JP3527238B2 - 新規なa型肝炎ウイルス株、新規なa型肝炎ウイルス株の分離方法及びa型肝炎ワクチン - Google Patents
新規なa型肝炎ウイルス株、新規なa型肝炎ウイルス株の分離方法及びa型肝炎ワクチンInfo
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Description
免疫学的特性を示す血清型を有するA型肝炎ウイルス
(HAV)に関するものである。特に本発明は新規なA型
肝炎ウイルス株RG−SB XA112(CNCM I−1080)に関
するものである。本発明はさらに該HAVの構造的構成因
子に関するものである。さらに本発明は該HAVの分離方
法に関するものである。本発明のHAV及びその構造的構
成因子は、ワクチン及び診断用組成物の製造に使用する
ことができる。最後に、本発明は、係る新規HAVに対す
るポリクローナル及びモノクローナル抗体に関するもの
である。
あって、食物及び水源を広く汚染しており、より開発の
進んだ地域からの旅行者にとって非常な危険を呈するも
のである。先進国においては、おむつを付けている子供
を扱う保育所、並びに薬物乱用及び同性愛行為に伴う発
生が、ますます認識されている。ピコルナウイルス群の
エンテロウイルスとして分類されるA型肝炎ウイルス
(HAV)は、細胞培養中で分離するのが困難であり、初
期のインビトロ継代において増殖貧困であり、また一般
に細胞変性性でない。このウイルスのゲノムがクローニ
ングされ配列決定され、ただ一つの血清型が同定され
た。HAV感染は決して慢性化しないものの、これは重大
な人間の罹患率及び生産性の損失の原因となる。
る将来的必要性が存する。受動免疫による予防は有効で
あるが一次的な効果があるだけであり、能動免疫がこの
感染の制御に対するより実際的な試みであろう。
的な、不活性化及び生きた弱毒化ワクチンが、細胞培養
中で複製されたHAVから製造された。組み替えDNA技術を
適用して、A型肝炎ワクチンの開発のための別な方法が
開発された。これらの方法は、インビトロにおけるウイ
ルス抗原の発現、ウイルス抗原のインビボでの発現のた
めの生きたウイルスベクターの使用、及び、該ウイルス
の遺伝子産物を表わす合成ペプチドの産生を含む[ブリ
トゥン・オブ・ザ・WHO(Bulletin of the WHO)、
第66巻(4)(1988)、443頁]。
でなく配座性のものであるらしいことから、これら新技
術に基づくA型肝炎ワクチンが入手できるまでにはさら
なる研究が必要とされるであろう。常套的なホルムアル
デヒド不活性化HAVワクチン開発の実行可能性が証明さ
れ、この後、急性感染したマーモセットS.ラビアトゥス
の肝臓から部分精製されたHAV株CR326のインビトロでの
増殖に成功した[P.J.プロビスト及びM.R.ヒルマン、プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ソサイアティ・フォア・
エクスペリメンタル・バイオロジー・アンド・メディス
ン(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)第159巻(1978)201
頁]。複数の用量の水性ワクチンが、マーモセットS.ラ
ビアトゥスに投与された。この方法により免疫された動
物は全て抗体を産生し、そして全てがチャレンジ感染に
対し免疫性であった。続いて、高度に精製されたホルム
アルデヒド不活性化HAVワクチンが、形質転換されたア
カゲザル腎臓セルラインLLC−MK2細胞培養中で増殖させ
た同じ株から製造された。しかしながらこのワクチンは
現在人間のワクチン開発には使用できない[P.J.プロビ
スト等、ジャーナル・オブ・メディカル・バイロロジー
(L.Med.Virol.)第19巻(1986)23頁]。その他の原型
のホルムアルデヒド不活性化HAVワクチンが、他の形質
転換セルラインで、または一次動物細胞培養での継代に
よって製造された:メルク・アンド・Co.、Inc.(P.J.
