記載の
    構造的HAV構成因子に対する、ポリクローナルもしくは
    モノクローナル抗体。
14. 【請求項１４】請求項１に記載のHAVもしくはその誘導
    体、請求項２に記載のHAVもしくはその誘導体、請求項
    ３ないし５のいずれか一項に記載の構造的HAV構成因子
    または請求項12もしくは13に記載の抗体を含む診断用組
    成物。