プロボスト、M.R.ヒルマン及びJ.ヒューズ)、米国特許
79−71648号、US80−171621及びUS83−541836号、ユー
・エス・デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒュ
ーマン・サービシズ(ロバートソン)、US88−211973
号、R.シーリング等、EP84−105066号、ベーリングベル
ケAG(ローレンツ)、EP7461、U.S.A.(デーマー等)US
84−652067A号。
ような欠点を有する: (1)アレルギーまたは腫瘍形成反応を誘発し得る成長
基質からの遺伝学的物質及び外来抗原が、そのワクチン
に含まれ得る; (2)動物細胞培養での継代に由来する未知の物質が、
そのワクチンに含まれ得る; (3)そのワクチンに含まれる抗生物質が、感作された
個体にアレルギー反応を誘発し得る; (4)このようなHAVワクチンの安全性及び免疫原性
は、人間において充分立証されている訳ではない。不活
性化A型肝炎ワクチン開発における重要な進歩は、前も
って動物中で継代せずにHAVをヒトの線維芽細胞培養中
で増殖させたことであった[B.フレーミッグ、EP82−10
8268号]。このHAVは急性A型肝炎の患者の糞便から分
離され、一次ヒト腎臓細胞で増殖させた。ヒト二倍体線
維芽細胞中でさらに継代すると、不活性化A型肝炎ワク
チンの産生のためのHAV抗原が生成した。このような手
法によって作製されたワクチンにおいてもやはり以下の
ような欠点がある: (I)糞便からHAVを分離し、そして分離物を化学的
な前処理を施すことなく一次ヒト細胞中で培養してもな
お、未知の外来物質による汚染の危険の可能性がある、 (II)ヒト線維芽細胞培養におけるHAVの連続的継代
は、大量の欠損干渉粒子(DI)を産生し[カレイン及び
L.ルー、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Virolog
y)第62巻/8(1988)、2859頁]、これが係るワクチン
の免疫能を低下させる、 (III)上記DIはHAVの高力価の収穫を抑制し、故にこ
のような手法で作製されるワクチンは極めて高価なもの
となる、 (IV)述べられたHAV抗原は、H2O中1:2000の最終希釈
でホルムアルデヒド溶液により37℃で12日間不活性化す
る。この方法はHAV抗原を変性させ、その結果該ワクチ
ンの防御能が失われ得る、そして、 (V)この手法により産生された抗原は、世界の全大
陸からのA型肝炎被験分離物の全てに対しては防御抗体
価を示さなかった。
抗体価を顕在化させ得、且つ優れた免疫学的性質を有す
る、最適な耐用性のあるA型肝炎ワクチンを提供するこ
とである。
付けられる態様を提供することによって達成される。特
に、これは、ブタペスト条約の要求の下に1991年4月11
日、寄託番号I−1080の下でザ・インスティテュート・
パストゥア、パリのコレクション・ナショナーレ・ドゥ
・カルトゥア・ドゥ・ミクロオーガニスム(CNCM)に寄
託されたHAV株RG−SB XA112(CNCM I−1080)の免疫
学的特性を示す血清型を有するHAVを提供することによ
り達成される。
XA112(CNCM I−1080)に関するものである。
に対する広範囲の防御を誘導する。これは、該新規HAV
株により誘導される免疫応答が、現在知られている他の
HAV血清サブタイプの殆どをも認識する抗体によって媒
介されているためである。
れたウイルスを、異なった物理的精製法によって精製
し、この患者に由来する全ての可能な外来物質を除去す
るためpH1の酸溶液で処理した; 第二:該ウイルスは、ワクチン産生のため、一次動物
またはヒト細胞で継代せず、管理セルバンク(管理セル
バンクとは、その細胞を、外来性の汚染または異常の不
在について綿密に試験したバンクである)のヒト二倍体
細胞上で直接継代し、それによりこの細胞によるさらな
る汚染を減じた。この文脈において、「一次動物または
ヒト細胞」という語は、動物または人間から新たに分離
した細胞を意味する。これらはその性質において一様で
はなく、これらの細胞の継代は不可能である。故に、異
常または汚染の検出のための綿密な試験操作はこれらの
細胞については実施できない; 第三:ヒト二倍体細胞上での該ウイルスの継代を、DI
の出現が回避されるような手法で実施した;そして、 第四:該ウイルス抗原を化学物質で注意深く処理し
て、蛋白の変性を回避した、という点で先行技術とは異
なっている。
に関するものである。好ましくはこれらの構造的構成因
子はウイルスmRNA、コア蛋白、またはVP(ウイルス蛋
白)1、VP2、VP3またはVP4蛋白である。さらに本発明
は、該構造的構成因子の生物学的に活性なもしくは機能
的な部分または誘導体に関するものである。係る構造的
構成因子の生物学的に活性な部分とは、例えば、抗HAV
抗体の生成を誘導し活性ウイルスを中和するVP1の一部
である。
的構成因子は、本発明のHAV株RG−SB XA112(CNCM I
−1080)の免疫学的特性の惹起に関与している。
し; (b)この懸濁液を遠心し; (c)上清を超遠心し; (d)ウイルス含有画分を分離しこれを透析し; (e)管理セルバンクからのヒト二倍体細胞を(d)の
ウイルス調製物に感染させ; (f)感染した細胞を培養し; (g)工程(f)の細胞を継代しHAV活性の継代を検定
し; (h)工程(g)のHAV陽性継代物のウイルス含有細胞
抽出物を分離し;そして、 (i)さらに継代し、引続き端点希釈(好ましくは各々
三回目の継代後に)によりHAV株のクローニングを行な
う、 [ここで、該ウイルス含有懸濁液または画分は、該ヒト
二倍体細胞に感染させる前に、2より低いpH、好ましく
はpH1を有する酸で処理する]からなるHAVウイルスの分
離方法に関するものである。
示すことが知られている。他のウイルスは全てこの低い
pHにおいて不活性化される。他のエンテロウイルスと比
較してHAVはこの低いpHにおいて極めて高い安定性を表
す。本発明者等は、全てのヒトエンテロウイルスのうち
HAVだけが、pH1で37℃で5時間インキュベーションした
後になお感染性のあることを示すことができた。使用さ
れたこの方法により、他のヒト外来性感染性物質による
分離物の汚染が除外できるという結論が得られる。
の培養及び継代は37℃で実施し、工程(i)のさらなる
継代及びクローニングは32℃で実施する。ヒト二倍体細
胞における32℃への「冷順応工程」は、37℃で順応させ
たウイルスよりヒトにおける病原性がはるかに少ない弱
毒化HAVを導く。
低下させたHAVを意味する。
ルス増殖のための宿主細胞は、ヒト二倍体有限寿命細
胞、好ましくはMRC−5(寄託番号ATCC CCL171の下で
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATC
C)から入手可能)、MRC−9(ATCC CCL 212)または
ウィスター38細胞である。「ヒト二倍体有限寿命細胞」
とは、死滅するまでに培養中で約60細胞サイクルを経る
細胞を意味する。これらの細胞を使用する利点は、基質
としてのこれらの安全性にある。使用される有限寿命細
胞は、レトロウイルスを含む付随的微生物物質、染色体
異常または発癌性の不在に関して綿密な管理の下にあ
る。さらに、均一の集団倍化(PD)レベルを持ち且つセ
ルバンク(寄託所)から調製された細胞は、異なった個
体由来の一次細胞よりも再現性の高い結果を与えること
が明らかである。
の非病原性免疫原性誘導体、本発明に係るHAV株RG−SB
XA112(CNCM I−1080)、及び/または本発明に係
る任意のHAVの免疫原性構造的構成因子、並びに所望に
より薬学上許容し得る担体、アジュバント及び/または
希釈剤を含有するHAVワクチンに関するものである。
ユニットキャプシド蛋白VP1、VP2、VP3及びVP4の一つま
たはその組合せを、ワクチンの製造に使用することがで
きる。ウイルス全体またはサブユニットの構成員は、水
酸化アルミニウム、燐酸アルミニウム、他のウイルス、
リポソーム、ウイロソームまたはイムノソームのような
既知の担体物質に吸着させて免疫原性を高めることがで
きる。
AVの該誘導体は、化学的に弱毒化したHAVまたはさらに
化学的に弱毒化される非病原性HAV株である。
性化されたウイルスに加えて正確に測定された量の活性
ウイルスを含有するワクチンを意味する。したがってこ
れは、「フェルミ」型狂犬病ワクチンについて記載され
た[P.レピン:ラボラトリー・テクニークス・イン・レ
イビーズ(Laboratory Techniques in Rabies)(WH
O)、第3版、1973、199頁]ような、弱毒化型及び不活
性化型ワクチンの混合物である。このようなワクチン
は、ホルムアルデヒド濃度を限定(例えば1:4000)並び
に不活性化の時間及び温度を限定(例えば4℃で4日
間)することによって生成させることができる。係るワ
クチンの利点は、高い免疫原性にある:不活性化された
粒子は人間への投与後直ちにヒト免疫系を刺激するが、
一方、弱毒化された冷順応の生きたHAVは、免疫応答を
顕在化させる前の体内における複製に幾らかの時間を必
要とする。免疫細胞は大量の不活性化されたウイルスに
よってのみ刺激され、小さな生きたウイルス断片によっ
てはこれが複製されるまでは刺激されないため、この生
きたウイルス断片は、その標的細胞に感染し、複製を受
け、そして複製後は有効用量のブースターとして働く。
においては、これに含まれるHAV株の少なくとも一つがH
AV株RG−SB XA112(CNCM I−1080)である。
れるウイルスがホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラ
クトン(BPL)処理により化学的に弱毒化されている。
この化学的弱毒化の原理は、インフルエンザウイルス、
呼吸器のシンシチウムウイルス、またはロタウイルスを
含むもののような他のウイルスワクチンの製造にも使用
することができる。
ずに感染性であり続けることができなくなるというふう
に、キャプシド蛋白に化学的影響を及ぼすことが知られ
ている。ホルムアルデヒドの代わりにβ−プロピオノラ
クトン(BPL)もまた不活性化剤として使用できる。
HAVもしくはその構造的構成因子に対するモノクローナ
ルまたはポリクローナル抗体に関するものである。本発
明に係るこれらの抗体は、先行文献に知られる他のいか
なるHAV血清サブタイプとも交叉反応性を示さない。し
たがって、本発明に係る新規なHAVの供給は、このよう
な特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産
生を初めて可能にするものである。
Vまたはその構造的構成因子に対するものであって、先
行文献に知られる他の殆どのHAV血清サブタイプと交叉
反応性を示す。したがって、本発明に係る新規なHAVの
供給は、殆どのヒトHAV血清サブタイプを認識する、広
スペクトルを有するモノクローナルまたはポリクローナ
ル抗体の産生を初めて可能にするものである。
物(例えばヒツジ)を、不活性化した、部分的に不活性
化したもしくは生きた本発明のHAV、例えばRG−SB XA1
12(CNCM I−1080)株またはその構造的構成因子に感
染させ、摂取した血清を既知の技術により精製すること
によって製造することができる。モノクローナル抗体
は、ボランティアの人間を、本発明に係る不活性化し
た、化学的に弱毒化した、もしくは生きたHAV、例えばR
G−SB XA112株(CNCM I−1080)、またはその構造的
構成因子を含有するA型肝炎ワクチンで免疫することに
よって生成させることができる。成功した免疫の二週間
後、刺激されたリンパ球を血液から分離し、ヒト骨髄腫
セルラインの細胞と融合させる。このようにして得られ
た所望のモノクローナル抗体を合成するハイブリドーマ
は、融合細胞を含む細胞培地を該所望モノクローナル抗
体の存在について試験することにより選択することがで
きる。
性誘導体、HAV株RG−SB XA112(CNCM I−1080)もし
くはその非病原性誘導体、本発明に係る任意のHAVの構
造的構成因子、または上に開示される抗体を含有する診
断用組成物に関するものである。
HAV抗体を検出するために使用することができる。抗体
は、例えば放射免疫検定のための複合体の製造に使用す
ることができる。
サッカロースのシュクロースクッションにより超遠心す
ることにより上清中のウイルスをペレット化することに
よって野生型HAVをA型肝炎感染の急性相にある患者の
糞便から取得し、そして1.1及び1.5g/mlの間の密度を有
するCsCl2勾配を用いる密度勾配遠心によってさらに精
製した。HAV含有画分を、改良固相RIA技術により同定し
た。この改良は、抗体の代わりに抗原を測定することを
意味する。この測定は、いわゆる競合試験を実施するこ
とにより達成できる:一定量の抗HAV抗体をHAV抗原と混
合する。次いで測定された非結合抗体の量は、結合した
抗HAV抗体部分を中和したHAV抗原の量の尺度となる。
て2回透析した。溶液のpHはHCl(1m)でpH1に調節し
た。室温で5時間後にpHをNaOH(10%)でpH7に調節し
た。
ブコ)及び107MCR−5細胞を含有する懸濁液10mlと混合
することにより、精製された野生型ウイルスをMCR−5
(ATCC CCL 171)に順応させた。この順応の工程は、
ウイルスの該MRC−5細胞中での複製を可能にする。こ
の懸濁液を室温に維持し、10分毎に穏やかに攪拌した。
1時間後、懸濁液を、150cm2の表面を有するコーニング
組織フラスコに移し、10%FBSを加えたBME70mlを添加し
た。続いて組織フラスコ中の気相にCO2を最終濃度5%
まで加え、37℃でインキュベートした。HAVに感染したM
RC−5細胞を1:2の比率で毎週分割した。これらの細胞
の半分を順応工程に使用し、他の細胞をHAV抗原の試験
に使用した。10回のブラインド継代(即ち、HAVを検出
せずに継代)の後、HAV抗原が改良RIAを使用して初めて
検出できた。この目的のために、細胞に付随したウイル
スを、コーニングフラスコの内容物を3回凍結−融解し
次いで超音波処理することによって抽出した。低速の遠
心により細胞の破片を除去した。
HAVを使用した。細胞を凍結−融解により破壊した後に
ウイルスを分離した。
殖させた融合性のMRC−5細胞培養をBME培地で2回洗浄
し、順応させたHAVを含むウイルス接種物1.0mlを接種し
た。32℃における4時間のウイルス吸着の後、10%FBS
を含有するBME培地を加えた。この培養を32℃でインキ
ュベートし、その後7日間の間隔で培地を交換した。各
継代の後にウイルスを抽出し、新しい新鮮な融合性組織
培養を通過させた。2回目の継代を4週間、3回目を3
週間、そして4回目を2週間続けた。各継代の後に、凍
結−融解によってウイルスを細胞の溶菌液から抽出し
た。4回目の継代後に、端点希釈10-5ないし10-9とする
5回目の継代のための幾つかの接種物を調製した。次い
でウイルスが検出できる最大希釈の培養由来のウイルス
をさらなる継代に使用した。継代は、ウイルス吸着細胞
を32℃で2週間インキュベートし(培地は1週間後に変
えた)、そして2回の継代後毎には端点希釈継代を行な
うことにより実施した。この手法を反復し、23回目の継
代で、A型肝炎ワクチンのための順応した弱毒化された
産生種菌ウイルス(即ち、この継代からのウイルスがワ
クチンの製造に使用された)が得られた。
コペンハーゲン、デンマーク)で増殖させた。稠密な細
胞層を、感染の多重度が約0.1の産生種菌由来のHAV株RG
−SB XA112(CNCM I−1080)に感染させた。ウイル
スは32℃で4時間吸着させた。次いで10%FBSを含有す
る新鮮なBME培地を感染細胞に加え、この後細胞生産工
場を32℃でインキュベートした。1週間インキュベート
した後、培地を新鮮な培地に交換した。もう1週間イン
キュベートした後、HAVを細胞培養から抽出した。ほう
酸塩100mM及びNa−EDTA5mMを含み10%NaOHでpH8に調節
した抽出溶液を培養に加えた。引続き、NUNC細胞生産工
場を−30℃の急速冷凍室に移動させた。細胞を完全に凍
結させた後、細胞生産工場を懸濁液が融解するまで37℃
のインキュベーション室に移した。この操作を2回反復
した。次にこの懸濁液をポンプで遠心瓶に入れ、超音波
処理した(ブランソニック、ブランソン・ユアロップ・
BV、振動数50kHz±10%)。10秒間の超音波衝撃を、各
々10秒間の間隔の後に2回繰り返して最良の結果を得
た。
した。ペレットを半分の容量の抽出溶液に再懸濁し、再
度凍結−融解し、その後超音波処理及び遠心した。この
操作を1回繰り返し、全ての上清を最終的にプールし
た。次いでこの上清を濾過により透明にし、孔径0.2μ
mのメンブレンフィルター(ミリポア)で無菌濾過し
た。
和されるまで−30℃で保存した。
が、以下の成分を含んでいる: 弱毒化HAVウイルス、RG−SB XA112株 (CNCM I−1080) 107.3TCID50/ml NaCl 3.4mg/ml ポリゲリンまたはフィジオゲル(ハウサマン)16.0mg/m
l フェノールレッド(シグマ) 20μg/ml シュクロース 340μg/ml 実施例5 不活性化A型肝炎ワクチンの製造 HAVウイルスRG−SB XA112株(CNCM I−1080)を実
施例4に従って製造した。濾過した上清を、さらに以下
のごとく精製した: −限外濾過(ミニタン、ミリポア)により濃縮; −30%シュクロースクッション溶液による超遠心(24時
間、100000xg)により精製; −Na−EDTA5mM、ほう酸塩100mM(pH8)にペレットを再
懸濁; −密度が1.1及び1.5g/mlの間のCsCl2勾配による100000x
gの超遠心によりさらに精製; −HAVを含有する画分(d<1.35−d>1.23)をプー
ル; −画分を透析管(スペクトラ、ポア、分子のカットオフ
が12000−14000)に移し、0.9%NaClに対して4℃で3x1
2時間透析; −HAV懸濁液をホルムアルデヒド(H2O中1:2000の希釈)
により37゜で3.5日間及び室温で6日間不活性化; −透析または超遠心によりホルムアルデヒドを除去(上
記参照); −不活性化したHAV懸濁液を0.9%NaCl溶液で抗原濃度10
00ng/mlに希釈; −等量のHAV懸濁液及びアジュバント溶液(Al(OH)3
の場合0.8%の保存溶液を使用した)を混合することに
より、抗原をアジュバント(例えばAl(OH)3またはリ
ポソーム)に吸着させる; −0.5mlの等分試料をワクチンバイアルに充填する。
学的に弱毒化)の製造 このワクチンは、実施例5に従い以下の修飾を施して
製造した: 完全に不活性化する代わりに、精製されたHAV懸濁液
をホルムアルデヒド溶液(H2O中1:2000の希釈)による
処理によって化学的に弱毒化した。この懸濁液を4℃で
4日間攪拌した。ウイルスを超遠心(100000xg、1時
間)により2回ペレット化することにより、ホルマリン
を除去した。HAVを0.9%NaCl溶液に再懸濁し、次いでワ
クチンの容量当り100ngの抗原濃度に希釈した。
有するワクチンによる人間のボランティアのワクチン接
種 実施例4、5及び6に従って三つのA型肝炎ワクチン
を製造した。全てのワクチンは、ヒト二倍体細胞におい
て産生された不活性化及び生きた弱毒化ワクチンのため
の国際管理当局の標準に適合する。
うに製造されたワクチン(ワクチンA)の105組織培養
感染用量50%(TCID50)により経口的に免疫した。TDID
50においては、ウイルスの保存溶液が105の係数によっ
て希釈された場合、培養中の全細胞の50%が感染する。
うな不活性化されたHAV抗原250ngを含有する不活性化A
型肝炎ワクチン(ワクチンB)で非経口的に免疫した。
従って製造された105TCID50のHAV及び不活性化HAV抗原1
00ngを含有する化学的に弱毒化したA型肝炎ワクチン
(ワクチンC)によって非経口的に免疫した。
従って投与した:0日目に2回のワクチン接種、そして7
日目にブースター用量を接種した。全ボランティアの抗
体力価を、ワクチンAについては28日目に、ワクチンB
及びCについては21日目に監視した。抗HAV抗体は市販
のRIAキット(アボット)で測定した。結果を第1表に
表す。
含む全てのHAV調製物が高度に免疫原性であることを示
している。全てのワクチンは、接種後に有意な血清変換
を示した。
た:接種後の全身性反応は報告されず、僅かな局所反応
が報告されたに過ぎなかった。どの群においても肝臓の
酵素の値の上昇は検出されなかった。
種したボランティアからの血清による、異なったHAV株
の中和 地理的に広く異なった地域から回収された8つのHAV
株を使用する中和試験を、HAV株RG−SB XA112(CNCM
I−1080)によるワクチン接種後の人間のボランティア
から得られた血清試料について実施した。各ボランティ
アからの血清は、カンザス(LV−374)、アラスカ(FrA
L)、ドイツ(Gr8)、パナマ(PA21)、北アフリカ(MB
B)、オーストラリア(HM−175)、スイス(CLF)及び
シャンハイ(シャンハイ)由来のHAVを中和した。これ
らの結果は、該ワクチンが世界の異なった地域由来のHA
Vを防御するであろうことを示している。
するポリクローナル抗体の製造 HAV抗原の測定または抗HAV抗体の測定のための診断的
手段として使用するための強力なポリクローナル血清を
得るために、spfヒツジの成体を、実施例5に従って製
造したワクチンによって、0、7、14及び44日目に免疫
した。0日目に4つの用量を各々のヒツジの異なった場
所(腿)にi.m.で投与した。7、14及び44日目に、二つ
の用量をi.m.で両後肢に注射した。58日目に350mlの血
液を各ヒツジから採取した。血清画分を分離し、既知の
技術に従ってさらに精製した[E.J.コーン等、ジャーナ
ル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティ(J.Am
er.Chem.Soc.)第69巻(1946)459頁]。
するヒトモノクローナル抗体(HMAB)の製造 成人のボランティアが、実施例4に従って製造したワ
クチンの2回の筋肉内注射を、三角筋部分に、0日目及
び7日目(ブースター用量)に受けた。ヒトの末梢血リ
ンパ球(PBL)を28日目にドナーから取得した。単核細
胞をフィコール−ハイパーグ密度勾配(ファルマシア、
ウプサラ、スウェーデン)上で分離し、プラスチックに
付着させることにより単核球を涸渇させた。次いで非付
着細胞を以下のように抗原特異的パニング検定において
試験した:細胞を遠心し、1%BSAを含有する冷PBS(pH
7.4)に再懸濁した。予めHAV抗原で被覆した、ウェルが
6個の平板(コスター、バドヒーブドルフ、オランダ)
の各ウェルにリンパ球(1%BSAを含有するPBS中107/m
l;PBS/BSA溶液)を加えた。プラスチック表面上に残っ
ている非特異的結合サイトをブロックするため、ウェル
はPBS/BSA溶液で少なくとも1時間4℃でインキュベー
トしておいた。70分間のインキュベートの後、非付着細
胞を吸引した。10%牛胎児血清(FCS)を含むIMDM細胞
培養基(シグマ・ケミカル・Co.、セントルイス、MO)
及び同容量のエプスタイン−バーウイルス(B 95−8
マーモセットセルラインの培養由来の上清を含むEBV)
を、この付着細胞に加えた。この細胞を37℃で3時間培
養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、10%FC
S、リンパ芽球様セルラインJW5由来の条件培地30%、2
−メルカプトエタノール5x10-5M、硫酸ゲンタマイシン
(シグマ)50μg/ml、及びシクロスポリンA(サンディ
マン、サンド、バーゼル、スイス)600ng/mlを含むIMDM
を入れた96ウェルの微量定量プレートに104ないし105細
胞/ウェルの密度で分配した。14ないし21日間のインキ
ュベーションの後、培養上清をELISAによってHAV株RG−
SB XA112(CNCM I−1080)に対する抗体の結合につ
いてスクリーニングした。陽性のウェルからの細胞培養
を拡大し、ELISAにより再試験し、低密度で継代培養
し、イムノブロッティング及び免疫蛍光法によってさら
に試験した。さらに拡大した後、この細胞を、平板融合
技術[J.W.ラリック、ヒューマン・ハイブリドーマズ・
アンド・モノクローナル・アンティボディーズ(Human
Hybridomas and Monoclonal Antibodies)、プレ
ナム・プレス、ニューヨーク、1985、446頁]によって
6−チオグアニン/ウワバイン耐性F3B6(NS1xヒトB細
胞のハイブリッド)へテロ骨髄腫セルラインと融合させ
た。ハイブリッドは、ヒポカンチン100μM、アゼセリ
ン5μg/ml及びウワバイン5μMを含有するIMDM中で選
択し、供給細胞層の無い微量定量プレート中で培養し
た。HAV RG−SB XA112(CNCM I−1080)を特異的に
結合させる抗体(中和試験)を含む上清と共にハイブリ
ドーマを限定希釈によってクローニングし、該細胞によ
り分泌されるHMAbを収穫した。
Claims (14)
- 【請求項1】HAV株RG−SB XA112(CNCM I−1080)の
変異株であって、かつ、HAV株RG−SB XA112(CNCM I
−1080)と同一の免疫学的特性を示す血清サブタイプを
有するA型肝炎ウイルス(HAV)。 - 【請求項2】A型肝炎ウイルス株RG−SB XA112(CNCM
I−1080)。 - 【請求項3】請求項1または2に記載のHAV血清サブタ
イプまたは株の構造的構成因子。 - 【請求項4】ウイルスmRNA、コア蛋白、もしくはVP1、V
P2、VP3、もしくはVP4蛋白、またはそれらの生物学的に
活性なもしくは機能的な部分もしくは誘導体である、請
求項3に記載の構造的構成因子。 - 【請求項5】該HAV血清サブタイプまたは株の免疫学的
特性の惹起に関与している請求項3または4に記載の構
造的構成因子。 - 【請求項6】請求項1に記載のHAV非病原性免疫原生誘
導体、請求項2のHAV株、及び/または請求項3ないし
5のいずれか一項に記載のその免疫原生構造的構成因
子、並びに所望により薬学上許容し得る担体、アジュバ
ント、及び/または希釈剤を含有するHAVワクチン。 - 【請求項7】該HAVの該誘導体が化学的に弱毒化されたH
AVである、請求項6に記載のHAVワクチン。 - 【請求項8】該HAV株がさらに化学的に弱毒化されてい
る、請求項6に記載のHAVワクチン。 - 【請求項9】該化学的弱毒化がホルムアルデヒドまたは
β−プロピオラクトン(BPL)処理に起因する、請求項
7及び8のいずれか一項に記載のワクチン。 - 【請求項10】該HAV株の該誘導体が不活性化されてい
る、請求項6に記載のワクチン。 - 【請求項11】該HAV株が不活性化されている、請求項
6に記載のワクチン。 - 【請求項12】該抗体が他の殆どのHAV血清サブタイプ
との交叉反応性を示す、請求項1もしくは2のHAVに対
する、または請求項3ないし5のいずれか一項に記載の
構造的HAV構成因子に対する、ポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体。 - 【請求項13】特異的に請求項1もしくは2のHAVに対
する、または請求項3ないし5のいずれか一項に記載の
構造的HAV構成因子に対する、ポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体。 - 【請求項14】請求項1に記載のHAVもしくはその誘導
体、請求項2に記載のHAVもしくはその誘導体、請求項
3ないし5のいずれか一項に記載の構造的HAV構成因子
または請求項12もしくは13に記載の抗体を含む診断用組
成物。
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